MIRNA分子及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102604952 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102604952 A *CN102604952A* (21)申请号 201210072253.0 (22)申请日 2012.03.16 C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/68(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 广州市锐博生物科技有限公司 地址 510663 广东省广州市科学城科学大道 182 号创新大厦 C3-13 楼 (72)发明人 张必良 何建行 张鑫 冯世鹏 王玮 (74)专利代理机构 广。

2、州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 万志香 郭元杰 (54) 发明名称 miRNA 分子及其应用 (57) 摘要 本发明提供一种 miRNA 分子， 其碱基组成为 SEQ ID NO.1、 或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、 或 SEQ ID NO.3、 或 SEQ ID NO.4 或 SEQ ID NO.10 ； 或其碱基组成为SEQ ID NO.1、 或SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2、 或SEQ ID NO.3、 或SEQ ID NO.4， 且 含有修饰的核苷酸类似物， 该修饰的核苷酸类似 物为糖基修饰或骨架修饰或碱基修饰或末端修饰 的核。

3、苷酸。用该 miRNA 分子制备得到的治疗肿瘤 的药用组合物， 能有效抑制肿瘤的形成和发展。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种 miRNA 分子， 其特征在于， 其碱基组成为 SEQ ID NO.1、 或 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2、 或 SEQ ID NO.3、 或 SEQ ID NO.4 或 SEQ ID NO.10。 2. 一种 miRNA 分子， 其特征在。

4、于， 其碱基组成为 SEQ ID NO.1、 或 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2、 或SEQ ID NO.3、 或SEQ ID NO.4， 且含有修饰的核苷酸类似物， 该修饰的核苷酸类 似物为糖基修饰或骨架修饰或碱基修饰或末端修饰的核苷酸。 3.根据权利要求2所述的miRNA分子， 其特征在于， 所述核苷酸类似物是糖基修饰的核 糖核苷酸， 核糖核苷酸的 2 - 羟基被置换为 H、 OR、 R、 卤素、 SH、 SR1、 NH2、 NHR、 NR2 或 CN， 其 中 R 是 C1-C20 的烷基、 烯基、 共轭基、 或炔基， 所述卤素是 F、 Cl、 Br 或 I。 4.根。

5、据权利要求2所述的miRNA分子， 其特征在于， 所述核苷酸类似物是糖基修饰的核 糖核苷酸， 核糖被置换为核糖类似物结构为 C3-30 O2-15 N1-15 S1-8X1-20， 该结构中包括双环或多 环核糖， 无环核糖， 或肽核苷酸， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 5.根据权利要求2所述的miRNA分子， 其特征在于， 所述修饰核苷酸类似物是含有修饰 的非天然碱基的核苷酸， 其碱基结构为 C2-30O1-20N1-20S1-20X1-20， 该结构中包括有含嘌呤碱基类 似物、 嘧啶碱基类似物、 化学或光交联基团， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 6. 根据权利要求。

6、 2 所述的 miRNA 分子， 其特征在于， 所述末端修饰饰的核苷酸的结构 为 C2-80O1-20N1-20S1-20X1-20， 该结构中包括有胆固醇、 生物素、 胆酸、 叶酸、 维生素、 或荧光分子， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 7. 权利要求 1-6 任一项所述的 miRNA 分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 所述肿瘤为肺癌、 肝癌、 乳腺癌、 子宫颈癌、 结肠直肠 癌。 9. 利要求 1-6 任一项所述的 miRNA 分子作为肿瘤诊断标记物的应用。 10. 一种治疗肿瘤的药用组合物， 其活性成包括有权利要求 1-6 任一项所述。

7、的核酸分 子。 权 利 要 求 书 CN 102604952 A 2 1/9 页 3 miRNA 分子及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物医学材料技术领域， 具体是涉及一种 miRNA 分子及其应用 背景技术 0002 微 RNA(miRNA) 是一类自然存在的长度约 17-25 个碱基， 非编码小 RNA， 在生 物中是保守的， 小鼠的 miRNA 序列约三分之一与人的 miRNA 序列完全一致。miRNA 基 因在核内经过 RNA 聚合酶转录为初级前体 miRNA(pri-miRNA)， 经过初步加工成为前体 miRNA(pre-miRNA)， 再经过转运蛋白的协助从细胞核进入细胞。

