玉米 ZmRop1 蛋白的新用途 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域中玉米 ZmRop1 蛋白的新用途。背景技术 玉米矮花叶病 (maize dwarf mosaic disease， MDMD) 可由一至多种病毒系统性侵 染引起， 在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病 毒有 6 种， 它们均属于马铃薯 Y 病毒属 (Potyvirus)， 它们分别是甘蔗花叶病毒 (Sugar cane mosaic virus， SCMV)、 玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus， MDMV)、 高粱花叶病毒 (Sorghum mosaic virus， SrMV)、 约翰逊草花叶病毒 (Johnsongrass mosaic virus， JGMV)、 玉米属花叶病毒 (Zea mosaic virus， ZeMV) 和白草花叶病毒 (Pennisetum mosaic virus， PenMV)。甘蔗花叶病毒北京分离物 (SCMV-BJ) 是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的 优势株系 (Fan ZF， Chen HY， Liang XM， Li HF， 2003.Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China.Archives of Virology 148， 773-82)。
作为一种细胞内专性寄生物的植物病毒， 在侵染过程中， 其生活史的完成必须依 赖寄主因子参与病毒脱壳、 基因组复制、 病毒颗粒组装和病毒运动过程。 而这种依赖性就需 要寄主因子在病毒侵染时改变原有的正常的功能和状态。 这些复杂的改变一方面体现在植 物发生了一系列生理和组织上的变化， 从分子、 化学和物理水平上来抵抗病毒的侵染， 另一 方面表现在病毒通过多种策略适应或改变寄主细胞从而增强侵染复制复合体的形成、 抑制 转录后基因沉默， 促进细胞间的移动、 干扰植物细胞周期等， 同时导致寄主植物形成各种症 状， 包括花叶、 褪色、 矮化、 发育缺陷或死亡等 (Whitham SA， Yang C Goodin MM 2006.Global impact ： elucidating plant responses to viral infection.Molecular Plant-Microbe Interactions 19， 1207-15)。
在 抗 性 寄 主 中， 病 毒 的 侵 染 会 激 发 抗 性 寄 主 的 免 疫 反 应， 病毒的无毒基因 (Avrgene) 和寄主的抗病基因 (R gene) 相互识别可激发寄主的一些抗病防卫反应。在感 病寄主中， 植物基因表达的变化可能是由两种原因造成 ： 一是病毒侵染过程要求的寄主因 子参与 ； 二是由于寄主本身的抗病反应或由于病毒侵染干扰了植物 miRNA 的功能， 进而引 起植物典型的表型变化即症状的产生 (Yang Z， Fu Y， 2007.ROP/RAC GTPasesignaling. Current Opinion in Plant Biology 10， 490-4)。
鉴 定 SCMV 侵染后玉 米中差 异表达的基 因， 有 助于 探索 防治 玉米 矮花 叶病 的 新途径。近年来， 科学家已经做了大量工作来鉴定 SCMV 侵染后玉米中差异表达的基 因 (Uzarowska A， Dionisio G， Sarholz， B et al.， 2009.Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays L.)byexpression profiling.BMC Plant Biology 9， 15doi ： 10.1186/1471-2229-9-15)， 然而， SCMV 和玉米之间的分子互作机理尚不清晰。
Rop 作为植物重要的调控因子， 参与调控植物多种信号途径， 如调控花粉管的
生长、 调控肌动蛋白细胞骨架和细胞极性生长 (Yang Z， 2002.Small GTPase ： versatile signaling switches in plants.Plant Cell Supplement 14， S375-88)、 参与植物非生物 胁迫 (Nibau C， Wu H， Cheung A， 2006.RAC/ROP GTPase ： ‘hubs’ for signal integration and diversification in plants.Trends in Plant Science 11(6)， 1360-85)， Rops 还 参与一些植物激素如脱落酸 (Zheng ZL， Nafisi M， Tam A， Li H.et al.， 2002.Plasma membrane-associated ROP 10small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis.Plant Cell 14， 2787-97) 和生长素信号途 径， Rops 也参与泛素 /26S 蛋白体介导的蛋白水解 (Tao L， Cheung AY， Nibau C Wu HM， 2005.RAC GTPases in tobacco and Arabidopsis mediate Auxin-induced formation of proteolytically active nuclear protein bodies that containAUX/IAAproteins. Plant Cell 17， 2369-83)。在玉米中， 共有 9 个 Rop 成员， ZmRop1 ～ 9 ； ZmRop1(ZmRacA)， ZmRop2(ZmRacB)， ZmRop3(ZmRacC) 和 ZmRop4(ZmRacD) 在哺乳动物细胞中表达能够诱导过 氧化物的产生 (Hassanain HH， Sharma YK， Moldovan L et al.， 2000.Plant Rac proteins induce superoxide production in mammalian cells.Biochemical and Biophysical Research.Communications 272 ： 783-8) ； 而 ZmRop2 在玉米雄性配子体 ( 花粉粒 ) 中发挥重 要功能 (Agrawal GK， Iwahashi H， Rakwal R， 2003.Small GTPase ‘Rop’ ： molecular switch for plant defense responses.FEBSLetters 546， 173-80)， 然而在大多数情况下， ZmRop 成员的参与调控玉米正常生长发育和玉米对生物、 非生物逆境胁迫响应知之甚少。 发明内容 本发明的一个目的是提供序列表中序列 1 所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制 的产品中的应用。
本发明提供了序列表中序列 1 所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的 应用。
本发明的另一个目的是提供序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在制备抑制 植物病毒复制的产品中的应用。
本发明提供了序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制 的产品中的应用 ； 所述蛋白的编码基因为如下 1)-3) 中任一所述的基因 ：
1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 所示的 DNA 分子杂交且编码所述蛋白的基因 ；
3) 与 1) 或 2) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有序列表中序列 1 所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒 复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在 pGFP 载体的多克隆位点插入序列表中序列 1 所示蛋白的 编码基因得到的重组表达载体。
所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复 制；
所述植物细胞为植物细胞中的原生质体 ；
所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒 ；
所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。 序列表中序列 1 所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。 序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用也属于本 发明的保护范围。
所述蛋白的编码基因为如下 1)-3) 中任一所述的基因 ：
1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 所示的 DNA 分子杂交且编码所述蛋白的基因 ；
3) 与 1) 或 2) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有序列表中序列 1 所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害 中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在 pGFP 载体的多克隆位点插入序列表中序列 1 所示蛋白的 编码基因得到的重组表达载体。
所述植物病毒病害为玉米矮花叶病 ；
所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的 ；
所述植物为玉米。
本发明通过 (1) 在玉米原生质体中共转化能表达 ZmRop1 的质粒与 SCMV RNA， 发现 过量表达 ZmRop1， SCMV 病毒复制水平降低约 392.6％， 即过量表达 ZmRop1 可有效抑制 SCMV 的复制 ； (2) 在玉米叶片中瞬时沉默 ZmRop1 后接种 SCMV， ZmRop1 瞬时沉默的植株上， SCMV 建立系统侵染的时间缩短 ( 提前 3d)， 病毒累积增加 ( 表现在 SCMV mRNA 水平增加约 274 ～ 395％ )， 产生的系统花叶症状更为严重， 瞬时沉默 ZmRop1 促进了 SCMV 在玉米上的系统侵 染。 这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用， 同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
