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1、(10)申请公布号 CN 102600116 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102600116 A *CN102600116A* (21)申请号 201210047236.1 (22)申请日 2012.02.28 A61K 31/121(2006.01) A61P 25/30(2006.01) (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253 号 (72)发明人 白洁 吕涛 魏大巧 (54) 发明名称 替普瑞酮的一种抵抗甲基苯丙胺引起的神经 毒性的用途 (57) 摘要 本发明公开了一种替普瑞酮在制备预防和 / 或治疗甲基苯丙胺引起的神经毒。
2、性的药物中的应 用， 替普瑞酮有抵抗甲基苯丙胺引起的神经毒性 的作用， 属于医药技术领域， 本发明实验结果显示 替普瑞酮具有保护大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 PC12 细胞免于甲基苯丙胺引起的细胞凋亡， 以及具有 恢复甲基苯丙胺所致的 pro-caspase3 蛋白的降 低的能力， 且疗效显著、 安全性高、 成本低， 适于实 际推广利用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 替普瑞酮在制备预防和 / 或治疗甲基苯丙胺引起的神经毒性的药。
3、物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102600116 A 2 1/5 页 3 替普瑞酮的一种抵抗甲基苯丙胺引起的神经毒性的用途 技术领域 0001 本发明涉及一种替普瑞酮的新医药用途， 特别是替普瑞酮在制备预防和 / 或治疗 甲基苯丙胺引起的神经毒性的药物中的应用， 属于医药技术领域。 背景技术 0002 苯丙胺类药物滥用是当今世界的社会公害之一， 常见的苯丙胺类药物包括苯丙 胺 （amphetamine） 、 甲基苯丙胺 （methamphetamine， MA） 、 麻黄碱 （ephedrine） 、 亚甲二氧基 甲基苯丙胺 （methylenedioxymethylamphetam。
4、ine， MDMA） 等。苯丙胺类与儿茶酚胺神经递 质相似， 有显著的中枢兴奋及外周 、 肾上腺能受体兴奋作用， 有收缩周围血管、 兴奋 心脏、 升高血压、 松弛支气管平滑肌、 散大瞳孔、 收缩膀胱括约肌等作用。苯丙胺类药物主 要作用靶点为多巴胺能神经元， 其毒性机制包括多巴胺的氧化作用、 谷氨酸介导的兴奋性 毒性作用、 氧化应激和细胞因子的形成、 线粒体功能紊乱、 神经细胞凋亡、 神经胶质细胞的 活化等。近几年， 该类药物在娱乐场所大肆滥用， 由此而导致的中毒甚至死亡的案件逐年 上升， 因此， 探索预防 / 治疗苯丙胺类药物毒性损伤的药物成为近年来的研究热点 （Kita T， Miyazak。
5、i I， Asanuma M， Takeshima M， Wagner GC. Dopamine-induced behavioral changes and oxidative stress in methamphetamine-induced neurotoxicity. Int Rev Neurobiol. 2009 ； 88:43-64） 。 0003 替 普 瑞 酮 （geranylgeranylacetone， GGA） ，即 6， 10， 14， 18- 四 甲 基 -5， 9， 13， 17- 十九烷四烯 -2- 酮的单顺式和全反式异构体的混合物， 现已被广泛应用于消化道溃疡 。
6、的治疗中。研究证实 GGA 可以诱导热休克蛋白 70（heat shock protein 70, HSP70） 和硫 氧还蛋白 （thioredoxin， Trx） 的表达 （Tsuruma T， Yagihashi A， Koide S， Araya J， Tarumi K， Watanabe N， Hirata K. Geranylgeranylacetone induces heat shock protein-73 in rat small intestine. Transplant Proc. Feb-Mar ； 1999.31(1-2):572-573 ； Hirota K， N。
7、akamura H， Arai T， Ishii H， Bai J， Itoh T， Fukuda K， Yodoi J. Geranylgeranylacetone enhances expression of thioredoxin and suppresses ethanol-induced cytotoxicity in cultured hepatocytes. Biochem.Biophys. Res. Commun 2000;275:825-830） 。HSP70 是一种广泛存在的应激蛋白， 其合成能提供生物体对 各类有害因素 （例如 ： 缺血、 缺氧和重金属等） 的耐受性， 使。