8、质， 在胞质中经过进一步加 工， 成为长度约 23 个碱基的成熟 miRNA， 成熟 miRNA 与相关蛋白形成 miRISC 复合物调控 相关蛋白的表达。miRNA 广泛参与从细胞到整体的生命全过程， 估计超过三分之一的人类 基因受 miRNA 调控。miRNA 统一收录在英国 Sanger 中心的 miRNA 数据库中 (http:/www. sanger.ac.ck/)， 目前在该数据库中注册的人类 (Homo sapiens)miRNA 为 1921 条， 小鼠 (Mus musculus) 的为 1151， 大鼠 (Rattus norvegicus) 的为 680 条 (Griff。

9、iths-Jones S， Saini HK， van Dongen S， Enright AJ.2008.miRBase ： tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36 ： D154-158)。 0003 肿瘤是严重影响人们生活的重大疾病， 据世界卫生组织统计， 根据目前癌症的发 病趋势， 2020 年全世界癌症发病率将比现在增加 50， 全球每年新增癌症患者人数将达 到 1500 万人。我国卫生部 2008 年 4 月 29 日公布的第三次全国居民死亡原因调查结果显 示， 中国每年癌症新发病例为 220 万人， 因癌症死亡人数为 16。

10、0 万人。近 20 年来， 中国每 4-5 个死亡者中就有一个死于癌症， 居各种因素导致的死亡原因之首， 肺癌已取代肝癌成 为我国首位恶性肿瘤死亡原因 ； 也是全世界癌症患者的主要死因， 近 10 年来肺癌的治疗未 能取得突破性进展， 处于平台期 (Jemal A， Siegel R， Ward E， et al.Cancer statistics， (2008)CA Cancer J Clin.58(2) ： 71-96. ； Gilligan D， Nicolson M， Smith I， et al.(2007) Preoperative chemotherapy in patients。

11、 with resectable non-small cell lung cancer ： results of the MRC LU22/NVALT2/EORTC 08012 multicentre randomised trial and update of systematic review.Lancet.369(9577) ： 1929-37.)。早发现、 早治疗是减 少癌症死亡率最有效的方法， 实施对肠癌、 宫颈癌、 乳腺癌等的普查制度， 可使全世界癌症 死亡人数减少三分之一， 目前在发展中国家， 80的癌症患者都是在患病晚期才被发现， 丧 失了最佳治疗时间。 0004 成熟 miR。

12、-139-5p 的序列是通过克隆测序获得 (Landgraf P， Rusu M， Sheridan R， Sewer A， Iovino N， Aravin A， Pfeffer S， Rice A， Kamphorst AO， Landthaler M， Lin C， Socci ND， Hermida L， Fulci V， Chiaretti S， Foa R， Schliwka J， Fuchs U， Novosel A， Muller RU， Schermer B， Bissels U， Inman J， Phan Q， Chien， (2007)A mammalian micro。

13、RNA expression atlas based on small RNA library sequencing， M Cell.129 ： 1401-1414.)， miR-139-5p 在结肠癌 (Chang KH， Miller N， Kheirelseid EA， Lemetre C， Ball GR， Smith MJ， Regan M， McAnena OJ， Kerin MJ.MicroRNA signature analysis in 说 明 书 CN 102604952 A 3 2/9 页 4 colorectal cancer ： identification of e。

14、xpression profiles in stage II tumors associated with aggressive disease.Int J Colorectal Dis.In press)、 前列腺癌 (Yoshino H， Chiyomaru T， Enokida H， Kawakami K， Tatarano S， Nishiyama K， Nohata N， Seki N， Nakagawa M.2011 The tumour-suppressive function of miR-1 and miR-133a targeting TAGLN2 in bladder c。