附图说明
图 1 为在玉米原生质体中过量表达 ZmRop1 对 SCMV 复制的影响。 图 2 为瞬时沉默 ZmRop1 的玉米植株表型及其 ZmRop1 的 mRNA 水平。 图 3 为瞬时沉默 ZmRop1 对 SCMV 系统侵染玉米植株的影响。具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 过量表达 ZmRop1 抑制甘蔗花叶病毒 (SCMV) 的复制
一、 构建 ZmRop1 瞬时表达载体
按照分子克隆常规方法， 构建 ZmRop1 瞬时表达载体 pGFP-Rop1。具体方法如下 ： 从美国自交系 cv.Va35( 购自中国农业大学国家玉米改良中心 ) 叶片中提取总 RNA 为模板， 用上下游引物 Rop1F 和 Rop1R，
Rop1F ： 5′ -GTCGACATGGCGTCCAGCGCCTCTCGGTTCAT-3′， ( 下划线部分为 Sal I 酶 切位点 )，
Rop1R ： 5′ -GAGCTCTCAGGACTTGAAGCATAGCATTTTTCTTCCACCG-3′， ( 下划线部分为Sac I 酶切位点 )，
反转录 PCR 扩增得到 ZmRop1 蛋白的编码基因序列， 该编码基因的核苷酸序列如序 列表中序列 2 所示， 该序列所编码的 ZmRop1 蛋白的氨基酸序列如序列表中序列 1 所示。然 后利用 Sal I 和 Sac I 限制性内切酶酶切该编码基因序列， 回收酶切后的基因片段 ； 同时， 用 Sal I 和 Sac I 酶切载体 pGFP( 公众可从中国农业大学获得， 记载过该载体的非专利文 献是 ： Shi Y， Qin Y， Cao Y.et al.， 2011.Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection.European Journal of Plant Pathology 131， 317-26)， 回收载 体大片段， 将回收的载体大片段与回收的基因片段连接后， 获得重组质粒。 将重组质粒转入 大肠杆菌中， 抗性筛选， 挑取阳性克隆， 将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行 测序验证， 测序结果表明在 pGFP 载体的 Sal I 和 Sac I 酶切位点间插入了序列表中序列 2 所示的 ZmRop1 基因片段， 证明重组载体构建正确， 将该重组载体命名为 pGFP-Rop1。
二、 甘蔗花叶病毒 (SCMV)RNA 提取
1、 SCMV 病毒粗提纯
收集感染 SCMV 且系统花叶症状明显的玉米叶片 200g， 剪成小段， 在液氮中快速 研磨成粉状。在研磨后的粉状物中加入 400ml 提取缓冲液 I(0.5M 磷酸钾缓冲液， 使用前 加入 0.01M 的二乙基二硫代氨钾酸钠和 1％ β- 巯基乙醇， WV， pH7.2)， 搅拌均匀。用双层 尼龙网 ( 孔径 38μm) 过滤， 滤液加 20％ (WV)CCl4， 充分搅拌 20 ～ 30min。8,500rpm 离心 25min。往上清液中加入 0.25M 的 NaCl( 终浓度 )， 搅拌至完全溶解后， 再缓慢加入 6％ (g/ ml)PEG-6000(Fluka， 日本 )， 冰浴中搅拌至 PEG-6000 完全溶解， 于 4℃静置 2h。 8,500rpm 离 心 30min， 沉淀用含 1％ Tween-20(Roche， Germany) 的提取缓冲液 II(0.05M 磷酸钾缓冲液， pH7.2) 于 4℃悬浮过夜。 7,000rpm 离心 15min， 将上清液置于 20％的蔗糖垫上 ( 上清液与蔗 糖垫的体积比为 1 ∶ 2)， 38,000rpm 离心 90min。 每管沉淀用 1.0ml 提取缓冲液 III(0.005M 磷酸钾缓冲液， pH7.2) 充分悬浮， 4℃冰箱中过夜。7,000rpm 离心 10min 去沉淀， 上清液即 为粗提纯的 SCMV， 然后以 100μl 为单位分装， 于 -80℃冰箱中保存备用。
收集感染 SCMV 且系统花叶症状明显的玉米叶片的方法为 ： 将 SCMV 侵染的玉米汁 液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第三片叶上， 接种后将玉米植株放在人工气候室 中培养， 培养条件为 ： 23℃光照 16h 和 21℃黑暗 8h。接种 30 天后收集系统花叶症状明显的 玉米叶片。
SCMV 侵染的玉米汁液的制备方法如下 ：
从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为 SCMV 侵染后， 通过机械摩擦方式 接种到玉米 ( 综 31) 植株上， 保存在防虫温室中。 接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明 显的幼嫩叶片， 称取 0.1g 该幼嫩叶片， 加入 1ml 接种缓冲液， 充分研磨后转移到 Eppendorf 管中， 4℃， 5000g 离心 5min， 取上清， 即得到 SCMV 侵染的玉米汁液。
2、 从粗提纯病毒中提取 SCMV RNA
在 100μl 粗提纯 SCMV 中加入 160μl RNAse-free 的 ddH2O， 再加入 200μl RNA 抽 提缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 8.0 ； 200mM NaCl ； 5mM EDTA)， 然后加入 40μl 10％ SDS， 混 匀， 室温保持 5min。加入 2 倍体积 (800μl) 的 PCI( 苯酚∶氯仿∶异戊醇＝ 25 ∶ 24 ∶ 1)， 混匀， 12,000×g 离心 5min。吸取上层水相， 加入 2 倍体积的 PCI， 混匀， 12,000×g 离心 5min， 再重复抽提一次。 吸取上层水相， 确定其体积后， 加入 1/10(V/V)3M 的 NaAC(pH 5.2)，混匀 ； 加入 2.2 倍体积的无水乙醇， 混匀， -80℃沉淀 1h 或 -20℃沉淀过夜。12,000×g 离 心 20min， 用 1ml 70％乙醇洗涤沉淀， 室温干燥 ； 所得 RNA 溶于 30μl RNAse-free 的 ddH2O 中， -80℃保存备用。
三、 玉米原生质体的制备、 转化及观察
(1) 玉米原生质体的分离
选取籽粒饱满、 大小均一的玉米自交系综 31( 购自中国农业大学国家玉米改良中 心 ) 种子， 用氯气消毒并在超净工作台吹净氯气后置于 25℃的培养箱中发芽、 暗培养。 当玉 米黄化苗长到第 2 片叶高于第一片 10 ～ 15cm 时， 剪下第 2 片叶子中间的 6 ～ 8cm 的部分， 轻轻将 20 片剪下的叶片叠在一起， 用新开封的刀片切成约 0.5mm 的细丝， 在蒸馏烧瓶中按 照 1g 叶片加入 5ml 酶溶液 (1 ～ 1.5％纤维素酶 R10(Yakult Honsha， 日本 )、 0.2 ～ 0.4％ 离析酶 R10(Yakult Honsha)、 0.6M 甘露醇、 20mM KCl、 20mM MES， pH5.7) 的比例加入酶溶液， 然后消化、 避光， 抽真空 30min( 真空度 0.05MPa)， 使酶溶液充分渗透到叶片中。 然后在摇床 (40rpm) 上继续避光消化 2h。将上述经酶溶液消化的叶片滤过尼龙网 ( 孔径 38μm)， 转移 到圆底离心管中， 置于冰上， 获得分离的玉米原生质体。
(2) 玉米原生质体的活力测定 用尖端剪去的吸头取出 500μl 分离的原生质体， 转移到 2ml 离心管中， 加入等 体积的 0.02％荧光素乙酰乙酸盐 (FDA) 溶液 (0.1ml FDA 母液 (2mg FDA 溶于 1ml 丙酮 ) 溶于 10ml CPW 洗液中 (27.2mg/L KH2PO4， 101mg/L KNO3， 1480mg/L CaCl2·2H2O， 246mg/L MgSO4·7H2O， 0.16mg/L KI， 0.025mg/L CuSO4·SH2O， 10％ mannitol， pH5.7)， 静置 5min。取 适量样品置于载玻片上， 用镊子轻轻盖上盖片， 注意不要使其盖片滑动。在荧光显微镜下， 五点取样， 每个视野的原生质体总数不少于 50 个， 观察记录原生质体总数和发黄绿荧光的 原生质体总数， 发黄绿荧光原生质体为有活力的原生质体 ( 图 1 中 A， 玉米原生质体活力检 测； 分离出的玉米原生质体经 FDA 染色后在显微镜下观察黄绿色荧光， 物镜倍数 20×)。
(3) 玉米原始质体的转化及观察
将玉米原生质体用电击缓冲液 (0.6M mannitol， 4mM MES， pH5.7， 20mM KCl) 洗 2 次。150×g 离心 2min， 小心吸去上清液， 用电击缓冲液重悬原生质体， 用血球计数板计数使 6 重悬后的原生质体浓度达到 2×10 /ml， 将原生质体置冰上备用。在 2ml 圆底离心管中加 入 50μg 重组质粒 pGFP-Rop1 和 300μl 原生质体， 充分混匀， 再加入 10μg SCMVRNA， 用移 液器吸吐混匀， 电击 2 次 (5msec， 200μF， 400V)， 冰上放置 10min。150g 离心 2min， 吸去上 清液， 用 1ml 孵育缓冲液 (1000ml 中包括 30g 蔗糖， 4.3gMurashige-Skoog[MS] 盐， 2mg 甘氨 酸， 1mg 维生素 B1， 100mg 肌醇， 0.5mg 1- 萘乙酸， 0.5mg 6-BA， 0.2mg 2， 4- 二氯苯氧乙酸， 0.55M 甘露醇， pH 5.7) 重悬原生质体， 25℃黑暗孵育过夜。同时， 以转化质粒 pGFP 和 SCMV RNA 的原生质体作为对照。
转化后的原生质体， 通过激光扫描共聚焦显微镜观察 GFP 绿色荧光来检测 ZmRop1 的表达， 转化质粒 pGFP 的对照原生质体， 绿色荧光分布于整个原生质体细胞， 而转化重组 质粒 pGFP-Rop1 的原生质体， 绿色荧光分布于原生质体细胞质膜 ( 图 1 中 B， 转化后的玉 米原生质体 GFP 绿色荧光观察 ； 激光扫描共聚焦显微镜激发光波长 488nm， 40× 油镜， 标尺 10μm)。
四、 转化后玉米原生质体的总 RNA 提取和 Real-time RT-PCR 检测 SCMV 的累积
将 1ml 的 TRIzol(Invitogen， 美国 ) 加入到转化后孵育 24h 的原生质体中 ( 每 1ml TRIzol 裂解 10 个电击反应的原生质体 )， 剧烈振荡 3min ； 冰上放置 5min。原生质体裂 解物于 4℃、 12,000×g 离心 10min 以除去不溶的成分， 将上清转入一新的 1.5ml 离心管中。 在室温下静置 5min， 加 0.2ml 氯仿， 剧烈震荡 15s， 然后在室温下静置 2 ～ 5min， 再于 4℃、 12,000×g 的条件下离心 15min。 将上层水相转移到新的 1.5ml 离心管中， 加 0.5ml 异丙醇， 混合 ( 上下颠倒 )， 使样品在室温下静置 15min， 4℃、 12,000×g 离心 10min， 则 RNA 会在管的 侧壁和底部形成沉淀。弃上清， 加入 75％的乙醇洗涤沉淀， 于 4℃、 7,500×g 离心 5min( 如 RNA 沉淀悬浮起来， 则用 12,000×g)， 弃乙醇。RNA 在室温下干燥 10min 或在冷冻离心干燥 机上浓缩 5min， 加入 30μl RNAase-Free 的 ddH2O 溶解沉淀， -70℃保存备用。
