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1、(10)申请公布号 CN 102406683 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102406683 A *CN102406683A* (21)申请号 201110400264.2 (22)申请日 2011.12.06 A61K 36/28(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (71)申请人 中国科学院新疆理化技术研究所 地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 北京南路 40 号附 1 号 (72)发明人 阿吉艾克拜尔艾萨 张尧 信学雷 (74)专利代理机构 乌鲁木齐中科新兴专利事务 所 65106 代理人 张莉。
2、 (54) 发明名称 一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备 方法及用途 (57) 摘要 本发明涉及一种多靶点起效的菊苣降糖有效 部位的制备方法及用途， 该方法从毛菊苣中采用 有机溶剂提取， 大孔树脂分离纯化获得降糖有效 部位， 并阐明其医学用途， 经初步的活性筛选试验 证明 ： 通过本发明所述的方法获得的有效部位具 有蛋白酪氨酸磷酸酶 （PTP1B） 及醛糖还原酶 （AR） 抑制剂作用， 并有较好的抗氧化性作用， 可用于治 疗糖尿病的药物或保健品的应用， 以及作为治疗 糖尿病的药物组合物的应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 。
3、1 页 说明书 5 页 CN 102406686 A1/1 页 2 1. 一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法， 其特征在于按下列步骤进行 ： a、 先用极性溶剂20-50%浓度的甲醇或乙醇水溶液， 在温度60-溶剂沸点的条件下提 取菊苣地上部分 3 次， 每次提取时间 1-4h ； b、 将步骤 a 提取物浓缩， 用水或浓度 1 10% 甲醇或乙醇溶解分散， 加入预先处理好的 大孔树脂柱， 用水洗去杂质， 再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱， 收集 1%-60% 醇洗脱液， 浓缩 后即可得到多靶点起效的菊苣降糖有效部位。 2. 在根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 a 提取时固液。
4、比为 1:15-25。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 b 所用的大孔树脂型号为 HPD100、 HPD750、 X-5、 ADS-17、 D4020、 D140。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降 糖有效部位对蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 和醛糖还原酶具有抑制作用， 并具有抗氧化活性。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降 糖有效部位在制备治疗降糖的药物的用途。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降 糖有效部位在制备治疗降糖的功能性食。
5、品的用途。 权 利 要 求 书 CN 102406683 A CN 102406686 A1/5 页 3 一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途 技术领域 0001 本发明涉及菊苣中一种在多个作用靶点上起效的菊苣降糖有效部位的制备及其 用途， 具体的说是从毛菊苣中提取的活性成分， 作为治疗糖尿病药物及功能性食品的用途。 背景技术 0002 菊苣属于菊科， 菊苣属。此属植物有 10-12 种， 我国有 3 种， 新疆有毛菊苣 （Cichorium glandulosum Bioss. et Huet.） 和菊苣 （Cichorium intybus L.） 两种。菊苣 是一种用途广泛的。
6、植物， 意大利居民用菊苣叶做蔬菜沙拉， 味美可口， 除此之外， 菊苣更多 是具有很多药用价值。在我国民族药中， 菊苣和毛菊苣功效相近， 同作菊苣用药， 已被药典 收录， 其药用部分主要为地上部分、 根和种子。根据 新疆中草药记载 菊苣作为维吾尔族 习用药材有清热、 利尿、 利胆、 消炎的功能。主治黄疸性肝炎、 急性肾炎、 气管炎。 中国民族 药志 也描述菊苣有清热解毒、 利水消肿、 健胃之功效， 用于治疗肝火食少、 肾炎水肿、 胃脘 湿热胀痛和食欲不振。 已有研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶 1B（PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B） 是胰岛素信号转导过程中关。