15、ancer.Br J Cancer.IN press)、 肾脏癌(Fridman E， Dotan Z， Barshack I， David MB， Dov A， Tabak S， Zion O， Benjamin S， Benjamin H， Kuker H， Avivi C， Rosenblatt K， Polak-Charcon S， Ramon J， Rosenfeld N， Spector Y.2011Accurate molecular classification of renal tumors using microRNA expression.J Mol Diagn.IN p。

16、ress.)、 胃癌 (Guo J， Miao Y， Xiao B， Huan R， Jiang Z， Meng D， Wang Y.2009 Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues.J Gastroenterol Hepatol.24(4) ： 652-7) 等组织中低表达， 其表 达量与这些疾病有一定的相关性。 0005 DNA 是脱氧核糖核酸组成的， 4 种主要的组成核酸包括脱氧腺嘌呤核苷酸 (dA)， 脱 氧鸟嘌呤核苷酸(dG)， 脱氧。

17、胸腺嘧啶核苷酸(dT)， 脱氧胞嘧啶核苷酸(dC) ； RNA是由核糖核 酸组成的， 4种主要组成核酸包括腺嘌呤核苷酸(A)， 鸟嘌呤核苷酸(G)， 尿嘧啶核苷酸(U)， 胞嘧啶核苷酸 (C).DNA 与 RNA 在碱基组成上的主要区别是 DNA 用的是 dT， 而 RNA 用的是 U， 另外 dA， dC， dG 分别比 A， C， G 碱基在核糖 2 位上少一个羟基 -OH. 自然存在的核苷酸是由 三部分组成的 ： 碱基， 核糖， 磷酸 . 在分子生物学应用中碱基， 核糖， 磷酸可以分别被修饰或 集团替换， 在提高核苷酸的稳定性的同时， 而不影响该核苷酸发挥生物学功能 . 自然存在 的 R。

18、NA 形式及常见的修饰方法见下图 . 0006 0007 图 RNA 结构及常见修饰方法， 其中 B 代表碱基， 两个核苷酸通过磷酸二脂键连接。 0008 磷酸的修饰主要是硫代 (P O 变为 P S) 0009 核糖的修饰包括 ： 核糖 2 位甲基化 (Me)， 甲氧基化 (MOE)， 氟代， 卤代， 乙酰化或者 更长的碳链修饰 ； 0010 另外在合成的 miRNA 寡核酸链 3 端或者 5 端进行荧光染料， 胆固醇， PEG 等修饰 发明内容 0011 本发明的目的之一是提供一种可以用于治疗癌症的新的 miRNA 分子 miR-139-5p。 0012 实现上述目的的技术方案如下 ： 说。

19、 明 书 CN 102604952 A 4 3/9 页 5 0013 一种 miRNA 分子， 其碱基组成为 SEQ ID NO.1、 或 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2、 或 SEQ ID NO.4。 0014 具体序列的组成如下 ： 0015 0016 实现上述目的另一技术方案如下 ： 0017 一种 miRNA 分子， 其碱基组成为 SEQ ID NO.1、 或 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2、 或 SEQ ID NO.3、 或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.10， 且含有修饰的核苷酸类似物， 该修饰的核苷 酸类似物为糖基修饰或骨架修饰。

20、或碱基修饰或末端修饰的核苷酸。 0018 所述核苷酸类似物是糖基修饰的核糖核苷酸， 核糖核苷酸的 2 - 羟基被置换为 H、 OR、 R、 卤素、 SH、 SR1、 NH2、 NHR、 NR2 或 CN， 其中 R 是 C1-C20 的烷基、 烯基、 共轭基、 或炔基， 所 述卤素是 F。优选地， 所述核苷酸类似物是糖基修饰的核糖核苷酸， 核糖被置换为核糖类似 物结构为 C3-30 O2-15 N1-15 S1-8X1-20， 该结构中包括但不仅包括双环或多环核糖 (LNA)， 无环核 糖 (UNA)， 肽核苷酸 (PNA)， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 0019 或所述修饰核。

