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1、(10)申请公布号 CN 102396652 A (43)申请公布日 2012.04.04 CN 102396652 A *CN102396652A* (21)申请号 201110346657.X (22)申请日 2011.11.07 A23K 1/18(2006.01) A23K 1/165(2006.01) (71)申请人 宝鸡市星星协力生物有限公司 地址 721006 陕西省宝鸡市创业路 3 号中盛 大厦 4 楼 (72)发明人 王刚 刘丽 李冬梅 (74)专利代理机构 宝鸡市新发明专利事务所 61106 代理人 李凤岐 (54) 发明名称 一种水产动物用复合酶制剂及其制备工艺 (57)。
2、 摘要 一种水产动物用复合酶制剂及其制备工艺， 所述复合酶制剂包含 ： 中性蛋白酶酶活 5000 7000u/g， 甘露聚糖酶酶活 2000 3000u/g， 木聚 糖酶酶活 3000 4000u/g， 纤维素酶酶活 2000 3000u/g。 所述制备工艺采用以两种耐高温高产菌 株混合发酵技术制备。 本发明制备工艺简单可控， 更易操作， 且所得产品不但产酶能力增强， 而且所 产酶的耐高温特性增强， 完全可以耐受水产饲料 生产时的调质温度， 保持较高的活性 ； 可降低、 消 除抗营养因子引起的食糜粘度增加及纤维素屏障 作用， 补充内源消化蛋白酶的不足， 有助高蛋白水 产料的消化吸收， 降低水产。
3、动物粪便中养分含量， 减少对水体的污染， 改善水质 ； 提高动物生产性 能， 降低饵料系数， 降低养殖成本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 102396652 A1/1 页 2 1. 一种水产动物用复合酶制剂， 其特征是所述复合酶制剂包含 ： 中性蛋白酶酶活 5000 7000u/g， 甘露聚糖酶酶活 2000 3000u/g， 木聚糖酶酶活 3000 4000u/g， 纤维素 酶酶活 2000 3000u/g。 2. 一种权利要求 1 所述的水产动物用复合酶制剂的制备工艺， 其特征是包括下述步 骤。
4、 ： 第一步 ： 对产中性蛋白酶、 纤维素酶的米曲霉菌种以及产木聚糖酶、 甘露聚糖酶的黑曲 霉菌种进行紫外线照射诱变， 筛选出耐高温高产菌株后保藏， 并对保藏的菌种传代 ； 第二步 ： 将保藏的米曲霉菌种、 黑曲霉菌种分别接种在麦芽汁琼脂培养基斜面上， 置于 恒温培养箱中， 30培养 76h-82h， 待斜面长满菌丝并长满孢子后， 加入适量的无菌水分别 洗下孢子， 制成米曲霉一级种子悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液 ； 第三步 ： 取豆粕 65 75wt， 麦麸 20 30wt， 硫酸铵 2 5wt， 磷酸二氢钾 1 1.5wt混合均匀制成固体培养基料 ； 第四步 ： 取适量固体培养基料装入容器中。
5、， 按料水重量比 1 1.0 1.3 的比例加水 混匀， 121灭菌 30min 后冷却制成固体培养基 ； 然后按固体培养基料 5 10wt的比例在 固体培养基上分别接种米曲霉一级种子悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液， 置于恒温培养箱 中， 30培养 85 87h， 待培养基表面长满孢子后， 加入适量的无菌水分别洗下孢子， 制成 米曲霉二级种子悬浮液和黑曲霉二级种子悬浮液 ； 第五步 ： 取豆粕6070wt， 麦麸2030wt， 稻壳粉510wt， 硫酸铵23wt， 磷酸二氢钾 1 1.5wt， 硫酸镁 0.15 0.2wt混合均匀制成发酵培养基料 ； 第六步 ： 在发酵培养基料中按料水重量比 2。