将 总 RNA 用 DNase I 消 解 后， 检 测 其 纯 度 和 浓 度。 然 后 用 试 剂 盒 Takaka Tm SYBRpremix Ex Taq 进 行 Real-time RT-PCR 分 析 超 量 表 达 ZmRop1 对 SCMV 复 制 的 影 响。 以 500ng 总 RNA 作 为 模 板， 以 试 剂 盒 自 带 Oligo-d(T) 和 Random 6mers 作 为 反 向引物， 进行反转录反应。每个反应管依次加入 4.0μl 5×Reaction Buffer、 1.0μl dNTPs(10mM) 、 0.5 μ l RNase inhibitor 、 0.5 μ l Oligo-d(T)Primer(50 μ M) 、 0.5 μ l Random 6mers(100μM)、 500ng 总 RNA、 0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，最 后 用 RNAse-free 的 ddH2O 补充至 20μl。反应液在 42℃水浴反应 1h。获得的反转录产物用试 剂盒自带的稀释缓冲液 (EASY Dilution) 稀释 10 倍。
每个 PCR 反应管中加入 2.0μl 稀释 10 倍的反转录产物、 12.5μl 2×SYBR Premix ExTaq、 10mM dNTPs， 1.0μl SCMV 特异性引物 (20μM) 引物序列为 ：
SCMVqF ： 5′ -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，
SCMVqR ： 5′ -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′， 最后用 dd H2O 补充至 25μl。玉米泛素 基因 ( 登录号 U29159) 作为内参， 内参引物为 ：
UbiF ： 5′ -GGAAAAACCATAACCCTGGA-3′，
UbiR ： 5 ′ -ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3 ′。 在 DNAEngine Opticon TM 2system(Bio-Rad) 上进行反应。反应条件是 ： 50℃， 2min ； 94℃， 10min ； 94℃， 15sec， 58℃， 15sec ； 72℃， 15sec ； 80.5℃， 1sec， 读板， 40 个循环。Real time PCR 结束以后， 根据扩增仪 -ΔΔCT 自带的软件 Opticon Monitor 3 对数据进行分析。2 法的步骤如下 ：
首先， 对所有的测试样本 (test) 和校准样本 (calibrator)， 用参照基因 (ref) 的 CT 值归一目标基因 (target) 的 CT 值 ：
ΔCT(test) ＝ CT(target， test)-CT(ref， test)
ΔCT(calibrator) ＝ CT(target， calibrator)-CT (ref， calibrator)
其次， 用校准样本的 ΔCT 值归一测试样本的 ΔCT 值 ：
ΔΔCT ＝ ΔCT(test)-ΔCT(calibrator)
最后， 计算表达水平比率 ： -ΔΔCT
2 ＝表达量的比值
得到的结果是通过参照基因表达水平校准的实验样本中目标基因相对于校准样 本的增加或减少的倍数， 用参照基因校准目标基因表达的目的是为了弥补样本组织量的差 异。
结果表明， 过表达 ZmRop1 的玉米原生质体 ( 即转入重组质粒 pGFP-Rop1 的玉米原生质体 ) 中 SCMV mRNA 的相对表达量为 747％， 而转入空载体 pGFP-II 的玉米原生质体中 SCMV mRNA 的相对表达量为 1139.6％， 相对于转入空载体 pGFP-II 的玉米原生质体， 过表 达 ZmRop1 的玉米原生质体中 SCMV mRNA 的相对表达量降低 392.6％ ( 图 1 中 C， Real-time RT-PCR 检测玉米原生质体转化 24h 后 SCMV 的 mRNA 水平 ； 每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05)。
实施例 2、 ZmRop1 在玉米植株上的瞬时沉默及其对 SCMV 侵染的影响
一、 ZmRop1 在玉米植株上的瞬时沉默
1、 构建 ZmRop1 瞬时沉默载体
从 美 国 自 交 系 cv.Va35 叶 片 中 提 取 总 RNA 为 模 板， 用 上 下 游 引 物 Rop1GSF 和 Rop1GSR，
Rop1GSF ： 5 ′ -CATAAGCTTGTCGACCCACGCGTCCGCCCAG-3 ′， ( 下 划 线 部 分 为 Hind III 酶切位点 )，
Rop1GSR ： 5 ′ -CATAAGCTTAGCAGCGGCGGATGAGCAGGGC-3 ′， ( 下 划 线 部 分 为 Hind III 酶切位点 )，
反 转 录 PCR 扩 增 得 到 ZmRop1 非 翻 译 区 特 异 性 片 段， 通 过 HindIII 酶 切 PCR 产 物 并 回 收 145bp 的 基 因 片 段， 同 时 用 HindIII 酶 切 雀 麦 花 叶 病 毒 侵 染 性 克 隆 载 体 BMVpF3-5/13’ A/G( 公 众 可 从 中 国 农 业 大 学 获 得， 记载过该载体的非专利文献是 ： Ding， X.S.， Schneider， W.L.， Chaluvadi， S.R.， Mian， M.A.R.， &Nelson， R.S.(2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions， 19， 1229-1239.)， 回收 2.1kb 的载体片段， 将回收的 2.1kb 的载体片段与回收的 145bp 的基因 片段连接， 得到目的质粒。 将目的质粒转入大肠杆菌中， 抗性筛选， 挑取阳性克隆， 将阳性克 隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果表明在载体 BMVpF3-5/13’ A/ G 的 HindIII 酶切位点处插入了序列表中序列 2 第 1 到 145 位所示的 ZmRop1 序列， 证明质 粒构建正确， 将构建的沉默载体命名为 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1。
2、 体外转录模板的制备
在体外转录之前， 用 SpeI 线性化载体 BMVF1-11、 用 PshAI 线性化载体 BMVF2-2( 公 众 可 从 中 国 农 业 大 学 获 得， 记 载 过 载 体 BMVF1-11 和 载 体 BMVF2-2 的 非 专 利 文 献 是 ： Ding， X.S.， Schneider， W.L.， Chaluvadi， S.R.， Mian， M.A.R.， &Nelson， R.S.(2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions， 19， 1229-1239.)、 用 PshAI 线性化重组载体 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 和用 PshAI 线性化载体 BMVpF3-5/13’ A/G。线性化后的质粒 DNA 用琼脂糖凝胶电泳分析线性化完全程度， 确定线性 化完全以后， 用 DNA 回收试剂盒进行回收， 测定 DNA 浓度， 所有 DNA 浓度调整到 500ng/μl。
3、 体外转录
以 Spe I 线性化的 BMVF1-11 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVF1-11 体外转录产物 ； 以 PshA I 线性化的 BMVF2-2 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVF2-2 体外转录产物 ； 以 PshA I 线性化的 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 为模板， 进行体外转录， 得到 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 体外转 录产物 ； 以 PshA I 线性化的 BMVpF3-5/13’ A/G 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVpF3-5/13’ A/G 体外转录产物。 体外转录体系参照andRiboMAX(TM)In Vitro TranscriptionSystems(Promega， 美国 )， 并进行修改， 体外转录体系如下所示 ：
最后用无 RNA 酶的 ddH2O 补足 20μl， 在 37℃反应 1h。体外转录完成以后， 取出 1μl 用琼脂糖凝胶电泳分析体外转录产率和体外转录物的降解情况。
在接种玉米以前， 先对上述体外转录产物进行纯化， 体外转录产物加入 ddH2O， 补 足至 100μl， 加入等体积 4M LiCl 溶液， 混匀后， 冰浴过夜或 -70℃沉淀 1h 以上， 12,000×g 离心 20min， 充分吸出上清后， 用 70％乙醇洗涤两次， 干燥后溶于适量 RNAase-Free 的 ddH2O
中， -70℃保存备用。吸出的上清中为双链 DNA 模板， 可以用乙醇沉淀后再次利用做体外转 录的模板。
4、 体外转录产物接种
将载体 BMVF1-11、 载体 BMVF2-2 和重组载体 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 三者的体外转 录产物等量混匀后摩擦接种玉米 Va35 三叶期的第二片叶， 即为沉默接种 (C-BMVA/GRop145)。 将载体 BMVF1-11、 载体 BMVF2-2 和载体 BMVpF3-5/13’ A/G 三者的体外转录产物等量混匀后 摩擦接种玉米三叶期的第三片叶片， 即为空载体对照接种 (C-BMVA/G) ； 用无 RNase 的 ddH2O 接种的植株作为模拟接种 (Mock)。
接种方法如下 ：
在待接种的叶片的第二片叶上轻微撒上高温灭菌的金刚砂， 按每片叶子接种 1.0μg 体外转录物的量吸取接种液 ( 体外转录为混合物 )， 用带有乳胶手套的手指轻轻涂 抹叶片， 尽量均匀且不重复涂抹。5min 后， 用蒸馏水冲洗叶片， 洗去金刚砂。接种后的植物 放置在暗处 12h 后， 然后置 22℃的温室中生长。C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 每次都至少各接 种 3 株， 同时用 RNAase-Free 的 ddH2O 接种相同数量的植株作为模拟接种。
5、 结果