7、键的负调控子， 是治疗 II 型糖尿病、 肥胖等疾病的重要靶点。 在新生肝细胞中， PTP1B 的减少增加了 IRA/GLUT2 复合物， 从而增加葡萄糖的吸收。在肝 脏中特异性删除 PTP1B 基因， 可以改善代谢综合症的状况和削弱饮食引起的内质网压力 , Ali MI 等人的研究也指出删除 PTP1B 基因后会明显改善肥胖且瘦素抵抗的小鼠的外周胰 岛素抵抗和动脉血管功能。另外， PTP1B 在脂代谢紊乱的调节方面也显示出重要的作用 ： 当 PTP1B 的大量表达时， 出现胰岛素、 瘦素抵抗及促使载脂蛋 B100 (apoB100) 分泌增加， 血浆 极低密度脂蛋白 (VLDL) 生成增多 。
8、, 而在抑制了 PTP1B 的表达后， 高碳水化合物诱导的胰岛 素抵抗及与之相关的脂代谢紊乱也受到抑制， 细胞内 PTP1B 蛋白含量减少的同时 apoB100 的分泌也有所降低。因此 PTP1B 不仅重要的糖尿病治疗成分的靶点， 同时也是脂代谢紊乱 的治疗靶点之一。 0003 醛糖还原酶 （AR, Aldose reductase） 存在于许多组织中， 为多醇途径之限速酶。 大量研究表明 ： 醛糖还原酶过度活跃是糖尿病患者产生多种并发症的原因。醛糖还原酶 AR 在高血糖时被激活， 催化葡萄糖大量转化为不宜透过细胞膜的山梨醇， 致使山梨醇在一些 组织中大量蓄积， 影响细胞渗透压调节， 引起细胞。
9、水肿、 破裂以及功能障碍， 干扰细胞正常 代谢， 从而产生病变。一方面渗透压上升， 引起血管、 神经、 肾、 视网膜、 晶状体等组织水肿， 进而发展至基质变化。另一方面， 可能引发白内障、 视网膜病变、 肾功能不全及肾小球基底 膜增厚等糖尿病慢性并发症。因此它也是糖尿病及其并发症研究中的一个重要靶点。 0004 在国内外研究的已相当多的研究证实菊苣具有降血糖功能。 北京中医药大学中药 学院研制了菊苣胶囊， 张冰等发现菊苣胶囊可以显著降低临床病人的血糖， 胆固醇， 甘油三 酯。郑红梅等从组织形态学上阐述了菊苣双降胶囊药理作用机理， 她认为菊苣双降胶囊能 降糖作用与修复胰岛 细胞和胰外途径特别是促。
10、进肝糖原合成， 抑制糖异性有关， 另外还 推测， 菊苣双降胶囊可能直接影响糖代谢， 且其降糖作用与抑制肠道对葡萄糖的吸收有关。 说 明 书 CN 102406683 A CN 102406686 A2/5 页 4 并且将菊苣降血糖和降血脂的有效部位进一步缩小， 通过对大鼠药理实验， 发现菊苣正己 烷提取物能降低四氧嘧啶大鼠血糖， 对其胰岛素水平无显著影响， 能降低高血脂大鼠血清 总胆固醇、 总甘油三脂、 低密度脂蛋白含量， 并能显著降低其全血粘度、 血浆粘度、 血浆纤维 蛋白原含量。 0005 Meehye Kim 等人用 SD 鼠模型实验证明菊苣提取物能降低血清中的 HDL/LDL ， 升 。
11、高载脂蛋白 B/ 载脂蛋白 A-1。因此菊苣提取物能改善脂类代谢， 从而改善胆固醇的吸收和 合成。 Muthusamy等人证明， 在 3T3-L1 脂肪细胞中， 菊苣提取物显著改善了葡萄糖吸收， 并 且有剂量依赖性。同时菊苣提取物具有在不诱导脂肪合成的情况下降血糖的特性。Tousch D 等的体外实验证明菊苣酸影响葡萄糖吸收和胰岛素分泌， 既改善了胰岛素受体的敏感性， 又促进了胰岛素分泌。 0006 Pushparaj PN 提出菊苣全草 80% 乙醇提取物对链脲霉素诱导的糖尿病鼠有治疗 效果， 并推测其是通过抑制肝脏 G-6-Pase 来降低血糖。 高云艳等采用四氧嘧啶高血糖模型大鼠、 观察。
12、菊苣不同提取物对模型动物血糖、 血总 胆固醇 （TC） 及总甘油三酯 （TG） 的影响。结果得出菊苣醇提物对模型降低血糖、 血 TC 及 TG 方面疗效优于水煮醇沉提取物。 0007 发明专利申请号 201010592705.9 菊苣降糖有效部位的制备方法及应用， 描述了 一种菊苣有效部位的制备方法。其方法是首先用 20-95% 浓度的甲醇或乙醇水溶液或无 水甲醇或无水乙醇， 在温度 20 - 溶剂沸点的条件下提取菊苣地上部分， 其次将提取物浓 缩， 用水或浓度 1 20% 甲醇或乙醇溶解分散， 分别加入预先处理好的 HPD600、 HPD450、 NKA-9、 D201、 D301、 HPD。
13、300、 AB-8 型大孔树脂柱， 以水， 10%， 30%,95% 的甲醇或乙醇溶液梯度 洗脱， 收集 30-95% 流出液浓缩后即可得到具有降血糖活性的有效部位。其有效部位的具 有蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 的抑制作用。而本发明是以极性溶剂 20-50% 浓度的甲醇或乙醇 水溶液， 在温度 60 - 溶剂沸点的条件下提取菊苣地上部分。因此本发明与以前的不同在 于， 首先提取方面主要集中在强极性的物质， 缩小了有效部位的范围， 并且主要集中在耐高 温的有效物质的提取。其次， 本发明中纯化所用的大孔树脂型号为 HPD100、 HPD750、 X-5、 ADS-17、 D4020、 D140， 因此。
14、纯化后得到的有效部位与发明专利申请号 201010592705.9 有所 不同。并且在洗脱时， 主要用 60% 以下的乙醇水溶液进行洗脱， 洗脱范围较发明专利申请号 201010592705.9有所缩小， 洗脱下来的物质以大极性和中极性居多。 再次， 纯化得到的部分 不但对蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 具有抑制作用， 并有较强的醛糖还原酶抑制率和抗氧化活 性， 是一个对多靶点起效的菊苣降糖有效部位。 发明内容 0008 本发明目的在于， 提供一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途， 该方法从菊苣中采用有机溶剂提取， 大孔树脂分离纯化获得降糖有效部位， 并阐明其医学 用途， 经初步的活性筛。
