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1、(10)申请公布号 CN 102417733 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102417733 A *CN102417733A* (21)申请号 201110357105.9 (22)申请日 2011.11.11 C08L 89/00(2006.01) C08J 3/05(2006.01) A61K 8/64(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61Q 17/04(2006.01) A61Q 1/00(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (71)申请人 苏州大学 地址 215123 江苏省。
2、苏州市苏州工业园区仁 爱路 199 号 (72)发明人 邢铁玲 卢神州 李明忠 张岑岑 吕强 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (54) 发明名称 一种丝素蛋白纳米球的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种丝素蛋白纳米球的制备方 法， 利用反相乳液法使丝素蛋白溶液分散成纳米 液滴， 在超声波震荡下加入多元醇， 促使纳米液滴 中的丝素蛋白形成不溶于水的结构， 再加入高吸 水性树脂， 使丝素蛋白在微乳液的状态下干燥固 化， 得到不溶于水的纳米丝素蛋白球。 由于丝素蛋 白纳米球具有良好的生物相容性， 对人体无毒、 无 害、 无免疫原性， 且制备过。
3、程采用常温常压、 无化 学交联剂的温和技术， 因此， 产品可作为具有生物 活性物质的载体， 装载酶、 核酸、 多肽、 蛋白质药物 等 ； 所得到的丝素蛋白球粒径小， 分散性好， 不粘 连， 可制成各种化妆品、 护肤品、 防晒膏等 ； 它颗 粒小， 能在血液中自由运行， 可作为针剂在疾病诊 断和治疗等领域得到广泛的应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102417743 A1/1 页 2 1. 一种丝素蛋白纳米球的制备方法， 将蚕丝进行脱胶、 溶解、 透析处理后得到浓度为 1 10 wt。
4、 % 的丝素蛋白溶液， 其特征在于， 再进行如下步骤的加工 ： (1) 以环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班， 司班加入量为环己烷的 0.01 5 wt % ， 搅拌 溶解后得到环己烷 / 司班混合溶液 ； (2) 在丝素蛋白溶液中加入多元醇， 多元醇加入量为丝素蛋白质量的 1 60 wt %， 得 到丝素蛋白 / 多元醇混合溶液 ； (3)在搅拌和超声波震荡条件下， 将丝素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加到环己烷/司 班混合溶液中， 滴加完毕后， 继续处理 10 100min ； (4) 在搅拌和超声波震荡条件下， 加入高吸水性树脂， 原位吸水干燥固化 ； (5) 过滤去除吸过水的高吸水性树脂 ； 。
5、(6) 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到下层丝素蛋白纳米颗粒 ； (7) 对丝素蛋白纳米颗粒进行水洗， 再经超声波分散， 离心去除水洗液， 得到下层固体 ； 重复本步骤 3 5 次 ； (8) 在下层固体中加入纯水， 进行超声波分散， 得到丝素蛋白纳米球的分散液 ； 或进行 冷冻干燥， 得到粉末状的丝素蛋白纳米球， 所述丝素蛋白纳米球的直径为 10 1000nm。 2. 根据权利要求 1 所述的一种丝素蛋白纳米球的制备方法， 其特征在于， 所述的多元 醇类为乙二醇、 1,3- 丙二醇、 2,3- 丙二醇、 1,4- 丁二醇、 1,2- 丁二醇、 1,3- 丁二醇、 2,3- 丁 二醇、 。