21、苷酸类似物是含有修饰的非天然碱基的核苷酸， 其碱基结构为 C2-30O1-20N1-20S1-20X1-20， 该机构中包含且不仅包含嘌呤碱基类似物、 嘧啶碱基类似物、 化学或 光交联基团， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 0020 或所述末端修饰饰的核苷酸的结构为 C2-80O1-20N1-20S1-20X1-20， 该结构中包含且不仅 包含胆固醇、 生物素、 胆酸、 叶酸、 维生素、 荧光分子， 其中 X 是 F、 Cl、 Br 或 I。 0021 本发明的另一目的是提供上述 miRNA 分子的应用。 0022 实现上述目的的技术方案如下 ： 0023 上述的 miRNA 分子。

22、在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 0024 上述的 miRNA 分子作为肿瘤诊断标记物的应用。 0025 优选地， 所述肿瘤为肺癌、 肝癌、 乳腺癌、 子宫颈癌、 结肠直肠癌本发明的另一目的 是提供一种治疗肿瘤的药用组合物。 0026 实现上述目的的技术方案如下 ： 0027 一种治疗肿瘤的药用组合物， 其活性成包括有上述的 miRNA 分子。 0028 本发明所述 miRNA 分子 (miR-139-5p 分离核酸 ) 可以是化学合成得到的， 其应用 时的浓度在 0.01mg/kg 体重至 10mg/kg 体重。 0029 本发明所述 miRNA 分子 (miR-139-5p 分离核酸 ) 也。

23、可以构建载体表达后纯化得到 说 明 书 CN 102604952 A 5 4/9 页 6 的， 其应用时的浓度是 1X105至 1X1014个病毒颗粒， 或 100mg 至 4000mg 的 DNA 质粒载体。 0030 miR-139-5p 分离核酸作为制备抗肿瘤治疗药物的应用， 所述肿瘤为肺癌、 结肠直 肠癌、 肝癌、 乳腺癌、 膀胱癌、 子宫颈癌、 子宫内膜癌、 白血病、 卵巢癌、 食管癌、 口腔癌、 胰腺 癌、 胃癌、 大细胞淋巴瘤、 B 细胞淋巴瘤、 慢性淋巴母细胞性白血病、 急性髓性白血病、 多发性 骨髓瘤、 睾丸肿瘤、 星型细胞瘤、 黑色素瘤、 套细胞淋巴瘤、 脑膜瘤、 间皮瘤、。

24、 神经纤维瘤、 或 前列腺癌。优选为肺癌、 肝癌、 乳腺癌、 子宫颈癌、 结肠直肠癌。 0031 本发明将化学修饰合成的 miR-139-5p mimics 及阴性对照转入肿瘤细胞中， 与阴 性对照相比， miR-139-5p 显著抑制肿瘤细胞增殖， 将肿瘤细胞阻滞在 G1 期 ； 细胞凋亡研究 发现 miR-139-5p 通过 Caspase 信号通路诱导肿瘤细胞凋亡 ； 细胞迁移实验及细胞侵袭实 验发现 miR-139-5p 显著抑制细胞迁移、 侵袭能力 ； 体内实验进一步证实， 通过 miR-139-5p 给药预处理细胞在体内抑制肿瘤的形成和发展 ； 通过生物信息学方法分析预测许多基因为。

25、 miR-139-5p 潜在靶基因， 进一步的实验证实 Cul-3 是 miR-139-5p 调控的靶基因之一， 并且 免疫组化发现 Cul-3 蛋白在肿瘤组织样本中差异表达。 附图说明 0032 图 1 是实施例 1 中 miR-139-5p 在肺癌细胞中的表达的结果示意图 ； 0033 图 2 是实施例 2 中 miR-139-5p 抑制细胞增殖的结果示意图 ； 0034 图 3 是实施例 3 中 miR-139-5p 引起细胞周期阻滞的结果示意图 ； 0035 图 4 是实施例 4 中 miR-139-5p 诱导细胞凋亡的结果示意图 ； 0036 图 5 是实施例 5 中 miR-139。

