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1、(10)申请公布号 CN 102618504 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618504 A *CN102618504A* (21)申请号 201110426171.7 (22)申请日 2011.12.19 CCTCC No.v201139 2011.12.07 C12N 7/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 杨占秋 凌佳馨 李金林 鲁力 张一卉 刘东瀛 刘媛媛 。
2、罗凡 熊海蓉 侯炜 肖红 王继麟 张云 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 薛玲 (54) 发明名称 一种肾综合征出血热双价疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种肾综合征出血热疫苗及其 制备方法。该疫苗是汉坦病毒 （Hantaviruses） HV004 株 的 灭 活 病 毒， 其 保 藏 号 为 ： CCTCCNo. v201139。用该灭活病毒， 可以有效防治肾综合 征出血热 （HFRS） 。此外， 本发明还公开了一种 双价疫苗， 其包括灭活病毒 HV004 和汉坦病毒 Hubei- 株。实验表明该双价疫苗具有显著防治。
3、 HFRS 的效果。本发明还提供了上述疫苗的制备方 法， 包括病毒的增殖以及灭活纯化等步骤。 本发明 为 HFRS 的防治提供了有效途径， 对控制该病的流 行具有重要作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 汉坦病毒 （Hantaviruses） HV004 株， 其保藏号为 ： CCTCC No. v201139。 2. 权利要求 1 所述病毒在制备肾综合征出血热疫苗中。
4、的应用。 3. 权利要求 1 所述病毒制备的疫苗。 4. 根据权利要求 3 所述的疫苗， 其包括权利要求 1 所述的灭活病毒 HV004 和佐剂。 5. 一种双价疫苗， 其包括权利要求 1 所述的灭活病毒 HV004 以及汉坦病毒 Hubei- 株。 6.一种制备权利要求3或4所述疫苗的方法， 其特征在于， 将权利要求1所述病毒在乳 鼠脑组织连续传代， 收获 8 代以内发病鼠脑， 研磨成匀浆， 经灭活纯化处理， 即得。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 将发病鼠脑研磨成匀浆后， 取上清加硫酸 鱼精蛋白至终浓度为 1mg/ml， 经蔗糖密度梯度区带离心 11 万 g 离心 2.。
5、5h， 取在 30% 与 45% 以及 45% 与 60% 之间一条明亮的带， 用逐滴加入 10%W/V BPL， 使其最终浓度为 1/4000， 加入 10%V/V Al(OH)3胶体佐剂。 8.一种制备权利要求5所述双价疫苗的方法， 其特征在于， 将权利要求1所述病毒和分 别在乳鼠脑组织连续传代， 收获发病鼠脑， 研磨成匀浆， 等量混合， 经灭活纯化处理， 即得。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 将发病鼠脑研磨成匀浆后， 取上清加硫酸 鱼精蛋白至终浓度为 1mg/ml， 经蔗糖密度梯度区带离心 11 万 g 离心 2.5h， 取在 30% 与 45% 以及 45% 与 。
6、60% 之间一条明亮的带， 用逐滴加入 10%W/V BPL， 使其最终浓度为 1/4000， 加入 10%V/V Al(OH)3胶体佐剂。 权 利 要 求 书 CN 102618504 A 2 1/6 页 3 一种肾综合征出血热双价疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及到一种新的汉坦病毒 （Hantavirus） ， 以及由该病毒制备的肾综合征出 血热的双价疫苗， 本发明还涉及该疫苗的制备方法。 背景技术 0002 肾综合征出血热 （hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS） 是由汉坦病 毒 （Hantaviruses） 引起的经啮齿类。