6、一缩二乙二醇、 二缩三乙二醇、 丙三醇、 1,2,4- 丁三醇、 赤藓糖醇、 苏阿糖醇、 季戊四 醇、 环戊五醇、 木糖醇、 来苏糖醇、 核糖醇、 阿拉伯糖醇、 环己六醇、 山梨醇、 阿洛糖醇、 阿卓糖 醇、 葡萄糖醇、 甘露醇、 古洛糖醇、 艾杜糖醇、 半乳糖醇、 太罗糖醇或果糖醇中的一种， 或它们 中的几种。 3. 根据权利要求 1 所述的一种丝素蛋白纳米球的制备方法， 其特征在于， 步骤 (4) 中 的高吸水性树脂的总加入量为丝素蛋白溶液质量的150 wt %， 分成210次分别加入。 权 利 要 求 书 CN 102417733 A CN 102417743 A1/5 页 3 一种丝素。
7、蛋白纳米球的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种有机高分子纳米球的制备方法， 特别涉及一种用蚕丝丝素蛋白为 原料制备纳米颗粒的制备方法， 属生物医学技术领域。 背景技术 0002 近年来， 随着生物技术和基因工程的发展， 越来越多的生物活性物质如蛋白质、 酶 有望用于疾病治疗。 然而， 由于蛋白质、 多肽类药物口服后在肠道中易降解， 静脉注射体内 循环时间短、 生物半衰期短， 大大制约了其应用。为解决这些问题， 出现了各种蛋白质类药 物剂型， 包括水凝胶、 纳米球、 微球、 脂质复合物的脂质体、 固体脂质纳米粒、 油包水型乳剂 等。以生物可降解材料制备微球为载体， 将生物活性物质固定化。
8、后， 转运到特定部位， 以预 定的速率和剂量发挥作用。与其他缓控释系统相比， 微球具有制备较简单、 稳定性好、 成本 低等特点， 已成为近年来研究的热点。 0003 蚕丝蛋白是由蚕绢丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质， 由乙氨酸、 丙氨 酸、 丝氨酸等 20 种氨基酸组成， 具有良好的生物相容性和优良的理化性能且可被生物降 解。在非纺织领域， 家蚕丝素纤维已长期用作外科手术缝合线。近年来， 将丝素蛋白应用于 人工皮肤、 人工血管、 人工骨、 药物缓释载体以及酶固定材料的大量研究结果表明， 丝素蛋 白材料无毒性、 无刺激作用， 无免疫原性， 是一种应用前景广阔的生物材料。将丝素蛋白制 备成微。
9、球用以生物活性物质的装载， 缓释给药前景广阔。 0004 本发明之前中国发明专利 （CN1243059C） 中， 公开了一种纳米丝素颗粒的制造方 法。通过向丝素蛋白溶液中加入甲醇、 乙醇等变性剂， 使丝素蛋白变性沉淀， 得到纳米丝素 蛋白微球。文献 “The preparation of regenerated silk fibroin microspheres” （J Soft Matter, 2007, 3, 910915） 中报道了丝素蛋白纳米微球的制备方法， 同样使用了 乙醇变性剂。文献 “Silk nanospheres and microspheres from silk/pva 。
10、blend films for drug delivery” (JBiomaterials, 31 (2010) 10251035) 利用 PVA/ 丝素相分离 技术制备几百纳米到几十微米的丝素蛋白微球， 需要溶解去除 PVA 以及仍然需要变性剂甲 醇使丝素蛋白不溶于水。文献 “Silk microspheres for encapsulation and controlled release” （Journal of Controlled Release 117 (2007) 360370） 利用 DOPC 形成乳液， 同样需要变性剂甲醇使丝素蛋白不溶于水。中国发明专利 (CN2012442。