26、-5p 体内抑制肿瘤的形成的结果示意图 ； 0037 图 6 是实施例 6 中 Cul3 是 miR-139-5p 的靶基因的结果示意图 ； 0038 图 7 是实施例 7 中 Cul3 蛋白在组织样本中差异表达的结果示意图 ； 0039 图 8 是实施例 8 中 miR-139-5p 抑制肿瘤细胞增殖结果示意图 ； 0040 图 9 是 SEQ ID NO.4 和 10 用 RNAstructure 4.4 软件折叠后的结果示意图 ； 0041 图 10 是实施例 9 中过表达 miR-139-5p 抑制肿瘤细胞增殖结果示意图 ； 0042 图 11 是实施例 10 中不同修饰的 miR-1。

27、39-5p 抑制肿瘤细胞增殖结果示意图 ； 0043 图 12 是实施例 11 中抑制 miR-139-5p 的表达促进肿瘤细胞增殖结果示意图 ； 0044 图 13 是实施例 12 中 miR-139-5p 作为肿瘤分子诊断标记物结果示意图。 具体实施方式 0045 下面结合具体实施例来对本发明做进一步描述， 本发明的优点和特点将会随着描 述更为清楚。但是这些实施例仅是范例性的。并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或者替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。 0046 本发明所述的由 m。

28、iR-139-5p 分离核酸制备的药物可以是纳米颗粒组合物、 脂质 体组合物、 生物相容性分子组合物和 / 或生物可降解分子组合物组成。 0047 本发明所述的由 miR-139-5p 分离核酸制备的药物， 可以经肠内或胃肠外给药。肠 内给药是口服给药 ； 胃肠外给药是血管内给药、 颅内给药、 胸膜内给药、 肿瘤内给药、 腹腔内 给药、 肌肉内给药、 淋巴给药、 腺内给药、 皮下给药、 局部给药、 支气管给药、 气管内给药、 鼻 说 明 书 CN 102604952 A 6 5/9 页 7 内给药、 吸入给药或者滴注给药等。 0048 本发明所述的由miR-139-5p分离核酸制备的药物应用时。

29、， 浓度在0.01mg/kg体重 至 10mg/kg 体重， miR-139-5p 分离核酸是由化学合成方法合成得到的 ； 或者通过构建载体 表达后纯化， 则以每剂量为 1X105至 1X1014个病毒颗粒或者 100mg 至 4000mg 的 DNA 质粒载 体。 0049 所述序列的单链表述都为 53 的形式， 特殊标注的除外。 0050 实施例一、 miR-139-5p 在肺癌组织及细胞中低表达 0051 本实施例所用的 miR-139-5p 定量检测引物来源于广州市锐博生物科技有限公 司。人肺腺癌细胞株 A549 来自 ATCC， 常规培养于含 10胎牛血清的 1640 培养液中， 置。

30、于 5CO2、 37饱和湿度的培养箱中培养传代。 组织样本来源于广州医学院第一附属医院， 取 样前均有患者的知情同意， 样本的使用符合相关医学伦理规范， 将来源于肺癌患者手术切 下的病理组织样本中远癌旁组织作为正常组织样本。 miR-139-5p定量检测引物序列结构如 下 ： 0052 miR-139-5p RT primer ： 0053 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGGAG(SEQ ID NO.5) 0054 miR-139-5p forward primer ： ATGCATCTACAGTGCACGTGTCT(SEQ ID 。

31、NO.6) 0055 miR-139-5p reverse primer ： AGTGCAGGGTCCGAGGTAT(SEQ ID NO.7) 0056 所有细胞及组织样本 RNA 提取采用 Trizol 法， 按照试剂盒说明书 (Invitrogen) 进行。cDNA 合成及定量 RT-PCR 检测采用常规分子生物学方法。 0057 实验结果显示， 与正常肺癌组织相比， miR-139-5p 在肺癌细胞中显著低表达 ( 图 1， P 0.05)。 0058 实施例二、 miR-139-5p 抑制肿瘤细胞增殖 0059 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 SE。

32、Q ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 序列经过修饰。具体如下 ： 0060 正义链 ： mUmCmUACAGUGCACGUGUCUCCmAmGm 0061 反义链 ： mAmGmAUGUCACGUGCACAGAGmGmUmC-5chol 0062 注 ： 其中 m 代表甲基化， s 代表硫代， Chol 代表胆固醇修饰。以下实施例都相同， 不重复表示。 0063 人肺腺癌细胞株 A549、 H460 来自 ATCC， 95D 由本实验室保存。常规培养于含 10 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中， 置于 5 CO2、 37饱和湿度的孵箱中培养传代。 0064 取对数生长期的 。