7、动物传播的自然疫源性疾病， 具有地区性、 爆发性、 周期 性、 易变性的流行特点。我国 HFRS 疫区已从 80 年代 600 多个县市扩大到现在 1300 多个县 市， 疫区类型亦发生改变 ； 在国外， 新型疫区也在不断扩大和演变。人通过气溶胶吸入、 伤 口、 消化道等途径感染病毒而发病。该病死亡率高， 危害性大。我国是汉坦病毒感染影响最 严重的国家， 在过去十年中每年报道的 HFRS 病例达到 25,000 至 60,000 例， 占世界发病人 数的 90以上。疫苗预防是目前唯一有效控制 HFRS 的手段。1978 年韩国李镐汪首先分离 到 HFRS 病毒后， 我国自 1981 1982 。
8、年先后从黑线姬鼠和褐家鼠体内分离到 HFRS 病毒， 各地亦从不同动物和人体分离到许多病毒株。 对HFRS疫区病毒型别进行鉴定， 80年代前为 汉滩型 （HTN 型） 疫区， 之后又出现汉城型 （SEO 型） 且两型并存， 2003 年又报道有普马拉型 （PUU 型） 出现。病毒的成功分离为疫苗的开发奠定了基本条件， 我国已批准生产的灭活疫 苗包括地鼠肾细胞疫苗 （型， SEOV， L99 株） 、 沙鼠肾细胞疫苗 （型， HTNV， Z10 株） 、 纯化鼠 脑细胞疫苗 （型， HTNV， LR1 株） 三种单价疫苗和双价 （、 型） 沙鼠肾细胞疫苗相继初步 研制成功。这 4 种疫苗的三期临。
9、床观察， 在防治和控制 HFRS 上起到了重要的作用。然而， 疫苗所用病毒来自早期分离获得， 以型HFRS疫苗毒种Z10和 LR1为例， 分别分离自 1982 年浙江省 HFRS 疫区病人血清和 1983 年捕获于陕西省疫区黑线姬鼠肺组织， 是否作为疫苗 株病毒合适， 并未证明， 病毒的遗传背景亦不清楚， 也并非针对近年来 HFRS 流行的优势疫 苗株。 0003 汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属， 其基因组由大 （L） 、 中 （M） 、 小 （S） 三个单 股负链的 RNA 组成， 分别编码 RNA 多聚酶， 两个包膜蛋白 （G1 和 G2） 和核蛋白 （N） ， 其中以 M 基因所承受。
10、的来自 HV 感染宿主的免疫压力最大， 变异最显著。在不同型的汉坦病毒中， 其 S 片段 3 NCR 区 核苷酸序列除手柄状部分外， 其余部分差异亦较大。汉坦病毒极易发生 变异， 存在不同型别及亚型之间。 若变异引发病毒毒力即致病性的改变， 则现有疫苗可能失 去保护性效果， 导致新疫区的不断出现和扩大， 并出现 HFRS 的爆发流行。此外， 以上这些疫 苗株生物特性的分子学基础研究， 如基因组测定、 分析和与国内毒株亲缘关系的比较等， 都 是在疫苗临床使用后才进行。可以说明这些疫苗株的代表性不强， 因此， 要控制 HFRS 流行 就必须对 HFRS 流行与演变的规律及本质有足够的认识， 同时必。
11、须明确流行高峰期的优势 流行病毒株的本质， 才能制备出更具有针对性、 预防效果更好的疫苗。 0004 本发明在获得湖北地区19852000年HFRS患者体内汉坦病毒的M基因特征的基 础上， 拟用 RT-PCR、 核苷酸测序等技术进一步分析长江中下游地区 1985 2009 年间鼠源、 螨源及人源汉坦病毒的 S、 M 片段高变区基因变异频率与变异位点， 从而明确流行高峰期的 说 明 书 CN 102618504 A 3 2/6 页 4 优势流行病毒株的特征。在此基础上， 分离得到流行高峰期的优势流行病毒株并大规模培 养， 最终获得这一地区具有代表性肾综合征出血热疫苗毒株。 然后对病毒进行灭活、 。