(1) 体外转录物接种后美国自交系 cv.Va35 的表型
C-BMVA/G 和 pC-BMVA/G/Rop1145 接种以及模拟接种美国自交系 cv.Va35 后， 在培养箱 中生长， 观察美国自交系 cv.Va35 上出现的症状等表型， 并用数码相机记录。
在代表 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 的体外转录物接种后第 7 天， 在接种叶上第一片 系统叶均出现轻微的白色条纹症状。在接种后第 10 天， C-BMVA/G/Rop145 接种的植株在接种 叶上第一片和第二片系统叶均出现紧密的白色或淡黄色条纹， 但接种 C-BMVA/G 玉米植株系 统叶片仍表现轻微的白色条纹症状 ； 而模拟接种的玉米植株的叶片未出现白色或淡黄色条 纹症状， 表型正常 ( 图 2 中 A， ZmRop1 瞬时沉默的美国自交系 cv.Va35 的表型 ； 体外转录物 及模拟接种 10d 后对第一片系统叶进行拍照 )。(2) 美国自交系 cv.Va35 中 ZmRop1 的沉默效率检测
为 了 验 证 接 种 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 的 玉 米 植 株 在 表 型 上 的 差 异 是 由 于 ZmRop1 的沉默引起的， 在接种后第 12 天， 提取各接种植株的系统叶片的总 RNA， 通过 Real-time RT-PCR 检测 ZmRop1mRNA 水平， 所用到的特异性引物为 ：
Rop1qF ： 5′ -AGGATGTTCTATGATGAACATCTTCGG-3′，
Rop1qR ： 5 ′ -CTGCTTAACTCATAGCTAGCTAACCACAC-3 ′。具体方法参照实施例 1 中 的步骤四。
结果表明， 接种 C-BMVA/G/Rop145 的玉米植株系统叶片中， ZmRop1 的 mRNA 水平是接 种 C-BMVA/G 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平的 20 ％～ 24 ％， 是模拟接种植株 (Mock) 系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平的 15％～ 18％ ( 图 2 中 B， 体外转录物及模拟接种后 14 天， Real-time RT-PCR 检测 ZmRop1 沉默效率。每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05) ； Mock 代表模拟接种植株系统叶 片 ZmRop1 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G 代表接种 C-BMVA/G 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G/Rop145 代表接种 C-BMVA/G/Rop145 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平 )。
二、 瞬时沉默 ZmRop1 对 SCMV 侵染的影响 1、 ZmRop1 瞬时沉默的美国自交系 cv.Va35 挑战接种 SCMV
为了研究瞬时沉默对 SCMV 侵染的影响， 在 C-BMVA/G/Rop1145 等体外转录物接种后 12 天， 在接种叶上部第二片系统叶用金刚砂摩擦接种 SCMV， 具体方法为 ： 在步骤 1) 接种 10d 后， 分别在沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的玉米叶片上等量接种 (5μl)( 等量是指沉默接种、 空载体对照以及模拟接种的叶片上接 种的 SCMV 侵染的玉米汁液量是相等的 )SCMV 侵染的玉米汁液。接种方法为 ： 将 SCMV 侵染 的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第二片系统叶上， 接种 SCMV 后的美国 自交系 cv.Va35 植株继续在相同的生长条件下生长。
SCMV 侵染的玉米汁液的制备方法如下 ：
从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为 SCMV 侵染后， 通过机械摩擦方式 接种到玉米 ( 综 31) 植株上， 保存在防虫温室中。 接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明 显的幼嫩叶片， 称取 0.1g 该幼嫩叶片， 加入 1ml 接种缓冲液， 充分研磨后转移到 Eppendorf 管中， 4℃， 5000g 离心 5min， 取上清， 即得到 SCMV 侵染的玉米汁液。
接 种 缓 冲 液 的 配 制： 将 1.362g KH2PO4 溶 于 1000ml 蒸 馏 水 中，再 将 1.781gNa2HPO4·2H2O 溶于 1000ml 蒸馏水中， 然后将 490ml KH2PO4 溶液和 510mlNa2HPO4 溶 液混合， 4℃保存备用。
2、 美国自交系 cv.Va35 植株在二次接种 SCMV 后的表型差异
这些接种了 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop1145 以及模拟接种的美国自交系 cv.Va35 植株 在二次接种 SCMV 后在表型上又出现了差异。一方面表现为， SCMV 系统症状出现的时间不 同， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后第一片、 第二片 系统叶出现系统症状的时间是在二次接种 SCMV 后 7d 和 11d ； 而空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株中二次接种 SCMV 后第一、 二片系统叶出现 系统症状对应的时间是 10d 和 14d。 二次接种 SCMV 后 7d 和 11d， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株， SCMV 接种叶上系统叶均能通过 RT-PCR 检测到 SCMV， 而空载体
对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株， 对应叶位的叶片中检 测不到 SCMV。
另一方面表现为， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株中 SCMV 系统叶表现的系统花叶症状要比空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 植株症状 要严重的多 ( 图 3 中 A， 分别为沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模 拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后系统叶的表型 ； SCMV 接种后 10 天对第一片系统叶片进行拍照 )。
3、 瞬时沉默 ZmRop1 促进了 SCMV 在美国自交系 cv.Va35 上的系统侵染
为了验证 SCMV 在以上植株的症状差异是由于其在这些植株上侵染程度不同造成 的， 分别收集沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的 美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后的 SCMV 系统叶用于分析 SCMV 的 mRNA 水平和病 毒的累积情况。这些系统叶片一部分用来提取总 RNA， 用 Real-time RT-PCR 分析 SCMV 的 mRNA 水平， 所用到的特异性引物为 ：
SCMVqF ： 5′ -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，
SCMVqR ： 5′ -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′。具体方法参照实施例 1 中的步骤四。 结果表明， 在沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株中， 第一、 二 片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照接种 (C-BMVA/G) 的美国自交系 cv.Va35 植 株和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株中对应叶位的系统叶片中 SCMV 的 mRNA 水平均显著高 ； 沉默接种植株中， 第一片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照接种 和模拟接种分别高 257.5％和 294％ ； 第二片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照 接种和模拟接种分别高 145.8％和 171.8％ ； ( 图 3 中 B， Real-time RT-PCR 检测沉默接种 (C-BMVA/GRop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植 株二次接种 SCMV 后系统叶的 mRNA 水平。每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不 同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05) ； Mock 代表模拟接种植株系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G 代表接种空载体对照接种植株的系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G/Rop1145 代表接种沉默接种植株的系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 )。
本发明涉及生物技术领域中玉米 ZmRop1 蛋白的新用途。背景技术 玉米矮花叶病 (maize dwarf mosaic disease， MDMD) 可由一至多种病毒系统性侵 染引起， 在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病 毒有 6 种， 它们均属于马铃薯 Y 病毒属 (Potyvirus)， 它们分别是甘蔗花叶病毒 (Sugar cane mosaic virus， SCMV)、 玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus， MDMV)、 高粱花叶病毒 (Sorghum mosaic virus， SrMV)、 约翰逊草花叶病毒 (Johnsongrass mosaic virus， JGMV)、 玉米属花叶病毒 (Zea mosaic virus， ZeMV) 和白草花叶病毒 (Pennisetum mosaic virus， PenMV)。甘蔗花叶病毒北京分离物 (SCMV-BJ) 是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的 优势株系 (Fan ZF， Chen HY， Liang XM， Li HF， 2003.Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China.Archives of Virology 148， 773-82)。