33、A549、 H460 细胞， 以每孔 4103细胞接种于 96 孔板中， 每孔细 胞悬液总体积 100L， 于 37、 5 CO2 培养箱中培养过夜 ； 根据 LipofectamineTM 2000 试 剂操作指南进行转染， 设 Notarget 对照转染组、 miR-139-5p mimics 组， 每组设 3 个复孔 ； 48h 后吸出培养基， 每孔加入 90L 新鲜培养基， 同时每孔加入新配制的 10uL CCK-8 溶液 10L， 于 37、 5 CO2 饱和湿度下培养 1h ； 置酶标仪 450nm 处测定吸光度值 (A 值 )， 取 3 孔平均值， 比较各转染组与Notarget。

34、 siRNA转染组A值的差异， 计算相对细胞增殖活性， 计 算公式 miRNA 处理组 /Notarget 对照组。实验结果显示 miR-139-5p 显著抑制肿瘤细胞 增殖 ( 图 2)。 0065 实施例三、 miR-139-5p 将肿瘤细胞阻滞在 G1 期 说 明 书 CN 102604952 A 7 6/9 页 8 0066 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 修饰方法同实施例二 . 0067 取对数生长期的 H460 细胞， 以每孔 5104细胞接种于 6 孔板中， 每孔细胞悬液总 体积2mL， 。

35、于37、 5CO2培养箱中培养过夜 ； 根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进 行转染， 设 Notarget 对照转染组、 miR-139-5p mimics 组， 每组设 3 个复孔 ； 转染 48 小时后 弃旧培养基， 离心收集细胞， 用 75的乙醇固定过夜 ； 用 PBS-EDTA 清洗细胞 2 次， 并用终浓 度为 0.5mg/mL 的 RNase A 室温孵育 30min 消化细胞内的 RNA ； 加入终浓度为 0.05mg/mL 的 PI 溶液， 室温避光孵育 10min ； 离心收集细胞， 300uL PBS 吹散重悬细胞， 300 目尼龙滤膜过 滤后进行流。

36、式细胞分析。实验结果显示 miR-139-5p 将肿瘤细胞阻滞在 G1 期 ( 图 3)。 0068 实施例四、 miR-139-5p 促进肿瘤细胞凋亡 0069 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 修饰方法同实施例二 . 0070 取对数生长期的H460细胞， 以每孔4103细胞接种于96孔板中， 每孔细胞悬液总 体积100L， 于37、 5CO2培养箱中培养过夜 ； 根据LipofectamineTM2000试剂操作指南 进行转染， 设 Notarget 对照转染组、 miR-139-5p mimics。

37、 组， 每组设 3 个复孔 ； 转染 48h 后 用Homogeneous Caspase-3/7Assay kit(Promega)试剂盒进行细胞凋亡检测， 检 测方法参见试剂盒说明书。检测结果表明， 与 Notarget 对照相比， miR-139-5p 处理后显著 促进肿瘤细胞凋亡 ( 图 4)。 0071 实施例五、 miR-139-5p 体内抑制肿瘤形成 0072 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 修饰方法同实施例二 . 0073 5-6 周龄的 BALB/c 裸鼠购自广东省实验动物中心， 实验。

38、动物操作处理符合呼吸 系统疾病国家重点实验室相关动物处理和使用规定。H460 细胞以 30nM 的 miR-139-5p 及 Notarget control 处理 12h 后皮下接种于裸鼠的左右前肢， 实验分 miR-139-5p 处理组及 Notarget 对照组， 每周测量一次肿瘤体积， 5 周后断颈处死裸鼠， 并称量瘤重。结果显示 miR-139-5p 局部定点注射给药预处理肿瘤细胞后， 显著抑制其在体内肿瘤形成能力 ( 图 5)。 0074 实施例六、 Cul3 是 miR-139-5p 的靶基因之一 0075 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 S。