12、超滤和 浓缩， 经层析纯化， 鉴定获得灭活疫苗， 并进行疫苗原液、 疫苗的效力和其他常规项目的检 测以及疫苗免疫原性、 安全性和保护性的评价， 完成疫苗生产的临床前研究。 本发明可为制 订 HFRS 的防治方案， 控制该病的流行和汉坦病毒疫苗的研制策略提供新的理论依据。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种新型汉坦病毒， 以及由该病毒制备灭活疫苗， 用于肾 综合征出血热的防治。 0006 本发明的另一目的在于提供一种包括上述汉坦病毒的双价疫苗。 0007 本发明的再一个目的在于提供上述疫苗的制备方法。 0008 本发明人通过采集自长江中下游地区 1985 2009 年鼠源、 螨源、 人。
13、源的汉坦病 毒标本， 对其 S、 M 基因进行核苷酸序列分析， 获得汉坦病毒基因变异情况， 进一步筛选得到 优势病毒疫苗株 HV004， 该病毒已于 2011 年 12 月 7 日在中国典型培养物保藏中心 ( 简称 CGMCC， 地址 ： 武汉市武昌珞珈山邮编 ： 430072) 保藏， 分类命名为汉坦病毒属 (Hantavirus) 汉滩型， 保藏号为 CCTCC No.v201139。 0009 进而本发明提供一种由上述病毒制得的肾综合征出血热疫苗。 该疫苗可以是由上 述病毒灭活制得， 此外还可以加入佐剂， 例如铝佐剂， 以增强免疫效果。 0010 此外， 上述病毒还可以与其他病毒制成双价。
14、或多价疫苗， 例如， 将上述病毒 HV004 与汉坦病毒 Hubei- 株制备成双价疫苗。 0011 本发明疫苗可以按照常规方法制备获得， 例如， 将所述病毒在宿主细胞或组织中 增值， 收获病毒液后， 经灭活纯化处理， 即得。 以单价疫苗为例， 将上述病毒在乳鼠脑组织连 续传代， 收获发病鼠脑， 研磨成匀浆， 经灭活纯化处理， 即得。具体地， 将发病鼠脑研磨成匀 浆后， 取上清加将发病鼠脑研磨成匀浆后， 取上清加硫酸鱼精蛋白 （终浓度为 1mg/ml） ， 经蔗 糖密度梯度区带离心11万g离心2.5h， 取在30%与45%以及45%与60%之间一条明亮的带， 用逐滴加入 10%W/V BPL，。
15、 使其最终浓度为 1/4000， 加入 10%V/V Al(OH)3 胶体佐剂， 汉坦病 毒按抗原量为 1 ： 128 稀释， 总蛋白含量不超过 40g/ 剂。双价疫苗的制备和单价疫苗类似， 在获得病毒液时， 将两者混合， 再继续处理即可。具体地， 将上述两种病毒分别在乳鼠脑组 织连续传代， 分别将发病鼠脑研磨成匀浆后， 取上清加将发病鼠脑研磨成匀浆后， 取上清加 硫酸鱼精蛋白 （终浓度为 1mg/ml） ， 经蔗糖密度梯度区带离心 11 万 g 离心 2.5h， 取在 30% 与 45% 以及 45% 与 60% 之间一条明亮的带， 用逐滴加入 10%W/V BPL， 使其最终浓度为 1/4。
16、000， 加入10%V/V Al(OH)3胶体佐剂， 汉坦病毒按抗原量为1 ： 128稀释， 总蛋白含量不超过40g/ 剂。 0012 本发明具有如下优点 ： （1） 本发明通过对长江中下游地区 1985 2009 年鼠源、 螨源、 人源的汉坦病毒标本的 S、 M 基因进行核苷酸序列分析， 在此基础上， 得到了这一地基因特征。本发明中所确立的汉 坦病毒疫苗株是在已有毒株序列的基础上得到的毒株， 具有代表性。 0013 （2） 本发明通过对病毒基因的分析， 确立了长江中下游地区汉坦病毒优势流行株， 使疫苗株病毒的选择较传统疫苗株更有针对性。 说 明 书 CN 102618504 A 4 3/6 。
17、页 5 0014 （3） 本发明中对优势流行株进行分离培养， 在乳鼠体内传代增毒、 纯化， - 丙内酯 灭活， 最终获得了适用于 HFRS 预防的疫苗。 附图说明 0015 图 1 显示的是 ELISA 检测不同组血清特异性 IgG 抗体的水平 ； 图 2 显示的是不同组的小鼠脾脏细胞刺激率 ； 图 3、 4 显示的是流式检测胞内 干扰素染色结果。 具体实施方式 0016 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。若未特别 指明， 实施例中所用的生化试剂为市售试剂， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员 所熟知的常规手段。 0017 实施例 1 汉坦病毒 （Hantav。