11、77B) 采用水油 水型的复乳技术制备结晶性丝素微粒， 该微球平均直径为 5.84 86.27 微米 ； 由于制备过 程中的微球粘连， 造成颗粒较大， 无法达到纳米级， 此外， 也需要加入变性剂。 上述文献所公 开的技术方案中， 都需要使用变性剂以使丝素蛋白不溶于水， 由于变性剂的使用， 可能造成 生物相容性的降低以及其他生物活性分子的失活， 因此难以用于生物活性分子的装载。 0005 文献“Simple preparation and characteristics of silk fibroin microsphere” （JEuropean Polymer Journal 39 (200。
12、3) 11951199） 报道了采用喷雾 干燥法制备平均直径 2 微米的丝素蛋白微球， 该微球形状不规则， 经历了 85较高温度的 处理， 也可能造成生物分子的活性的损失。中国发明专利 （CN 101972481A） 中， 公开了一种 说 明 书 CN 102417733 A CN 102417743 A2/5 页 4 丝素蛋白微载体及其制备方法， 其制备的丝素蛋白微球直径在 100 500 m， 未达到纳米 级， 并且使用了化学交联剂 EDC 来交联丝素蛋白以使其不溶于水， 可能造成生物分子的活 性损失。中国发明专利 （CNl293952A） 中， 公开了壳聚糖与丝心蛋白共混制备微球的方法，。
13、 同样使用了化学交联剂戊二醛， 而戊二醛的交联作用， 也可能造成生物分子的活性损失。 发明内容 0006 为了克服现有技术存在的不足， 本发明的目的是提供一种工艺简单、 产量较高， 且 产品直径小、 粒径分布均匀、 分散性好、 不容易粘连、 具有生物相容性的丝素蛋白纳米球的 制备方法。 0007 本发明采用的技术方案是提供一种丝素蛋白纳米球的制备方法， 将蚕丝进行脱 胶、 溶解、 透析处理后得到浓度为 1 10 wt % 的丝素蛋白溶液， 再进行如下步骤的加工 ： (1) 以环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班， 司班加入量为环己烷的 0.01 5 wt % ， 搅拌 溶解后得到环己烷 / 司班混合。
14、溶液 ； (2) 在丝素蛋白溶液中加入多元醇， 多元醇加入量为丝素蛋白质量的 1 60 wt %， 得 到丝素蛋白 / 多元醇混合溶液 ； (3)在搅拌和超声波震荡条件下， 将丝素蛋白/多元醇混合溶液逐滴滴加到环己烷/司 班混合溶液中， 滴加完毕后， 继续处理 10 100min ； (4) 在搅拌和超声波震荡条件下， 加入高吸水性树脂， 原位吸水干燥固化 ； (5) 过滤去除吸过水的高吸水性树脂 ； (6) 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到下层丝素蛋白纳米颗粒 ； (7) 对丝素蛋白纳米颗粒进行水洗， 再经超声波分散， 离心去除水洗液， 得到下层固体 ； 重复本步骤 3 5 次 ； (。
15、8) 在下层固体中加入纯水， 进行超声波分散， 得到丝素蛋白纳米球的分散液 ； 或进行 冷冻干燥， 得到粉末状的丝素蛋白纳米球， 所述丝素蛋白纳米球的直径为 10 1000nm。 0008 上述的多元醇类为乙二醇、 1,3- 丙二醇、 2,3- 丙二醇、 1,4- 丁二醇、 1,2- 丁二醇、 1,3- 丁二醇、 2,3- 丁二醇、 一缩二乙二醇、 二缩三乙二醇、 丙三醇、 1,2,4- 丁三醇、 赤藓糖 醇、 苏阿糖醇、 季戊四醇、 环戊五醇、 木糖醇、 来苏糖醇、 核糖醇、 阿拉伯糖醇、 环己六醇、 山梨 醇、 阿洛糖醇、 阿卓糖醇、 葡萄糖醇、 甘露醇、 古洛糖醇、 艾杜糖醇、 半乳糖醇。