作为一种细胞内专性寄生物的植物病毒， 在侵染过程中， 其生活史的完成必须依 赖寄主因子参与病毒脱壳、 基因组复制、 病毒颗粒组装和病毒运动过程。 而这种依赖性就需 要寄主因子在病毒侵染时改变原有的正常的功能和状态。 这些复杂的改变一方面体现在植 物发生了一系列生理和组织上的变化， 从分子、 化学和物理水平上来抵抗病毒的侵染， 另一 方面表现在病毒通过多种策略适应或改变寄主细胞从而增强侵染复制复合体的形成、 抑制 转录后基因沉默， 促进细胞间的移动、 干扰植物细胞周期等， 同时导致寄主植物形成各种症 状， 包括花叶、 褪色、 矮化、 发育缺陷或死亡等 (Whitham SA， Yang C Goodin MM 2006.Global impact ： elucidating plant responses to viral infection.Molecular Plant-Microbe Interactions 19， 1207-15)。
在 抗 性 寄 主 中， 病 毒 的 侵 染 会 激 发 抗 性 寄 主 的 免 疫 反 应， 病毒的无毒基因 (Avrgene) 和寄主的抗病基因 (R gene) 相互识别可激发寄主的一些抗病防卫反应。在感 病寄主中， 植物基因表达的变化可能是由两种原因造成 ： 一是病毒侵染过程要求的寄主因 子参与 ； 二是由于寄主本身的抗病反应或由于病毒侵染干扰了植物 miRNA 的功能， 进而引 起植物典型的表型变化即症状的产生 (Yang Z， Fu Y， 2007.ROP/RAC GTPasesignaling. Current Opinion in Plant Biology 10， 490-4)。
鉴 定 SCMV 侵染后玉 米中差 异表达的基 因， 有 助于 探索 防治 玉米 矮花 叶病 的 新途径。近年来， 科学家已经做了大量工作来鉴定 SCMV 侵染后玉米中差异表达的基 因 (Uzarowska A， Dionisio G， Sarholz， B et al.， 2009.Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays L.)byexpression profiling.BMC Plant Biology 9， 15doi ： 10.1186/1471-2229-9-15)， 然而， SCMV 和玉米之间的分子互作机理尚不清晰。
Rop 作为植物重要的调控因子， 参与调控植物多种信号途径， 如调控花粉管的
作为一种细胞内专性寄生物的植物病毒， 在侵染过程中， 其生活史的完成必须依 赖寄主因子参与病毒脱壳、 基因组复制、 病毒颗粒组装和病毒运动过程。 而这种依赖性就需 要寄主因子在病毒侵染时改变原有的正常的功能和状态。 这些复杂的改变一方面体现在植 物发生了一系列生理和组织上的变化， 从分子、 化学和物理水平上来抵抗病毒的侵染， 另一 方面表现在病毒通过多种策略适应或改变寄主细胞从而增强侵染复制复合体的形成、 抑制 转录后基因沉默， 促进细胞间的移动、 干扰植物细胞周期等， 同时导致寄主植物形成各种症 状， 包括花叶、 褪色、 矮化、 发育缺陷或死亡等 (Whitham SA， Yang C Goodin MM 2006.Global impact ： elucidating plant responses to viral infection.Molecular Plant-Microbe Interactions 19， 1207-15)。
在 抗 性 寄 主 中， 病 毒 的 侵 染 会 激 发 抗 性 寄 主 的 免 疫 反 应， 病毒的无毒基因 (Avrgene) 和寄主的抗病基因 (R gene) 相互识别可激发寄主的一些抗病防卫反应。在感 病寄主中， 植物基因表达的变化可能是由两种原因造成 ： 一是病毒侵染过程要求的寄主因 子参与 ； 二是由于寄主本身的抗病反应或由于病毒侵染干扰了植物 miRNA 的功能， 进而引 起植物典型的表型变化即症状的产生 (Yang Z， Fu Y， 2007.ROP/RAC GTPasesignaling. Current Opinion in Plant Biology 10， 490-4)。
鉴 定 SCMV 侵染后玉 米中差 异表达的基 因， 有 助于 探索 防治 玉米 矮花 叶病 的 新途径。近年来， 科学家已经做了大量工作来鉴定 SCMV 侵染后玉米中差异表达的基 因 (Uzarowska A， Dionisio G， Sarholz， B et al.， 2009.Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays L.)byexpression profiling.BMC Plant Biology 9， 15doi ： 10.1186/1471-2229-9-15)， 然而， SCMV 和玉米之间的分子互作机理尚不清晰。
Rop 作为植物重要的调控因子， 参与调控植物多种信号途径， 如调控花粉管的
生长、 调控肌动蛋白细胞骨架和细胞极性生长 (Yang Z， 2002.Small GTPase ： versatile signaling switches in plants.Plant Cell Supplement 14， S375-88)、 参与植物非生物 胁迫 (Nibau C， Wu H， Cheung A， 2006.RAC/ROP GTPase ： ‘hubs’ for signal integration and diversification in plants.Trends in Plant Science 11(6)， 1360-85)， Rops 还 参与一些植物激素如脱落酸 (Zheng ZL， Nafisi M， Tam A， Li H.et al.， 2002.Plasma membrane-associated ROP 10small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis.Plant Cell 14， 2787-97) 和生长素信号途 径， Rops 也参与泛素 /26S 蛋白体介导的蛋白水解 (Tao L， Cheung AY， Nibau C Wu HM， 2005.RAC GTPases in tobacco and Arabidopsis mediate Auxin-induced formation of proteolytically active nuclear protein bodies that containAUX/IAAproteins. Plant Cell 17， 2369-83)。在玉米中， 共有 9 个 Rop 成员， ZmRop1 ～ 9 ； ZmRop1(ZmRacA)， ZmRop2(ZmRacB)， ZmRop3(ZmRacC) 和 ZmRop4(ZmRacD) 在哺乳动物细胞中表达能够诱导过 氧化物的产生 (Hassanain HH， Sharma YK， Moldovan L et al.， 2000.Plant Rac proteins induce superoxide production in mammalian cells.Biochemical and Biophysical Research.Communications 272 ： 783-8) ； 而 ZmRop2 在玉米雄性配子体 ( 花粉粒 ) 中发挥重 要功能 (Agrawal GK， Iwahashi H， Rakwal R， 2003.Small GTPase ‘Rop’ ： molecular switch for plant defense responses.FEBSLetters 546， 173-80)， 然而在大多数情况下， ZmRop 成员的参与调控玉米正常生长发育和玉米对生物、 非生物逆境胁迫响应知之甚少。 发明内容 本发明的一个目的是提供序列表中序列 1 所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制 的产品中的应用。
本发明提供了序列表中序列 1 所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的 应用。
本发明的另一个目的是提供序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在制备抑制 植物病毒复制的产品中的应用。
本发明提供了序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制 的产品中的应用 ； 所述蛋白的编码基因为如下 1)-3) 中任一所述的基因 ：
1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 所示的 DNA 分子杂交且编码所述蛋白的基因 ；
3) 与 1) 或 2) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有序列表中序列 1 所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒 复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在 pGFP 载体的多克隆位点插入序列表中序列 1 所示蛋白的 编码基因得到的重组表达载体。
所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复 制；
所述植物细胞为植物细胞中的原生质体 ；
所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒 ；
所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。 序列表中序列 1 所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。 序列表中序列 1 所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用也属于本 发明的保护范围。
所述蛋白的编码基因为如下 1)-3) 中任一所述的基因 ：
1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 所示的 DNA 分子杂交且编码所述蛋白的基因 ；