18、irus） HV004 的获得及鉴定 1、 病毒采集及测序 （1） 收集长江中下游地区 1985 2009 年鼠肺组织、 螨媒悬液、 HFRS 患者血标本。 0018 （2）对这一地区鼠肺组织、 螨媒悬液、 HFRS 患者血标本进行间接免疫荧 光 （Indirect immunofluorescence, IFA） 、酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （Enzyme-linked immunosorbent assay, EILSA） 、（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测， 筛选鼠源、 螨源、 人源的病毒抗原阳。
19、性标本。其中 RT-PCR 筛选过程如 下 ： 用病毒特异性 RNA 提取试剂盒 （Promega）提取标本总 RNA ； 核酸分析仪检测 RNA 含 量， 所有标本 RNA OD260/280 1.9， 后取 50ng RNA 进行 RT-PCR 反应 ； 使用随机引物 逆转录， 其反应条件为 37C 反应 60min， 93C 5min 终止反应， 迅速置冰上冷却 3min ； PCR 使用设计的新型汉坦病毒通用引物 （序列 5 -3 GATTGAAGATATTGAGTCACC, P1/ 5 -3 GTTGTATCCCCATTGATTGTG, P2） ， 其反应条件为 94C 预变性 3m。
20、in， 94C 变性 1min， 50C 复性 1min， 72C 延伸 1min， 循环 35 次， 最后 72C 延伸 5min ； 1.5% 琼脂糖凝胶电泳观 察病毒核酸扩增结果。切下含目的片段的凝胶， 采用 Omega gel Extraction kit（Omega） 回收 DNA， 纯化后的 DNA 溶于 ddH2O 中。纯化后的 PCR 产物的测序交由 INVITROGEN 公司 （上海） 完成， 序列测定引物为 PCR 引物。 0019 2、 确定汉坦病毒优势毒株 已完成 624 份人源性， 896 份鼠源性样本， 3829 份螨媒标本的 RNA 的提取和阳性标本的 筛选工作。。
21、获得人源性汉坦病毒阳性标本 537 份， 鼠源性汉坦病毒阳性标本 58 份， 从螨体 内检测出病毒 RNA。详细内容如下 ： （1） 从 HFRS 患者血清中共筛选出阳性标本 ： 从 624 份 HFRS 患者血清中共筛选出阳性 标本 537 份， 获得汉坦病毒 S、 M 片段序列。完成了 166 份长江中游地区 HFRS 患者阳性样 本的分型检测 ； 获得了 74 份人源样本的序列结果。对现有的病毒基因同源性分析， 结果显 示， 长江中下游地区 HFRS 爆发的病毒既有 HTN 型病毒， 也有 SEO 型病毒。前者以与 76-118 株同源为主， 后者以与 Z37 株相似的病毒为主。 002。
22、0 （2） 鼠样本中筛选出阳性样本 ： 从 687 性样本中筛选出阳性样本 45 阳性率 6.5%。 获得了 206 份鼠源样本的测序结果， 并进行病毒与宿主基因同源性分析， 结果显示， 目前长 说 明 书 CN 102618504 A 5 4/6 页 6 江中下游地区汉坦病毒的流行仍以 SEO 型和 HTN 型为主， 并且有明显的地区聚集性。对病 毒进行进化树分析发现可将我们获得的 SEO 型病毒分为三个进化分支， 他们都与 Z37 株有 较高的同源性高达 96% 100%。HTN 型汉坦病毒基因变化更加多样， 它们与 Q32 和 76-118 株有较高的同源性分别为 83.984.4% 和。