15、选试验证明 ： 通过本发明所述的方法获得的有效部位具有蛋白酪氨 酸磷酸酶 （PTP1B） 和醛糖还原酶 （AR） 抑制剂作用， 并具有较好的抗氧化活性， 可用于治疗 糖尿病的药物或保健品的应用， 以及该有效部位作为药物组合物的应用。 0009 本发明所述的多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法， 按下列步骤进行 ： a、 先用极性溶剂20-50%浓度的甲醇或乙醇水溶液， 在温度60-溶剂沸点的条件下提 说 明 书 CN 102406683 A CN 102406686 A3/5 页 5 取菊苣地上部分 3 次， 每次提取时间 1-4h ； b、 将步骤 a 提取物浓缩， 用水或浓度 1 10%。
16、 甲醇或乙醇溶解分散， 加入预先处理好的 大孔树脂柱， 用水洗去杂质， 再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱， 收集 1%-60% 醇洗脱液， 浓缩 后即可得到多靶点起效的菊苣降糖有效部位。 0010 步骤 a 提取时固液比为 1:15-25。 0011 步骤 b 所用的大孔树脂型号为 HPD100、 HPD750、 X-5、 ADS-17、 D4020、 D140。 0012 通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位对蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 和 醛糖还原酶具有抑制作用， 并具有抗氧化活性。 0013 通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的药物的用 途。 0014 通过该方。
17、法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的功能性食 品的用途。 具体实施方式 0015 实施例 1 取毛菊苣地上部分 300g， 粉碎， 置于 10L 提取罐， 用浓度 40% 乙醇水溶液在温度 80下 提取 3 次， 每次时间为 3 小时， 固液比为 1:25， 合并提取液 ； 将提取液浓缩， 得到 27.6g 具有降糖活性的有效部位， 再将浓缩的提取物加入浓度为 10% 的乙醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂 HPD100 柱中吸附， 用水清洗除杂 后， 再用乙醇水溶液梯度洗脱， 收集 10-60% 乙醇洗脱液， 浓缩后即可得到 3.3g 多靶点起效 的菊苣降糖有效部位。
18、。 0016 实施例 2 取毛菊苣地上部分 500g， 粉碎， 置于 10L 提取罐， 用浓度 50% 甲醇水溶液在温度 60下 提取 3 次， 每次时间为 1 小时， 固液比为 1:20， 合并提取液 ； 将提取液浓缩， 得到 41g 具有降糖活性的有效部位， 再将浓缩后的提取液加入浓度为 1% 的甲醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂 ADS-17 柱中吸附， 用水除杂后， 再 用甲醇水溶液梯度洗脱， 60% 甲醇洗脱， 收集流出液， 浓缩后即可得到 5.27g 多靶点起效的 菊苣降糖有效部位。 0017 实施例 3 取毛菊苣地上部分500g， 粉碎， 置于10L提取罐， 用浓度7。
19、0%乙醇水溶液提取， 加热至温 度 70提取 3 次， 每次 2h， 固液比为 1:15， 合并提取液 ； 将提取液浓缩， 得到 32g 具有降血糖活性的有效部位， 再将浓缩后的提取液加入浓度 5% 的乙醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂 D4020 柱中吸附， 用水除杂后， 再用 乙醇水溶液梯度洗脱， 收集 10-60% 乙醇流出液， 浓缩后即可得到 4.49g 多靶点起效的菊苣 降糖有效部位。 0018 实施例 4 取毛菊苣地上部分 1.8kg， 粉碎， 置于 50L 提取罐， 用浓度为 40% 乙醇水溶液提取， 加热 至溶剂沸点提取 3 次， 每次 3h， 固液比为 1:25，。
20、 合并提取液 ； 将提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩， 得到 191.52g 具有降糖活性的有效部位， 再 说 明 书 CN 102406683 A CN 102406686 A4/5 页 6 将浓缩后的提取液加入浓度 10% 的乙醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂柱 HPD100 中吸附， 用水除杂后， 再用 10-60% 乙醇溶液梯度洗脱， 收集洗脱液， 浓缩后即可得到 25.54g 多靶点起效的菊苣降糖有效部位。 0019 实施例 5 取毛菊苣地上部分 300g， 粉碎， 置于 10L 提取罐， 用浓度 50% 的甲醇的水溶液， 在温度 80提取 3 次， 每次 3h， 固液比为。