3) 与 1) 或 2) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有序列表中序列 1 所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害 中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在 pGFP 载体的多克隆位点插入序列表中序列 1 所示蛋白的 编码基因得到的重组表达载体。
所述植物病毒病害为玉米矮花叶病 ；
所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的 ；
所述植物为玉米。
本发明通过 (1) 在玉米原生质体中共转化能表达 ZmRop1 的质粒与 SCMV RNA， 发现 过量表达 ZmRop1， SCMV 病毒复制水平降低约 392.6％， 即过量表达 ZmRop1 可有效抑制 SCMV 的复制 ； (2) 在玉米叶片中瞬时沉默 ZmRop1 后接种 SCMV， ZmRop1 瞬时沉默的植株上， SCMV 建立系统侵染的时间缩短 ( 提前 3d)， 病毒累积增加 ( 表现在 SCMV mRNA 水平增加约 274 ～ 395％ )， 产生的系统花叶症状更为严重， 瞬时沉默 ZmRop1 促进了 SCMV 在玉米上的系统侵 染。 这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用， 同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
【附图说明】
图 1 为在玉米原生质体中过量表达 ZmRop1 对 SCMV 复制的影响。 图 2 为瞬时沉默 ZmRop1 的玉米植株表型及其 ZmRop1 的 mRNA 水平。 图 3 为瞬时沉默 ZmRop1 对 SCMV 系统侵染玉米植株的影响。具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 过量表达 ZmRop1 抑制甘蔗花叶病毒 (SCMV) 的复制
一、 构建 ZmRop1 瞬时表达载体
按照分子克隆常规方法， 构建 ZmRop1 瞬时表达载体 pGFP-Rop1。具体方法如下 ： 从美国自交系 cv.Va35( 购自中国农业大学国家玉米改良中心 ) 叶片中提取总 RNA 为模板， 用上下游引物 Rop1F 和 Rop1R，
Rop1F ： 5′ -GTCGACATGGCGTCCAGCGCCTCTCGGTTCAT-3′， ( 下划线部分为 Sal I 酶 切位点 )，
Rop1R ： 5′ -GAGCTCTCAGGACTTGAAGCATAGCATTTTTCTTCCACCG-3′， ( 下划线部分为Sac I 酶切位点 )，
反转录 PCR 扩增得到 ZmRop1 蛋白的编码基因序列， 该编码基因的核苷酸序列如序 列表中序列 2 所示， 该序列所编码的 ZmRop1 蛋白的氨基酸序列如序列表中序列 1 所示。然 后利用 Sal I 和 Sac I 限制性内切酶酶切该编码基因序列， 回收酶切后的基因片段 ； 同时， 用 Sal I 和 Sac I 酶切载体 pGFP( 公众可从中国农业大学获得， 记载过该载体的非专利文 献是 ： Shi Y， Qin Y， Cao Y.et al.， 2011.Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection.European Journal of Plant Pathology 131， 317-26)， 回收载 体大片段， 将回收的载体大片段与回收的基因片段连接后， 获得重组质粒。 将重组质粒转入 大肠杆菌中， 抗性筛选， 挑取阳性克隆， 将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行 测序验证， 测序结果表明在 pGFP 载体的 Sal I 和 Sac I 酶切位点间插入了序列表中序列 2 所示的 ZmRop1 基因片段， 证明重组载体构建正确， 将该重组载体命名为 pGFP-Rop1。
二、 甘蔗花叶病毒 (SCMV)RNA 提取
1、 SCMV 病毒粗提纯
收集感染 SCMV 且系统花叶症状明显的玉米叶片 200g， 剪成小段， 在液氮中快速 研磨成粉状。在研磨后的粉状物中加入 400ml 提取缓冲液 I(0.5M 磷酸钾缓冲液， 使用前 加入 0.01M 的二乙基二硫代氨钾酸钠和 1％ β- 巯基乙醇， WV， pH7.2)， 搅拌均匀。用双层 尼龙网 ( 孔径 38μm) 过滤， 滤液加 20％ (WV)CCl4， 充分搅拌 20 ～ 30min。8,500rpm 离心 25min。往上清液中加入 0.25M 的 NaCl( 终浓度 )， 搅拌至完全溶解后， 再缓慢加入 6％ (g/ ml)PEG-6000(Fluka， 日本 )， 冰浴中搅拌至 PEG-6000 完全溶解， 于 4℃静置 2h。 8,500rpm 离 心 30min， 沉淀用含 1％ Tween-20(Roche， Germany) 的提取缓冲液 II(0.05M 磷酸钾缓冲液， pH7.2) 于 4℃悬浮过夜。 7,000rpm 离心 15min， 将上清液置于 20％的蔗糖垫上 ( 上清液与蔗 糖垫的体积比为 1 ∶ 2)， 38,000rpm 离心 90min。 每管沉淀用 1.0ml 提取缓冲液 III(0.005M 磷酸钾缓冲液， pH7.2) 充分悬浮， 4℃冰箱中过夜。7,000rpm 离心 10min 去沉淀， 上清液即 为粗提纯的 SCMV， 然后以 100μl 为单位分装， 于 -80℃冰箱中保存备用。
收集感染 SCMV 且系统花叶症状明显的玉米叶片的方法为 ： 将 SCMV 侵染的玉米汁 液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第三片叶上， 接种后将玉米植株放在人工气候室 中培养， 培养条件为 ： 23℃光照 16h 和 21℃黑暗 8h。接种 30 天后收集系统花叶症状明显的 玉米叶片。
SCMV 侵染的玉米汁液的制备方法如下 ：
从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为 SCMV 侵染后， 通过机械摩擦方式 接种到玉米 ( 综 31) 植株上， 保存在防虫温室中。 接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明 显的幼嫩叶片， 称取 0.1g 该幼嫩叶片， 加入 1ml 接种缓冲液， 充分研磨后转移到 Eppendorf 管中， 4℃， 5000g 离心 5min， 取上清， 即得到 SCMV 侵染的玉米汁液。
2、 从粗提纯病毒中提取 SCMV RNA
在 100μl 粗提纯 SCMV 中加入 160μl RNAse-free 的 ddH2O， 再加入 200μl RNA 抽 提缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 8.0 ； 200mM NaCl ； 5mM EDTA)， 然后加入 40μl 10％ SDS， 混 匀， 室温保持 5min。加入 2 倍体积 (800μl) 的 PCI( 苯酚∶氯仿∶异戊醇＝ 25 ∶ 24 ∶ 1)， 混匀， 12,000×g 离心 5min。吸取上层水相， 加入 2 倍体积的 PCI， 混匀， 12,000×g 离心 5min， 再重复抽提一次。 吸取上层水相， 确定其体积后， 加入 1/10(V/V)3M 的 NaAC(pH 5.2)，混匀 ； 加入 2.2 倍体积的无水乙醇， 混匀， -80℃沉淀 1h 或 -20℃沉淀过夜。12,000×g 离 心 20min， 用 1ml 70％乙醇洗涤沉淀， 室温干燥 ； 所得 RNA 溶于 30μl RNAse-free 的 ddH2O 中， -80℃保存备用。
三、 玉米原生质体的制备、 转化及观察
(1) 玉米原生质体的分离
选取籽粒饱满、 大小均一的玉米自交系综 31( 购自中国农业大学国家玉米改良中 心 ) 种子， 用氯气消毒并在超净工作台吹净氯气后置于 25℃的培养箱中发芽、 暗培养。 当玉 米黄化苗长到第 2 片叶高于第一片 10 ～ 15cm 时， 剪下第 2 片叶子中间的 6 ～ 8cm 的部分， 轻轻将 20 片剪下的叶片叠在一起， 用新开封的刀片切成约 0.5mm 的细丝， 在蒸馏烧瓶中按 照 1g 叶片加入 5ml 酶溶液 (1 ～ 1.5％纤维素酶 R10(Yakult Honsha， 日本 )、 0.2 ～ 0.4％ 离析酶 R10(Yakult Honsha)、 0.6M 甘露醇、 20mM KCl、 20mM MES， pH5.7) 的比例加入酶溶液， 然后消化、 避光， 抽真空 30min( 真空度 0.05MPa)， 使酶溶液充分渗透到叶片中。 然后在摇床 (40rpm) 上继续避光消化 2h。将上述经酶溶液消化的叶片滤过尼龙网 ( 孔径 38μm)， 转移 到圆底离心管中， 置于冰上， 获得分离的玉米原生质体。
(2) 玉米原生质体的活力测定 用尖端剪去的吸头取出 500μl 分离的原生质体， 转移到 2ml 离心管中， 加入等 体积的 0.02％荧光素乙酰乙酸盐 (FDA) 溶液 (0.1ml FDA 母液 (2mg FDA 溶于 1ml 丙酮 ) 溶于 10ml CPW 洗液中 (27.2mg/L KH2PO4， 101mg/L KNO3， 1480mg/L CaCl2·2H2O， 246mg/L MgSO4·7H2O， 0.16mg/L KI， 0.025mg/L CuSO4·SH2O， 10％ mannitol， pH5.7)， 静置 5min。取 适量样品置于载玻片上， 用镊子轻轻盖上盖片， 注意不要使其盖片滑动。在荧光显微镜下， 五点取样， 每个视野的原生质体总数不少于 50 个， 观察记录原生质体总数和发黄绿荧光的 原生质体总数， 发黄绿荧光原生质体为有活力的原生质体 ( 图 1 中 A， 玉米原生质体活力检 测； 分离出的玉米原生质体经 FDA 染色后在显微镜下观察黄绿色荧光， 物镜倍数 20×)。
(3) 玉米原始质体的转化及观察
将玉米原生质体用电击缓冲液 (0.6M mannitol， 4mM MES， pH5.7， 20mM KCl) 洗 2 次。150×g 离心 2min， 小心吸去上清液， 用电击缓冲液重悬原生质体， 用血球计数板计数使 6 重悬后的原生质体浓度达到 2×10 /ml， 将原生质体置冰上备用。在 2ml 圆底离心管中加 入 50μg 重组质粒 pGFP-Rop1 和 300μl 原生质体， 充分混匀， 再加入 10μg SCMVRNA， 用移 液器吸吐混匀， 电击 2 次 (5msec， 200μF， 400V)， 冰上放置 10min。150g 离心 2min， 吸去上 清液， 用 1ml 孵育缓冲液 (1000ml 中包括 30g 蔗糖， 4.3gMurashige-Skoog[MS] 盐， 2mg 甘氨 酸， 1mg 维生素 B1， 100mg 肌醇， 0.5mg 1- 萘乙酸， 0.5mg 6-BA， 0.2mg 2， 4- 二氯苯氧乙酸， 0.55M 甘露醇， pH 5.7) 重悬原生质体， 25℃黑暗孵育过夜。同时， 以转化质粒 pGFP 和 SCMV RNA 的原生质体作为对照。