39、EQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 修饰方法同实施例二 . 0076 siCul3 处理组的序列为 0077 正义链 ： 3 dTdT CUUGGGUUUAGUUUCCUUU 5 (SEQ ID NO.8) 0078 反义链 ： 5 GAACCCAAAUCAAAGGAAA dTdT 3 (SEQ ID NO.9) 0079 取对数生长期的 H460 细胞， 以每孔 5104细胞接种于 6 孔板中， 每孔细胞悬液总 体积 2mL， 于 37、 5 CO2 培养箱中培养过夜 ； 根据 LipofectamineTM 2000 试剂操作指南 进行转染， 设空白对照组、 Notarge。

40、t 对照转染组、 miR-139-5pmimics 组、 siCul3 处理组， 每 组设 3 个复孔 ； 转染 48 小时后， 用细胞刮刮下细胞， 离心收集细胞沉淀， 并用预冷的 PBS 清 洗 2 次， 用含 100mM 浓度的 PMSF 裂解液冰上裂解细胞 30min， 离心取上清即为总蛋白溶液。 在总蛋白溶液加入蛋白上样缓冲液， 沸水浴 10min， 所得样本即可进行 SDS-PAGE(80-160V， 说 明 书 CN 102604952 A 8 7/9 页 9 90min)， 采用半干转法进行转膜， 按照 2mA/cm2设置电流恒流转膜 90min ； 转膜完毕， 以 5 脱脂奶粉。

41、预杂交膜 1h ； 根据目的条带大小切下对应的膜片段， 按照常规方法， 进行一抗与 二抗杂交， 抗 Cul3 蛋白一抗来自 Cell signal Technology(CST2759)， 抗 GAPDH 一抗来自 上海康城， 二抗来自 Southern Biotech。实验结果显示 miR-139-5p 与 siCul3 均显著抑制 Cul3 蛋白的表达， 表明 Cul3 是 miR-139-5p 的靶基因之一 ( 图 6)。 0080 实施例七、 Cul3 蛋白在病理组织样本中差异表达 0081 Cul3 蛋白在病理组织样本中的表达采用免疫组化的方法。将保存好的石蜡快切 成 4um 厚的薄。

42、片， 置于载玻片上， 经过二甲苯脱蜡， 梯度乙醇水化， 抗原热修复， 血清封闭， 一抗杂交， 二抗杂交后进行 DAB 染色并拍照保存染色结果。与不加一抗的阴性对照相比， 细 胞质与细胞膜同时被染上棕色的细胞判断为阳性。A 是正常肺组织， B 为肺腺癌， C 为肺鳞 癌。结果显示 Cul3 蛋白在肿瘤组织样本中表达显著高于正常组织中的表达水平 ( 图 7)， miR-139-5p 在肺癌组织中低表达， 同时其靶基因 Cul3 在肺癌组织中高表达， 进一步证实 Cul3 是 miR-139-5p 的靶基因。 0082 实施例八、 miR-139-5p 给药显著抑制宫颈癌、 结肠癌、 肝癌、 乳腺癌。

43、等肿瘤细胞的 增值 0083 本实施例所用的 miR-139-5p mimics 序列的碱基组成为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， 修饰方法同实施例二。 0084 人宫颈癌细胞株 Hela、 结肠癌细胞 HCT-116， 肝癌 HepG2 细胞、 乳腺癌细胞 MCF-7 来自 ATCC。常规培养于含 10胎牛血清的 DMEM 或 1640 培养液中， 置于 5 CO2、 37饱和 湿度的孵箱中培养传代。 0085 取对数生长期的 Hela 细胞， 结肠癌细胞 HCT-116， 肝癌 HepG2、 乳腺癌 MCF-7 细胞 以每孔4103细胞接种于96孔板中， 每孔细胞悬液。