23、 89.089.2。从鼠体内分离汉坦病毒 S、 M 基因 序列系统进化树分析。 0021 3、 优势病毒疫苗株分离及鉴定 （1） 无菌条件下取汉坦病毒的阳性标本黑线姬鼠鼠肺约 0.3 g， 加 3 m l 研磨液 （含 1% PS 的 DMEM） 在冰上研磨成 1 ： 10 的悬液。吸取 0.02ml 悬液， 注射到 2 3 日龄的 BALB/ C 鼠脑内 ； 正常饲养 21 天或发病后无菌取鼠的心、 脑、 肺、 肾组织， 用 RT-PCR 检测为阳性后， 用脑组织匀浆液重新接到新生乳鼠脑内， 以这样的方法进行 8 代扩增， 取心、 脑、 肺、 肾等组 织于 -80保存。 0022 （2） 同。
24、时将 b 步骤中含有病毒组织按培养基原液 （1 ： 1000） 匀浆后取 100L 接种 在Vero E6细胞， 在Vero E6细胞上盲传3代后， 通过IFA检测为阳性， 核酸鉴定亦为HV004 基因型。 0023 （3） 对 HV004 病毒株序列测定和系统进化分析 ： 对部分 S 片 611nt（558-1168nt）以及 M 片段 1353nt（51-1404nt）进行了扩增， 并 进行了同源性分析。M 片段与其他 HTN 型汉坦病毒的碱基以及推断的氨基酸同源性分别为 82.8%-90.6% 和 92.6%-97.6%， 而与其他型别的汉坦病毒的碱基同源性低于 70%。通过部分 S 片。
25、段的分析， 也可得到相似的结果。S、 M 两个基因的进化分枝均为一个新的独立分枝， 即 HTNV-#10。以上结果说明该分离的病毒与 HTN 型汉坦病毒的同源性更高， 属 HTNV 型汉坦 病毒。分析 HV004 的分子特性， 以及它能在 Vero E6 细胞和乳鼠体内传代增毒， 说明 HV004 可适用于制备肾综合征出血热灭活疫苗。该病毒已于 2011 年 12 月 7 日在中国典型培养物 保藏中心 （简称 CGMCC， 地址 ： 武汉市武昌珞珈山 邮编 ： 430072） 保藏， 分类命名为汉坦病毒 （Hantavirus） HV004， 保藏号为 CCTCC No.v201139。 00。
26、24 实施例 2 病毒疫苗的制备 1、 单价疫苗的制备 （1） 将 HV004 经 BALB/C 乳鼠脑组织连续传 8 代， 收获发病鼠脑， 研磨成匀浆， 加硫酸鱼 精蛋白 （终浓度为 1mg/ml） ， 初步去除组织 DNA， 外源 DNA 含量不大于 10ng/ 剂量。 0025 （2） 经蔗糖密度梯度区带离心 11 万 g 离心 2.5h， 取在 30% 与 45% 以及 45% 与 60% 之间一条明亮的带， 纯化病毒颗粒。病毒滴度为 6.5 lgCCID50/ml ； 细菌检查和支原体检查 为阴性， 采用 IFA 法测定病毒滴度为 1 ： 1024。 0026 （3） 用 2%V/V。
27、 HEPES 1mol/L pH7.5 和 0.14%W/V NaHCO3 在 4调纯化病毒原液 pH 至 7.4， 逐滴加入 10%W/V BPL， 使其最终浓度为 1/4000。灭活 24h， 将灭活的病毒液再经 37水解 2 小时， 置 2 8保存， 应不超过 30 日 （15 日） 。同时做病毒毒力回复实验为阴 性。 0027 （4） 测定蛋白含量 200ug/ml， ELISA 测定抗原量为 1 ： 4096。 0028 （5） 汉坦病毒按抗原量为 1 ： 128 稀释 ： 将高压灭菌的 Al(OH)3 按 10% 比例加入浓 缩、 纯化后的病毒液中， 并按 0.02% （W/V） 。
28、的比例加入柳硫汞制备得 Al(OH)3佐剂灭活疫苗。 且总蛋白含量不超过 40g/ 剂。 说 明 书 CN 102618504 A 6 5/6 页 7 0029 2、 多价疫苗的制备 方法同单价疫苗的制备， 具体如下 ： （1） 型病毒株 Hubei- 株 （SEO 型） 的制备时同 HV004 病毒株。 0030 （2） 病毒滴定 ： 病毒滴度为 6.5 lgCCID50/ml ； 细菌检查和支原体检查为阴性， 采 用 IFA 法测定病毒抗原为 1 ： 1024。 0031 （3） 用 2%V/V HEPES 1mol/L pH7.5 和 0.14%W/V NaHCO3 在 4调纯化病毒原液。