16、、 太罗糖醇或果 糖醇中的一种， 或它们中的几种。 0009 上述步骤(4)中的高吸水性树脂的总加入量为丝素蛋白溶液质量的150 wt %， 分成 2 10 次分别加入。 0010 本发明采用超声波反相微乳液原位干燥法， 制备丝素蛋白纳米球。利用反相乳液 法使丝素蛋白溶液分散成纳米液滴， 通过超声波以及加入多元醇的方法， 促使纳米液滴中 的丝素蛋白形成不溶于水的结构， 然后加入高吸水性树脂， 利用其超强吸水能力原位干燥 丝素蛋白纳米液滴， 使丝素蛋白在微乳液的状态下干燥固化， 避免其后的干燥过程中的纳 米颗粒的相互连接。本发明技术方案依据的主要原理如下 ： 1、 丝素蛋白超细纳米微乳液的形成技。
17、术 ： 利用搅拌使丝素蛋白溶液在低粘度有机相 中， 在表面活性剂作用下分散成微乳液， 再利用超声波震荡使之分散成超细纳米微乳液。 0011 2、 丝素蛋白超声波原位促凝技术的原理是 ： 利用超声波空化产生高剪切应力， 从 说 明 书 CN 102417733 A CN 102417743 A3/5 页 5 而使丝素蛋白在剪切作用下相互聚集成不溶于水的规整结构。 0012 3、 多元醇致使丝素蛋白不溶化技术的原理是 ： 利用多元醇与丝素蛋白之间的氢键 结合， 促使丝素蛋白相互靠拢聚集， 降低丝素蛋白的玻璃化转变温度， 使丝素蛋白链段容易 运动， 以形成规整的热力学稳定结构。 0013 4、 高吸。
18、水树脂原位固化技术的原理是 ： 利用高吸水性树脂的高渗透压吸走丝素蛋 白溶液中低渗透压的水， 从而使丝素蛋白逐渐脱水收缩成型， 形成圆形的纳米颗粒。 纳米颗 粒的成形与吸水收缩过程有关， 因此需要有一个合适的高吸水树脂加入速度才能得到圆形 的纳米颗粒， 加入速度过快则纳米颗粒收缩不均匀， 得到不规则的纳米球 ； 加入速度过慢则 造成纳米颗粒收缩时的粘度增加， 相互粘连成大颗粒丝素蛋白球。 0014 由于采用了上述技术方案， 与现有技术相比本发明具有以下显著的优点 ： 1、 本发明提供的超声波反相微乳液原位干燥法制备丝素蛋白纳米球， 工艺简单、 微球 产量较高、 粒径分布均匀并且尺寸可控， 方便。
19、选择最适合的微球大小用于载药等应用， 制备 过程为常温常压的温和过程， 避免了化学交联剂或者甲醇、 乙醇等变性剂的使用， 能够保持 丝素蛋白的生物相容性， 是一种制备丝素蛋白纳米微球的新方法。 0015 2、 采用密度低、 粘度小的环己烷作为有机相制备反相乳液， 避免采用石蜡或者植 物油类粘度大的有机相， 使搅拌时容易形成更小直径的微乳液， 从而获得纳米级的丝素蛋 白微球。 0016 3、 采用促使丝素蛋白结构转变的无毒多元醇类， 避免采用有毒的化学交联剂， 或 者甲醇、 乙醇等蛋白质变性剂， 能够保持丝素蛋白的生物相容性。 0017 4、 采用超声波震荡促凝的方法， 使丝素蛋白发生物理交联，。
20、 形成不溶于水的纳米 颗粒， 避免了有毒化学交联剂或者化学变性剂的使用。 0018 5、 采用高吸水性树脂， 在微乳液的状态下原位干燥， 从而能够保持丝素蛋白在微 乳液的纳米状态， 避免其后干燥过程中的相互粘连。 0019 6、 按本发明技术方案制备的丝素蛋白纳米球， 具有良好的生物相容性， 对人体无 毒、 无害、 无免疫原性。 这种不溶于水的纳米丝素蛋白颗粒由于粒径小， 分散性好， 可制成各 种化妆品、 护肤品、 防晒膏等 ； 由于制备过程采用常温常压、 无化学交联剂的温和技术， 可以 作为具有生物活性物质的载体， 装载酶、 核酸、 多肽、 蛋白质药物等 ； 同时， 由于丝素蛋白纳 米球直径。
21、小， 不粘连， 可以在血液中自由运行， 因此， 可作为针剂在疾病诊断和治疗中发挥 独特作用。 附图说明 0020 图 1 是本发明实施例提供的丝素蛋白纳米球的电子显微镜照片图。 具体实施方式 0021 下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步描述。 0022 实施例 1 将 100 g 家蚕生丝放入 5 L 质量浓度为 0.05% 的 Na2CO3水溶液中， 于 98-100oC 处理 30min， 重复 3 次， 使蚕丝脱胶， 充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维加入三元溶 液中 （由 CaCl2/ 水 / 乙醇摩尔比为 1:8:2 配成） 溶液中， 在 70oC 搅拌溶解成丝素蛋。