44、总体积100L， 于37、 5CO2培养箱 中培养过夜 ； 根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染， 设Notarget对照转染组、 miR-139-5p mimics处理组， 每组设3个复孔 ； 48h后吸出培养基， 每孔加入90L新鲜培养 基， 同时每孔加入新配制的 10uLCCK-8 溶液 10L， 于 37、 5 CO2 饱和湿度下培养 1h ； 置 酶标仪 450nm 处测定吸光度值 (A 值 )， 取 3 孔平均值， 比较各转染组与 Notarget siRNA 转 染组 A 值的差异， 计算相对细胞增殖活性， 计算公式 miRNA 处理组 /Notarg。

45、et 对照组。实 验结果显示 miR-139-5p 给药后显著抑制宫颈癌、 结肠癌， 乳腺癌细胞增殖 ( 图 8)。 0086 实施例九、 过表达 miR-139-5p 抑制肿瘤细胞增殖 0087 发卡结构的shRNA miR-139-5p表达序列框由广州市锐博生物科技有限公司设计， pr-miR-139-5p， shRNA miR-139-5p 序列均由广州市锐博生物科技有限公司合成。所使用 的序列信息如下 ： 0088 0089 按照本领域的常规方法 ： 将化学合成的 pre-miR-139-5p 及 shRNA miR-139-5p 说 明 书 CN 102604952 A 9 8/9 。

46、页 10 寡核酸链纯化后退火形成双链， 琼脂糖凝胶电泳纯化双链并连入表达载体， 序列用 RNAstructure 4.4 软件折叠后的结果见图 9。 0090 取对数生长期的 H460 细胞以每孔 4103细胞接种于 96 孔板中， 每孔细胞悬液总 体积 100L， 于 37、 5 CO2 培养箱中培养过夜 ； 根据 LipofectamineTM2000 试剂操作指 南进行转染， 设空白载体对照转染组、 shRNA miR-139-5p 表达载体处理组， pre-miR-139-5p 表达载体处理组， 每组设 3 个复孔， 载体使用浓度为 100ng/ 孔 ； 48h 后吸出培养基， 每孔加。

47、 入 90L 新鲜培养基， 同时每孔加入新配制的 10uL CCK-8 溶液 10L， 于 37、 5 CO2 饱 和湿度下培养 1h ； 置酶标仪 450nm 处测定吸光度值 (A 值 )， 取 3 孔平均值， 比较各转染组 与空白载体转染组 A 值的差异， 计算相对细胞增殖活性。实验结果显示无论是用人工设计 的发卡结构的shRNA miR-139-5p还是用体内自身存在的pre-miR-139-5p构建载体过表达 miR-139-5p 给药后均可显著抑制肿瘤细胞增殖 ( 图 10)。 0091 实施例十、 不同修饰的 miR-139-5p 均可抑制肿瘤细胞增殖 0092 本实施例所用的 m。

48、iR-139-5p mimics 序列如下 ： 0093 正义链 ： UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG 0094 反义链 ： 为 CUGGAGACACGUGCACUGUAGA 基础， 经过修饰， 具体如下表所示 0095 如下表所示 0096 0097 其中， PEG 代表聚乙二醇， Biotin 为生物素， F 代表氟， s 代表硫。 0098 人肺癌细胞株 A549 来自 ATCC。常规培养于含 10胎牛血清的 1640 培养液中， 置 于 5 CO2、 37饱和湿度的孵箱中培养传代。 0099 取对数生长期的 A549 细胞以每孔 4103细胞接种于 96 孔板中， 每孔细胞。

49、悬液总 体积100L， 于37、 5CO2培养箱中培养过夜 ； 根据LipofectamineTM2000试剂操作指南 进行转染， 设 Notarget 对照转染组、 miR-139-5p mimics 处理组， 每组设 3 个复孔 ； 48h 后 吸出培养基， 每孔加入 90L 新鲜培养基， 同时每孔加入新配制的 10uL CCK-8 溶液 10L， 于 37、 5 CO2 饱和湿度下培养 1h ； 置酶标仪 450nm 处测定吸光度值 (A 值 )， 取 3 孔平均 值， 比较各转染组与Notarget siRNA转染组A值的差异， 计算相对细胞增殖活性， 计算公式 miRNA 处理组 /Notarget 对照组。实验结果显示不同化学。