转化后的原生质体， 通过激光扫描共聚焦显微镜观察 GFP 绿色荧光来检测 ZmRop1 的表达， 转化质粒 pGFP 的对照原生质体， 绿色荧光分布于整个原生质体细胞， 而转化重组 质粒 pGFP-Rop1 的原生质体， 绿色荧光分布于原生质体细胞质膜 ( 图 1 中 B， 转化后的玉 米原生质体 GFP 绿色荧光观察 ； 激光扫描共聚焦显微镜激发光波长 488nm， 40× 油镜， 标尺 10μm)。
四、 转化后玉米原生质体的总 RNA 提取和 Real-time RT-PCR 检测 SCMV 的累积
将 1ml 的 TRIzol(Invitogen， 美国 ) 加入到转化后孵育 24h 的原生质体中 ( 每 1ml TRIzol 裂解 10 个电击反应的原生质体 )， 剧烈振荡 3min ； 冰上放置 5min。原生质体裂 解物于 4℃、 12,000×g 离心 10min 以除去不溶的成分， 将上清转入一新的 1.5ml 离心管中。 在室温下静置 5min， 加 0.2ml 氯仿， 剧烈震荡 15s， 然后在室温下静置 2 ～ 5min， 再于 4℃、 12,000×g 的条件下离心 15min。 将上层水相转移到新的 1.5ml 离心管中， 加 0.5ml 异丙醇， 混合 ( 上下颠倒 )， 使样品在室温下静置 15min， 4℃、 12,000×g 离心 10min， 则 RNA 会在管的 侧壁和底部形成沉淀。弃上清， 加入 75％的乙醇洗涤沉淀， 于 4℃、 7,500×g 离心 5min( 如 RNA 沉淀悬浮起来， 则用 12,000×g)， 弃乙醇。RNA 在室温下干燥 10min 或在冷冻离心干燥 机上浓缩 5min， 加入 30μl RNAase-Free 的 ddH2O 溶解沉淀， -70℃保存备用。
将 总 RNA 用 DNase I 消 解 后， 检 测 其 纯 度 和 浓 度。 然 后 用 试 剂 盒 Takaka Tm SYBRpremix Ex Taq 进 行 Real-time RT-PCR 分 析 超 量 表 达 ZmRop1 对 SCMV 复 制 的 影 响。 以 500ng 总 RNA 作 为 模 板， 以 试 剂 盒 自 带 Oligo-d(T) 和 Random 6mers 作 为 反 向引物， 进行反转录反应。每个反应管依次加入 4.0μl 5×Reaction Buffer、 1.0μl dNTPs(10mM) 、 0.5 μ l RNase inhibitor 、 0.5 μ l Oligo-d(T)Primer(50 μ M) 、 0.5 μ l Random 6mers(100μM)、 500ng 总 RNA、 0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，最 后 用 RNAse-free 的 ddH2O 补充至 20μl。反应液在 42℃水浴反应 1h。获得的反转录产物用试 剂盒自带的稀释缓冲液 (EASY Dilution) 稀释 10 倍。
每个 PCR 反应管中加入 2.0μl 稀释 10 倍的反转录产物、 12.5μl 2×SYBR Premix ExTaq、 10mM dNTPs， 1.0μl SCMV 特异性引物 (20μM) 引物序列为 ：
SCMVqF ： 5′ -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，
SCMVqR ： 5′ -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′， 最后用 dd H2O 补充至 25μl。玉米泛素 基因 ( 登录号 U29159) 作为内参， 内参引物为 ：
UbiF ： 5′ -GGAAAAACCATAACCCTGGA-3′，
UbiR ： 5 ′ -ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3 ′。 在 DNAEngine Opticon TM 2system(Bio-Rad) 上进行反应。反应条件是 ： 50℃， 2min ； 94℃， 10min ； 94℃， 15sec， 58℃， 15sec ； 72℃， 15sec ； 80.5℃， 1sec， 读板， 40 个循环。Real time PCR 结束以后， 根据扩增仪 -ΔΔCT 自带的软件 Opticon Monitor 3 对数据进行分析。2 法的步骤如下 ：
首先， 对所有的测试样本 (test) 和校准样本 (calibrator)， 用参照基因 (ref) 的 CT 值归一目标基因 (target) 的 CT 值 ：
ΔCT(test) ＝ CT(target， test)-CT(ref， test)
ΔCT(calibrator) ＝ CT(target， calibrator)-CT (ref， calibrator)
其次， 用校准样本的 ΔCT 值归一测试样本的 ΔCT 值 ：
ΔΔCT ＝ ΔCT(test)-ΔCT(calibrator)
最后， 计算表达水平比率 ： -ΔΔCT
2 ＝表达量的比值
得到的结果是通过参照基因表达水平校准的实验样本中目标基因相对于校准样 本的增加或减少的倍数， 用参照基因校准目标基因表达的目的是为了弥补样本组织量的差 异。
结果表明， 过表达 ZmRop1 的玉米原生质体 ( 即转入重组质粒 pGFP-Rop1 的玉米原生质体 ) 中 SCMV mRNA 的相对表达量为 747％， 而转入空载体 pGFP-II 的玉米原生质体中 SCMV mRNA 的相对表达量为 1139.6％， 相对于转入空载体 pGFP-II 的玉米原生质体， 过表 达 ZmRop1 的玉米原生质体中 SCMV mRNA 的相对表达量降低 392.6％ ( 图 1 中 C， Real-time RT-PCR 检测玉米原生质体转化 24h 后 SCMV 的 mRNA 水平 ； 每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05)。
实施例 2、 ZmRop1 在玉米植株上的瞬时沉默及其对 SCMV 侵染的影响
一、 ZmRop1 在玉米植株上的瞬时沉默
1、 构建 ZmRop1 瞬时沉默载体
从 美 国 自 交 系 cv.Va35 叶 片 中 提 取 总 RNA 为 模 板， 用 上 下 游 引 物 Rop1GSF 和 Rop1GSR，
Rop1GSF ： 5 ′ -CATAAGCTTGTCGACCCACGCGTCCGCCCAG-3 ′， ( 下 划 线 部 分 为 Hind III 酶切位点 )，
Rop1GSR ： 5 ′ -CATAAGCTTAGCAGCGGCGGATGAGCAGGGC-3 ′， ( 下 划 线 部 分 为 Hind III 酶切位点 )，
反 转 录 PCR 扩 增 得 到 ZmRop1 非 翻 译 区 特 异 性 片 段， 通 过 HindIII 酶 切 PCR 产 物 并 回 收 145bp 的 基 因 片 段， 同 时 用 HindIII 酶 切 雀 麦 花 叶 病 毒 侵 染 性 克 隆 载 体 BMVpF3-5/13’ A/G( 公 众 可 从 中 国 农 业 大 学 获 得， 记载过该载体的非专利文献是 ： Ding， X.S.， Schneider， W.L.， Chaluvadi， S.R.， Mian， M.A.R.， &Nelson， R.S.(2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions， 19， 1229-1239.)， 回收 2.1kb 的载体片段， 将回收的 2.1kb 的载体片段与回收的 145bp 的基因 片段连接， 得到目的质粒。 将目的质粒转入大肠杆菌中， 抗性筛选， 挑取阳性克隆， 将阳性克 隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果表明在载体 BMVpF3-5/13’ A/ G 的 HindIII 酶切位点处插入了序列表中序列 2 第 1 到 145 位所示的 ZmRop1 序列， 证明质 粒构建正确， 将构建的沉默载体命名为 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1。
2、 体外转录模板的制备
在体外转录之前， 用 SpeI 线性化载体 BMVF1-11、 用 PshAI 线性化载体 BMVF2-2( 公 众 可 从 中 国 农 业 大 学 获 得， 记 载 过 载 体 BMVF1-11 和 载 体 BMVF2-2 的 非 专 利 文 献 是 ： Ding， X.S.， Schneider， W.L.， Chaluvadi， S.R.， Mian， M.A.R.， &Nelson， R.S.(2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions， 19， 1229-1239.)、 用 PshAI 线性化重组载体 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 和用 PshAI 线性化载体 BMVpF3-5/13’ A/G。线性化后的质粒 DNA 用琼脂糖凝胶电泳分析线性化完全程度， 确定线性 化完全以后， 用 DNA 回收试剂盒进行回收， 测定 DNA 浓度， 所有 DNA 浓度调整到 500ng/μl。
3、 体外转录
以 Spe I 线性化的 BMVF1-11 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVF1-11 体外转录产物 ； 以 PshA I 线性化的 BMVF2-2 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVF2-2 体外转录产物 ； 以 PshA I 线性化的 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 为模板， 进行体外转录， 得到 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 体外转 录产物 ； 以 PshA I 线性化的 BMVpF3-5/13’ A/G 为模板， 进行体外转录， 得到 BMVpF3-5/13’ A/G 体外转录产物。 体外转录体系参照andRiboMAX(TM)In Vitro TranscriptionSystems(Promega， 美国 )， 并进行修改， 体外转录体系如下所示 ：
最后用无 RNA 酶的 ddH2O 补足 20μl， 在 37℃反应 1h。体外转录完成以后， 取出 1μl 用琼脂糖凝胶电泳分析体外转录产率和体外转录物的降解情况。
在接种玉米以前， 先对上述体外转录产物进行纯化， 体外转录产物加入 ddH2O， 补 足至 100μl， 加入等体积 4M LiCl 溶液， 混匀后， 冰浴过夜或 -70℃沉淀 1h 以上， 12,000×g 离心 20min， 充分吸出上清后， 用 70％乙醇洗涤两次， 干燥后溶于适量 RNAase-Free 的 ddH2O
中， -70℃保存备用。吸出的上清中为双链 DNA 模板， 可以用乙醇沉淀后再次利用做体外转 录的模板。
4、 体外转录产物接种