6、.5 1 的比例加水混匀， 121灭菌 30min 后冷却制成发酵培养基 ； 然后按发酵培养基料 15 20wt的比例分别将米曲霉二级种子 悬浮液和黑曲霉二级种子悬浮液均匀喷洒在发酵培养基中， 搅拌均匀后装入曲盘进行发 酵， 发酵温度 28 32， 相对湿度 75 80， 发酵时间 84 96h ； 第七步 ： 将发酵结束形成的固体基质， 在 45 50下低温气流干燥至含水量 8 10， 然后粉碎后包装成成品。 权 利 要 求 书 CN 102396652 A1/5 页 3 一种水产动物用复合酶制剂及其制备工艺 技术领域 0001 本发明属于饲料添加剂技术领域， 具体涉及一种水产动物用复合酶制。
7、剂及其制备 工艺。 背景技术 0002 鱼、 虾类水产动物对蛋白质的需求较陆生动物高， 蛋白质水平一般要求在 25 50之间， 所以水产饲料蛋白质含量都很高， 而水产动物内源性蛋白酶往往不能充分利用 蛋白质， 加入外源性蛋白酶后， 可弥补内源性蛋白酶的不足， 提高蛋白质吸收率 10左右， 在节约蛋白质同时减少对环境的污染。同时鱼、 虾等水生动物的消化道与其它动物有较大 区别， 消化道较短， 食物在消化道停留的时间短， 消化吸收率差 ； 而且众多水生动物没有胃， 消化道 pH 在 6.8 7.2 之间， 需要合适 PH 值的蛋白酶才能发挥水解蛋白质的作用， 提高饲 料消化利用率。 另外， 常规饲。
8、料原料如玉米、 麦类、 饼粕类等都存在一定量的抗营养因子， 最 多的就是非淀粉多糖， 有的甚至占到了整个原料的四分之一， 要分解这些抗营养因子， 就必 须依靠添加非淀粉多糖酶 ： 如木聚糖酶、 纤维素酶、 甘露聚糖酶等。 0003 由于水产动物消化系统的特殊性， 水产饲料的加工需要采用定型和制粒工艺， 但 制粒过程中的高温 ( 一般为 80 ) 会造成大部分酶蛋白失活， 活性下降 50 80， 甚至无 效果。所以， 如何提高饲用水产复合酶的耐受温度也是一个急需解决的问题。 发明内容 0004 本发明解决的技术问题 ： 提供一种水产动物用复合酶制剂及其制备工艺， 以两种 菌株混合发酵技术制备水产。
9、动物饲用复合酶制剂， 且采用该方法制备的水产动物饲用复合 酶制剂， 不但产酶能力增强， 而且所产酶的耐高温特性增强， 可以耐受水产饲料生产时的调 质温度， 提高水产动物对饲料养份的利用效率， 尤其是蛋白质的利用率， 减少氮、 磷排泄量， 降低水环境的污染， 促进水产动物健康生产， 提高水产养殖业的经济效益和生态效益。 0005 本发明采用的技术解决方案 ： 0006 一种水产动物用复合酶制剂包含 ： 中性蛋白酶酶活 5000 7000u/g， 甘露聚糖酶 酶活 2000 3000u/g， 木聚糖酶酶活 3000 4000u/g， 纤维素酶酶活 2000 3000u/g。 0007 其中， 00。
10、08 中性蛋白酶的作用机理 ： 将大分子蛋白质水解为小分子肽或氨基酸等产物， 以利 于蛋白质的有效吸收和利用。 0009 甘露聚糖酶的作用机理 ： 将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚 糖， 不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用， 同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中 起着重要的调节作用。 0010 木聚糖酶的作用机理 ： 可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖， 使木聚糖的黏性和持 水性大大下降， 从而消除木聚糖的抗营养作用。 0011 纤维素酶的作用机理 ： 将纤维素分解为葡萄糖， 消除其抗营养作用， 调节肠道菌群 说 明 书 CN 102396652 A2/5 页 4 平衡， 增强动物。