29、 pH 至 7.4， 逐滴加入 10%W/V BPL， 使其最终浓度为 1/4000。灭活 24h， 将灭活的病毒液再经 37水解 2 小时， 置 2 8保存， 应不超过 30 日 （15 日） 。同时做病毒毒力回复实验为阴 性。 0032 （4） 测定蛋白含量 200ug/ml， ELISA 测定抗原量为 1 ： 4096。 0033 （5） 将型和型汉坦病毒单价原液分别按抗原量为 1 ： 128 稀释后等量混合， 且 总蛋白含量不超过 40g/ 剂含量 10%Al(OH)3 佐剂即为疫苗。 0034 实施例 3 动物实验 以下以单价疫苗为例作详细说明 ： 1、 疫苗安全性实验 （1） 动物。
30、过敏实验研究 取样品 10ml， 同时以小牛血清作为对照， 皮下接种三只豚鼠， 豚鼠选用 250-350g 之间。 每只接种1ml， 间隔一周后进行第二次注射， 每只皮下1 ml， 使豚鼠致敏， 致敏三周后再以相 同样品静脉注射每只 0.5ml， 观察豚鼠无过敏性反应出现。 0035 （2） 异常毒性实验 异常毒性试验应进行 Balb/C 和豚鼠两种动物试验， 试验动物应达到清洁级别。小鼠 选用体重 18-22g， 豚鼠选用 250-350g 之间。注射前分别称取小鼠和豚鼠的体重， 每只小鼠 0.5ml 检品， 豚鼠每只 5.0ml， 观察 7 天体重变化与正常组无较大差别。 0036 2、 。
31、疫苗免疫性实验 接种方法 ： 于 0， 7， 14， 21d 皮下给予正常对照组 pbs 组高剂量疫苗组 （10ug/ml） 中剂量疫苗组 （5ug/ml） 低剂量疫苗组 （2.5ug/ml） 。于第 60 天检测细胞免疫和体液免疫 水平 ： （1） ELISA 检测血清特异性 IgG 抗体的水平。在 490nm 下读取的 OD 值高剂量组明显高 于 PBS 组且差异显著 （p0.05） （见图 1） 。 0037 （2）无菌取感小鼠脾脏常规法制备脾淋巴细胞悬液。以含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2106/ml， 加至96孔细胞培养板中， 100 l/孔， 每组每。
32、 个样品做六个复孔， 前三个复孔每孔加入含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液100 l， 作 为对照组， 后三个复孔每孔加入含 5 g/ml 刀豆蛋白及 10% 的胎牛血清的 RPMI-1640 培养 液 100 l 孔， 作为试验孔。置 37、 5%CO2培养箱培养 48 h， 在终止培养前 4 小时加 20 l/ 孔的 MTT， 混匀后继续培养 4 h 后离心， 弃上清。每孔加 100 l 的 DMSO， 振荡混匀后在酶标 仪 490 nm 的波长下检测其每孔的吸光度值 （OD 值） 。脾细胞增值率用刺激率 （SI） 表示 ： SI= 试验孔 OD 均值 / 对照孔 OD 均值。图。
33、二所示为高剂量组 SI 大于 PBS 组 （p 武汉大学 一种肾综合征出血热双价疫苗及其制备方法 2 PatentIn version 3.5 1 21 DNA 人工序列 1 gattgaagat attgagtcac c 21 2 21 DNA 人工序列 2 gttgtatccc cattgattgt g 21 序 列 表 CN 102618504 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618504 A 10 2/3 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102618504 A 11 3/3 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618504 A 12 。