将载体 BMVF1-11、 载体 BMVF2-2 和重组载体 pF3-5/13’ A/G-ZmRop1 三者的体外转 录产物等量混匀后摩擦接种玉米 Va35 三叶期的第二片叶， 即为沉默接种 (C-BMVA/GRop145)。 将载体 BMVF1-11、 载体 BMVF2-2 和载体 BMVpF3-5/13’ A/G 三者的体外转录产物等量混匀后 摩擦接种玉米三叶期的第三片叶片， 即为空载体对照接种 (C-BMVA/G) ； 用无 RNase 的 ddH2O 接种的植株作为模拟接种 (Mock)。
接种方法如下 ：
在待接种的叶片的第二片叶上轻微撒上高温灭菌的金刚砂， 按每片叶子接种 1.0μg 体外转录物的量吸取接种液 ( 体外转录为混合物 )， 用带有乳胶手套的手指轻轻涂 抹叶片， 尽量均匀且不重复涂抹。5min 后， 用蒸馏水冲洗叶片， 洗去金刚砂。接种后的植物 放置在暗处 12h 后， 然后置 22℃的温室中生长。C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 每次都至少各接 种 3 株， 同时用 RNAase-Free 的 ddH2O 接种相同数量的植株作为模拟接种。
5、 结果
(1) 体外转录物接种后美国自交系 cv.Va35 的表型
C-BMVA/G 和 pC-BMVA/G/Rop1145 接种以及模拟接种美国自交系 cv.Va35 后， 在培养箱 中生长， 观察美国自交系 cv.Va35 上出现的症状等表型， 并用数码相机记录。
在代表 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 的体外转录物接种后第 7 天， 在接种叶上第一片 系统叶均出现轻微的白色条纹症状。在接种后第 10 天， C-BMVA/G/Rop145 接种的植株在接种 叶上第一片和第二片系统叶均出现紧密的白色或淡黄色条纹， 但接种 C-BMVA/G 玉米植株系 统叶片仍表现轻微的白色条纹症状 ； 而模拟接种的玉米植株的叶片未出现白色或淡黄色条 纹症状， 表型正常 ( 图 2 中 A， ZmRop1 瞬时沉默的美国自交系 cv.Va35 的表型 ； 体外转录物 及模拟接种 10d 后对第一片系统叶进行拍照 )。(2) 美国自交系 cv.Va35 中 ZmRop1 的沉默效率检测
为 了 验 证 接 种 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop145 的 玉 米 植 株 在 表 型 上 的 差 异 是 由 于 ZmRop1 的沉默引起的， 在接种后第 12 天， 提取各接种植株的系统叶片的总 RNA， 通过 Real-time RT-PCR 检测 ZmRop1mRNA 水平， 所用到的特异性引物为 ：
Rop1qF ： 5′ -AGGATGTTCTATGATGAACATCTTCGG-3′，
Rop1qR ： 5 ′ -CTGCTTAACTCATAGCTAGCTAACCACAC-3 ′。具体方法参照实施例 1 中 的步骤四。
结果表明， 接种 C-BMVA/G/Rop145 的玉米植株系统叶片中， ZmRop1 的 mRNA 水平是接 种 C-BMVA/G 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平的 20 ％～ 24 ％， 是模拟接种植株 (Mock) 系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平的 15％～ 18％ ( 图 2 中 B， 体外转录物及模拟接种后 14 天， Real-time RT-PCR 检测 ZmRop1 沉默效率。每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05) ； Mock 代表模拟接种植株系统叶 片 ZmRop1 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G 代表接种 C-BMVA/G 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G/Rop145 代表接种 C-BMVA/G/Rop145 植株的系统叶片 ZmRop1 的 mRNA 水平 )。
二、 瞬时沉默 ZmRop1 对 SCMV 侵染的影响 1、 ZmRop1 瞬时沉默的美国自交系 cv.Va35 挑战接种 SCMV
为了研究瞬时沉默对 SCMV 侵染的影响， 在 C-BMVA/G/Rop1145 等体外转录物接种后 12 天， 在接种叶上部第二片系统叶用金刚砂摩擦接种 SCMV， 具体方法为 ： 在步骤 1) 接种 10d 后， 分别在沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的玉米叶片上等量接种 (5μl)( 等量是指沉默接种、 空载体对照以及模拟接种的叶片上接 种的 SCMV 侵染的玉米汁液量是相等的 )SCMV 侵染的玉米汁液。接种方法为 ： 将 SCMV 侵染 的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第二片系统叶上， 接种 SCMV 后的美国 自交系 cv.Va35 植株继续在相同的生长条件下生长。
SCMV 侵染的玉米汁液的制备方法如下 ：
从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为 SCMV 侵染后， 通过机械摩擦方式 接种到玉米 ( 综 31) 植株上， 保存在防虫温室中。 接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明 显的幼嫩叶片， 称取 0.1g 该幼嫩叶片， 加入 1ml 接种缓冲液， 充分研磨后转移到 Eppendorf 管中， 4℃， 5000g 离心 5min， 取上清， 即得到 SCMV 侵染的玉米汁液。
接 种 缓 冲 液 的 配 制： 将 1.362g KH2PO4 溶 于 1000ml 蒸 馏 水 中，再 将 1.781gNa2HPO4·2H2O 溶于 1000ml 蒸馏水中， 然后将 490ml KH2PO4 溶液和 510mlNa2HPO4 溶 液混合， 4℃保存备用。
2、 美国自交系 cv.Va35 植株在二次接种 SCMV 后的表型差异
这些接种了 C-BMVA/G 和 C-BMVA/G/Rop1145 以及模拟接种的美国自交系 cv.Va35 植株 在二次接种 SCMV 后在表型上又出现了差异。一方面表现为， SCMV 系统症状出现的时间不 同， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后第一片、 第二片 系统叶出现系统症状的时间是在二次接种 SCMV 后 7d 和 11d ； 而空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株中二次接种 SCMV 后第一、 二片系统叶出现 系统症状对应的时间是 10d 和 14d。 二次接种 SCMV 后 7d 和 11d， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株， SCMV 接种叶上系统叶均能通过 RT-PCR 检测到 SCMV， 而空载体
对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株， 对应叶位的叶片中检 测不到 SCMV。
另一方面表现为， 沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株中 SCMV 系统叶表现的系统花叶症状要比空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 植株症状 要严重的多 ( 图 3 中 A， 分别为沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模 拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后系统叶的表型 ； SCMV 接种后 10 天对第一片系统叶片进行拍照 )。
3、 瞬时沉默 ZmRop1 促进了 SCMV 在美国自交系 cv.Va35 上的系统侵染
为了验证 SCMV 在以上植株的症状差异是由于其在这些植株上侵染程度不同造成 的， 分别收集沉默接种 (C-BMVA/G Rop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的 美国自交系 cv.Va35 植株二次接种 SCMV 后的 SCMV 系统叶用于分析 SCMV 的 mRNA 水平和病 毒的累积情况。这些系统叶片一部分用来提取总 RNA， 用 Real-time RT-PCR 分析 SCMV 的 mRNA 水平， 所用到的特异性引物为 ：
SCMVqF ： 5′ -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3′，
SCMVqR ： 5′ -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3′。具体方法参照实施例 1 中的步骤四。 结果表明， 在沉默接种 (C-BMVA/G Rop145) 的美国自交系 cv.Va35 植株中， 第一、 二 片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照接种 (C-BMVA/G) 的美国自交系 cv.Va35 植 株和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植株中对应叶位的系统叶片中 SCMV 的 mRNA 水平均显著高 ； 沉默接种植株中， 第一片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照接种 和模拟接种分别高 257.5％和 294％ ； 第二片系统叶中， SCMV 的 mRNA 水平要比空载体对照 接种和模拟接种分别高 145.8％和 171.8％ ； ( 图 3 中 B， Real-time RT-PCR 检测沉默接种 (C-BMVA/GRop145)、 空载体对照接种 (C-BMVA/G) 和模拟接种 (Mock) 的美国自交系 cv.Va35 植 株二次接种 SCMV 后系统叶的 mRNA 水平。每个数值代表三次独立实验数值 ± 标准偏差， 不 同字母代表 student’ s t-test 显著性差异 (P ＜ 0.05) ； Mock 代表模拟接种植株系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G 代表接种空载体对照接种植株的系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 ； C-BMVA/G/Rop1145 代表接种沉默接种植株的系统叶片 SCMV 的 mRNA 水平 )。
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