22、白混合溶 说 明 书 CN 102417733 A CN 102417743 A4/5 页 6 液。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中， 用去离子水透析 4 天， 以除去 CaCl2、乙醇等杂 质， 得到纯丝素蛋白溶液。 0023 以环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班， 司班加入量为环己烷的 1%wt， 搅拌溶解得到环 己烷 / 司班混合溶液。 0024 调节丝素溶液的质量浓度为 3%， 将丝素质量 10% 的多元醇乙二醇均匀加入丝素溶 液中。 0025 将丝素蛋白 / 多元醇混合溶液逐滴滴加入环己烷 / 司班混合溶液中， 同时开启超 声波震荡和搅拌， 直到滴加完毕后， 继续保持搅拌和超声波 50。
23、min。 0026 分 5 次加入高吸水性树脂， 总加入量为丝素蛋白溶液的 30%/wt， 每次加入 1/5 量， 保持搅拌和超声波 60min， 原位吸水干燥固化。 0027 过滤去除吸过水的高吸水性树脂。 0028 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到的下层丝素蛋白纳米颗粒加入水洗， 超声波 分散， 离心去除水洗液， 反复水洗 4 遍。 0029 水洗后的下层固体加入纯水， 超声波分散， 得到丝素蛋白纳米的分散液。 0030 水洗后的下层固体冷冻干燥， 得到丝素蛋白纳米粉末。 0031 经电镜观察检测， 该丝素蛋白纳米球呈圆形， 不粘连， 直径分布在 10 80nm， 平均 直径为 60。
24、nm， 不溶于水。 0032 实施例 2 将 0.1 公斤生丝放入 3 升质量浓度为 0.15的碳酸钠水溶液中， 于 98 100处理 2 小时， 使生丝脱胶， 充分洗涤后得到纯丝素纤维。 将晾干后的纯丝素纤维， 用1升浓度为9.0 摩尔/升的溴化锂溶液， 在605下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。 用纤维素膜为透析 材料， 将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析 3 天， 去除溴化锂等杂质， 得到纯丝素蛋 白溶液。 0033 以环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班， 司班加入量为环己烷的 0.75%wt， 搅拌溶解得 到环己烷 / 司班混合溶液。 0034 调节丝素溶液浓度为 3%， 将丝素质量 3。
25、0% 的丙三醇均匀加入丝素溶液中。 0035 将丝素蛋白 / 多元醇混合溶液逐滴滴加入环己烷 / 司班混合溶液中， 同时开启超 声波震荡和搅拌， 直到滴加完全后， 继续保持搅拌和超声波 30min。 0036 分 4 次加入高吸水性树脂， 加入总量为丝素蛋白溶液的 20%/wt， 每次加入 1/4 量， 保持搅拌和超声波 30min， 原位吸水干燥固化。 0037 过滤去除吸过水的高吸水性树脂。 0038 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到的下层丝素蛋白纳米颗粒加入水洗， 超声波 分散， 离心去除水洗液， 反复水洗 4 遍。 0039 水洗后的下层固体加入纯水， 超声波分散， 得到丝素蛋白。
26、纳米分散液。 0040 水洗后的下层固体冷冻干燥， 得到丝素蛋白纳米粉末。该丝素蛋白纳米球不溶于 水。 0041 参见附图 1， 它是本实施例提供的丝素蛋白纳米球的电子显微镜图 ； 由图 1 可以看 到， 该丝素蛋白纳米球呈圆形， 不粘连， 直径分布在 30 200nm， 平均直径为 110nm。 0042 实施例 3 说 明 书 CN 102417733 A CN 102417743 A5/5 页 7 将 200 克废蚕丝放入 8 升质量浓度为 0.05的碳酸钠水溶液中， 于 98 100处理 0.5 小时脱胶， 重复处理 3 次， 充分洗涤后得到纯丝素。将晾干后的纯丝素用 1 升摩尔比为 。