11、生产性能。 0012 所述水产动物用复合酶制剂的制备工艺， 包括下述步骤 ： 0013 第一步 ： 对产中性蛋白酶、 纤维素酶的米曲霉菌种以及产木聚糖酶、 甘露聚糖酶的 黑曲霉菌种进行紫外线照射诱变， 筛选出耐高温高产菌株后保藏， 并对保藏的菌种传代 ； 0014 第二步 ： 将保藏的米曲霉菌种、 黑曲霉菌种分别接种在麦芽汁琼脂培养基斜面上， 置于恒温培养箱中， 30培养 76h-82h， 待斜面长满菌丝并长满孢子后， 加入适量的无菌水 分别洗下孢子， 制成米曲霉一级种子悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液 ； 0015 第三步 ： 取豆粕 65 75wt， 麦麸 20 30wt， 硫酸铵 2 5wt。
12、， 磷酸二氢钾 1 1.5wt混合均匀制成固体培养基料 ； 0016 第四步 ： 取适量固体培养基料装入容器中， 按料水重量比11.01.3的比例加 水混匀， 121灭菌 30min 后冷却制成固体培养基 ； 然后按固体培养基料 5 10wt的比例 在固体培养基上分别接种米曲霉一级种子悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液， 置于恒温培养 箱中， 30培养 85 87h， 待培养基表面长满孢子后， 加入适量的无菌水分别洗下孢子， 制 成米曲霉二级种子悬浮液和黑曲霉二级种子悬浮液 ； 0017 第五步 ： 取豆粕 60 70wt， 麦麸 20 30wt， 稻壳粉 5 10wt， 硫酸铵 2 3wt， 磷酸。
13、二氢钾 1 1.5wt， 硫酸镁 0.15 0.2wt混合均匀制成发酵培养基料 ； 0018 第六步 ： 在发酵培养基料中按料水重量比 2.5 1 的比例加水混匀， 121灭菌 30min后冷却制成发酵培养基 ； 然后按发酵培养基料1520wt的比例分别将米曲霉二级 种子悬浮液和黑曲霉二级种子悬浮液均匀喷洒在发酵培养基中， 搅拌均匀后装入曲盘进行 发酵， 发酵温度 28 32， 相对湿度 75 80， 发酵时间 84 96h ； 0019 第六步 ： 将发酵结束形成的固体基质， 在 45 50下低温气流干燥至含水量 8 10， 然后粉碎后包装成成品。 0020 本发明具有的优点和效果 ： 00。
14、21 1、 本发明水产动物饲用复合酶制剂可降低、 消除抗营养因子引起的食糜粘度增加 及纤维素屏障作用， 补充内源消化蛋白酶的不足， 有助高蛋白水产料的消化吸收， 降低水产 动物粪便中养分含量， 减少对水体的污染， 改善水质 ； 提高动物生产性能， 降低饵料系数， 降 低养殖成本。 0022 2、 本发明采用两种菌株混合发酵技术制备， 制备工艺简单可控， 更易操作。 0023 3、 本发明采用耐高温高产菌株为原种， 不但产酶能力增强， 而且所产酶的耐高温 特性增强， 完全可以耐受水产饲料生产时的调质温度， 保持较高的活性。 具体实施方式 0024 第一步 ： 对产中性蛋白酶、 纤维素酶的米曲霉菌。
15、种以及产木聚糖酶、 甘露聚糖酶的 黑曲霉菌种进行紫外线照射诱变， 筛选出耐高温高产菌株后保藏， 并对保藏的菌种传代 ； 0025 第二步 ： 将保藏的米曲霉菌种、 黑曲霉菌种分别接种在麦芽汁琼脂培养基斜面上， 置于恒温培养箱中， 30培养 76h-82h， 待斜面长满菌丝并长满孢子后， 加入适量的无菌水 分别洗下孢子， 制成米曲霉一级种子悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液 ； 0026 第三步 ： 取豆粕70wt， 麦麸26wt， 硫酸铵3wt， 磷酸二氢钾1wt混合均匀制 成固体培养基料 ； 说 明 书 CN 102396652 A3/5 页 5 0027 第四步 ： 取第三步制备的固体培养基料2。
16、0g装入300ml三角瓶中， 加水25ml混匀， 121灭菌 30min 后冷却制成固体培养基 ； 然后在固体培养基上分别接种米曲霉一级种子 悬浮液和黑曲霉一级种子悬浮液各 1.5ml， 置于恒温培养箱中， 30培养 86h， 待培养基表 面长满孢子后， 加入适量的无菌水分别洗下孢子， 制成米曲霉二级种子悬浮液和黑曲霉二 级种子悬浮液 ； 0028 第五步 ： 取豆粕 65wt， 麦麸 22wt， 稻壳粉 9wt， 硫酸铵 2.3wt， 磷酸二氢钾 1.5wt， 硫酸镁 0.2wt混合均匀制成发酵培养基料 ； 0029 第六步 ： 取第五步制备的发酵培养基料 50kg 按料水重量比 2.5 1。