21、 1:20， 合并提取液 ； 将提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩， 得到 31.38g 具有降糖活性的有效部位， 加入浓 度 8% 的乙醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂 HPD750 柱中吸附， 用水洗去杂 质， 再用乙醇水溶液梯度洗脱， 收集10-60%乙醇洗脱液， 浓缩后即可得到3.62g多靶点起效 的菊苣降糖有效部位。 0020 实施例 6 取毛菊苣地上部分 1.5Kg， 粉碎， 置于 50L 提取罐， 用浓度 40% 的乙醇水溶液， 在温度 80提取 3 次， 每次 4h， 固液比为 1:25， 合并提取液 ； 将浓缩后的提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩， 得到 156.9g 。
22、具有降糖活性的有效部 位， 加入浓度 10% 的乙醇水溶液溶解分散， 加入预先处理好的大孔树脂柱 X-5 中吸附， 再用 乙醇溶液梯度洗脱， 收集 10-60% 乙醇洗脱液， 浓缩后即可得到约 20.4g 多靶点起效的菊苣 降糖有效部位。 0021 实施例 7 ： 筛选实验 ： 蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B（PTP1B） 筛选方法 ： 用对 - 硝基苯基磷酸二钠 (pNPP) 作为底 物， 以在阳性药物钒酸钠为对照， 利用酶标仪进行蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B （PTP1B） 抑制剂的 高通量筛选， 根据蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B（PTP1B） 水解 pNPP 的磷酸基团而产生颜色反应 来测定蛋白质酪氨。
23、酸磷酸酶 1B（PTP1B） 的活性 ； 酶反应体系组成如下 ： 缓冲液 (50 mM 羟 乙基哌嗪乙硫磺酸, pH 7.3, 100 mM 氯化钠, 0.1 % 牛血清白蛋白, 和 1 mM 二硫代苏 糖醇 )， 蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 融合蛋白， pNPP， 蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 特异抑制剂钒酸 钠 （100 g mL) ； 反应体系混匀后在温度 37放置 30 分钟， 置比色仪上测定 405 波长条 件下的吸收值 (A)， 测定结果减去本底值后计算酶活性。 0022 实施例 8 醛糖还原酶 （AR） 筛选方法 ： 缓冲液为 0.1M 磷酸钠缓冲液， pH 7.0， 用 0.15mM。
24、 烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADPH） 和 5mM DL- 甘油醛作为底物， 以在阳性药物依帕司他为对照， 根据醛糖还原酶 （AR） 水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADPH） 的磷酸基团而产生烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸 （NAD） 改变吸光度来测定其活性， 反应体系混匀后在温度 37放置 10 分 钟， 置酶标仪上测定 340nm 波长条件下的吸收值， 测定结果减去本底值后计算酶活性， 每个 样品测定若干个浓度的抑制率， 计算出半数抑制率 (IC50)。 0023 实施例 9 2 ,2- 联氮 - 二 (3- 乙基 - 苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐 （ABTS） 抗氧化活性测定 ：。
25、 将 5 mL 的 2 ,2- 联氮 - 二 (3- 乙基 - 苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐 ABTS(19.2mg) 与 88uL 的 7 mmoL/L 的过硫酸钾 （3.3mg） 混合， 在室温， 避光的条件下静置过夜， 形成 2 ,2- 联氮 - 二 (3- 乙基 - 苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐自由基储备液， 使用前用无水乙醇稀释成工作液， 要 求其在 30， 734 nm 波长下的 吸光度为 0.7 0.02 ； 说 明 书 CN 102406683 A CN 102406686 A5/5 页 7 取不同浓度的样品液 16L， 加入 184L 的 ABTS 溶液， 准确振。
26、 30 秒， 在温度 20下测 定反应液在 734 nm 处 6 min 内的吸光值， 实验以 vc 为阳性对照， 设试剂空白， 样品空白和 样品实验组 ； 抑制率 Ao At B/ Ao100% 其中， Ao 为未加样品的 ABTS 的吸光值 ； At 为样品与 ABTS 反应后的吸光值 ； B 为样品空 白的吸光值。 0024 实验各组分活性筛选结果 ： 本发明所述的一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途， 通过该方法获 得的有效部位经筛选对蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 和醛糖还原酶具有抑制作用， 并具有抗氧 化活性， 其结果见表 ： 结论 ： 从实验结果表明， 菊苣活性部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 和醛糖还原酶抑制剂功效， 并有较强的抗氧化性。 说 明 书 CN 102406683 A 。