27、1 ： 8 ： 2的氯化钙、 水、 乙醇溶液， 在755下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。 用纤维素膜 为透析材料， 将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析 3 天， 得到纯的丝素蛋白溶液。 0043 以 80ml 环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班 0.4 克， 搅拌溶解得到环己烷 / 司班混合 溶液。 0044 调节丝素溶液浓度为 3.2%， 将丝素质量 30% 的丙三醇均匀加入丝素溶液中。 0045 将丝素蛋白 / 多元醇混合溶液逐滴滴加入环己烷 / 司班混合溶液中， 同时开启超 声波震荡和搅拌， 直到滴加完全后， 继续保持搅拌和超声波 20min。 0046 分 4 次加入总量 为 0.01。
28、 克的高吸水性树脂， 每次加入 1/4 量 （0.0025 克） ， 保持 搅拌和超声波 40min， 原位吸水干燥固化。 0047 过滤去除吸过水的高吸水性树脂。 0048 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到的下层丝素蛋白纳米颗粒加入水洗， 超声波 分散， 离心去除水洗液， 反复水洗 5 遍。 0049 水洗后的下层固体加入纯水， 超声波分散， 得到丝素蛋白纳米的分散液。 0050 水洗后的下层固体冷冻干燥， 得到丝素蛋白纳米粉末。 0051 经激光粒度仪检测， 该丝素蛋白纳米球直径分布在 100 200nm， 平均直径为 130nm， 不溶于水。 0052 实施例 4 将 0.5 公斤。
29、茧壳放入 25 升质量浓度为 0.5的中性皂溶液中， 于 98 100处理 2 小 时， 使茧壳脱胶， 充分洗涤后得到纯丝素。将晾干后的纯丝素， 用 2.5 升 9.2 摩尔 / 升的溴 化锂水溶液， 在 602搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。用纤维素膜为透析材料， 将所得的 丝素蛋白混合溶液用去离子水透析， 去除溴化锂等杂质， 得到纯的丝素蛋白溶液。 0053 以 80ml 环己烷为溶剂， 加入乳化剂司班 0.6 克， 搅拌溶解得到环己烷 / 司班混合 溶液。 0054 调节丝素溶液浓度为 5.7%， 将丝素质量 30% 的丁二醇均匀加入丝素溶液中。 0055 将丝素蛋白 / 多元醇混合溶液逐滴。
30、滴加入环己烷 / 司班混合溶液中， 同时开启超 声波震荡和搅拌， 直到滴加完全后， 继续保持搅拌和超声波 40min。 0056 分 4 次加入总量 0.02 克的高吸水性树脂， 每次加入 1/4 量 （0.005 克） ， 保持搅拌 和超声波 50min， 原位吸水干燥固化。 0057 过滤去除吸过水的高吸水性树脂。 0058 离心分离， 上层环己烷回收利用， 得到的下层丝素蛋白纳米颗粒加入水洗， 超声波 分散， 离心去除水洗液， 反复水洗 4 遍。 0059 水洗后的下层固体加入纯水， 超声波分散， 得到丝素蛋白纳米分散液。 0060 水洗后的下层固体冷冻干燥得到丝素蛋白纳米粉末。 0061 经激光粒度仪检测， 该丝素蛋白纳米球直径分布在10200nm， 平均直径为60nm， 不溶于水。 说 明 书 CN 102417733 A CN 102417743 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102417733 A 。