17、 的比例加水 20kg 混匀， 121灭菌 30min 后冷却制成发酵培养基 ； 分别取米曲霉二级种子悬浮液和黑曲 霉二级种子悬浮液各 0.75-1L 均匀喷洒在发酵培养基中， 搅拌均匀后装入曲盘进行发酵， 发酵温度 28 32， 相对湿度 75 80， 发酵时间 84 96h ； 0030 第六步 ： 将发酵结束形成的固体基质， 在 45 50下低温气流干燥至含水量 8 10， 然后粉碎后包装成成品。 0031 经测定所得产品包含 ： 中性蛋白酶酶活 5560u/g， 甘露聚糖酶酶活 2300u/g， 木聚 糖酶酶活 3300u/g， 纤维素酶酶活 2500u/g。 0032 所得产品对水产。
18、饲料蛋白质及能量消化率的影响试验 0033 一、 试验饲料 ： 共配制 2 组试验饲料， 在基础饲料中添加 0.07的本发明所得产品 为复合酶制剂组， 不添加本发明的基础饲料为对照组， 饲料配方和营养成分见表 1， 饲料原 料经粉碎过 40 目筛， 经双螺杆制粒机制成直径 1.5mm 的颗粒， 制好的饲料存放于冰箱中备 用。 0034 表 1 基础日粮配方 说 明 书 CN 102396652 A4/5 页 6 0035 0036 二、 试验用水产动物 ： 试验用健康草鱼平均体长15cm， 平均体重约32.7g。 选用240 尾健康草鱼， 随机分为 2 组， 每组 4 个重复， 每个重复 30。
19、 尾， 分别饲喂两组试验饲料。 0037 三、 试验饲养管理 ： 试验鱼放养期间用 10mg/kg 的高锰酸钾溶液浸泡鱼缸 3 小时， 再用清水冲洗两次。放养后用 20ppm 甲醛溶液消毒， 每逢下雨天消毒 1 次。每天喂料 3 次， 试验前 23 天， 日投喂量为体重的 1.2， 试验后 20 天， 日投喂量为体重的 3。每次喂料后 观察鱼的采集情况， 一般 30 分钟内鱼能吃完料， 摄食后 3.5 4h 开始排粪。实验用水族箱 为圆桶状， 容积 0.3m3， 水深约 0.6m， 采用循环过滤系统饲养， 持续充氧， 饲养期 46 天， 期间 PH 在 7.5 左右， 水温 20 28， 水中。
20、溶氧 8mg/L， 氨氮含量 0.2mg/L. 0038 四、 样品收集 ： 于投喂饲料的第 23 天开始用虹吸法收集粪便于塑料盆中， 将水全 部沥干后移至表面皿中， 置烘箱中以 105烘干后置于干燥器中保存， 收粪 3 周。 0039 五、 测定指标与方法 ： 饲养开始与结束分别称每箱鱼体重， 在饲养期记录每日的投 饵量， 计算增重率和饲料系数。 饲料常规营养成分按国标方法测定， 能量用半自动氧弹式测 热计进行测定。 0040 增重率 ( ) 总鱼体净重 / 初始体重 100 ； 0041 饲料系数总饲料摄入量 / 总鱼体净增重 ； 0042 表观消化率 (1- 粪便中养分含量 / 粪便中指。
21、示剂含量 饲料中指示剂含量 / 饲料中养分含量 )100 ； 0043 表 2 草鱼的增重率和饲料系数 说 明 书 CN 102396652 A5/5 页 7 0044 0045 由表 2 可见， 本发明的水产动物用复合酶制剂添加于水产饲料中， 草鱼增重率高 于对照组， 饲料系数低于对照组， 增重和饲料利用率分别提高 22.2和 19.9。 0046 表 3 草鱼对两组饲料的能量和粗蛋白表观消化率 0047 蛋白质消化率 ( ) 总能消化率 ( ) 对照组 73.02.47 40.11.38 复合酶组 81.91.74 53.82.39 P 0.25 0.003 0048 由表 3 可见， 蛋白质表观消化率添加复合酶制剂组比对照组高 10.86， 能量消化 率添加复合酶制剂组比对照组高 34.2 0049 通过实验可以看出， 本发明的水产动物用复合酶制剂在应用效果上表现为可显著 提高水产饲料中粗蛋白质的消化吸收率， 提高饲料能值， 提高水产动物生产性能， 降低饲料 系数， 减少水体污染。 说 明 书 。