8、细胞处于应激状态， 快速激活与 抗毒有关的蛋白质基因， 从而起到保护细胞和生物体的作用。Trx 是细胞内一种有效的抗 氧化剂， 能保护细胞、 减轻氧化应激所致的损伤。Trx 能抑制 p38 MAPK 和凋亡信号调节激 酶 1 相关的凋亡信号传导途径， 增强细胞的抗凋亡能力 (Saito M., Nishitoh， H.， Fujii， M.， Takeda， K.， Tobiume， K.， Sawada， Y.， Kawabata， M.， Miyazono， K.， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of。
9、 apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO 1998 ； 17: 2596-2606 ； Hashimoto S.， Matsumoto K.， Gon Y.， Furuichi S.， Maruoka S.， Takeshita I.， Hirota K.， Yodoi J.， and Horie T. Thioredoxin negatively regulates p38 MAP kinase activation and IL-6 production by tumor 说 明 书 CN 102600116 A 3 2/5 页 4。
10、 necrosis factor-alpha. Biochem.Biophys. Res. Commun 1999 ； 258: 443-447)。GGA 通过诱导 HSP70 和 Trx 能减轻化学物质引起的细胞毒作用 （Bai J， Nakamura H， Hattori I， Tanito M， Yodoi J. Thioredoxin suppresses 1-methyl-4-phenylpyridinium-indu ced neurotoxicity in rat PC12 cells， Neurosci Lett 2002 ； 321， 81-4 ； Takumida M， A。
11、nniko M. Heat shock protein 70 delays gentamicin-induced vestibular hair cell death. Acta Otolaryngol.2005;125:23-8） 。同时， GGA 对光损伤、 缺血性肾衰竭、 癫痫和 脑梗塞等具有保护作用 (Tanito M, Kwon Y.W, Kondo N, Bai J, Masutani H, Nakamura H, Fujii J, Ohira A, Yodoi J. Cytoprotective effects of geranylgeranylacetone against r。
12、etinal photooxidative damage, J Neurosci 2005; 25, 2396-404; Suzuki S, Maruyama S, Sato W, Morita Y, Sato F, Miki Y, Kato S, Katsuno M, Sobue G, Yuzawa Y, Matsuo S. geranylgeranylacetone ameliorates ischemic acute renal failure via induction of Hsp70. Kidney Int 2005;67:2210-20; Fujiki M, Kobayashi 。
13、H, Inoue R, Tatsuya R, Ishii K. Single oral dose of geranylgeranylacetone for protection against delayed neuronal death induced by transient ischemia. Brain Res 2004;1020:210-213; Yasuda H, Shichinohe H, Kuroda S, Ishikawa T, Iwasaki Y. Neuroprotective effect of a heat shock protein inducer, geranyl。
14、geranylacetone in permanent focal cerebral ischemia. Brain Res 2005;1032:176-182)。 替普瑞酮是 否可以抵抗苯丙胺类药物引起的毒性损伤尚未报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种替普瑞酮 （geranylgeranylacetone， GGA） 的新用途， 即 替普瑞酮在制备预防和 / 或治疗甲基苯丙胺引起的神经毒性的药物中的应用。 0005 本发明所述的替普瑞酮的用途， 是将替普瑞酮用作预防和治疗甲基苯丙胺引起的 神经毒性的药物， 或用于制备预防和治疗甲基苯丙胺引起的神经毒性的药物， 即以替普瑞 酮为活。
15、性成分或与其他活性成分配合使用制成药物， 在制备预防和 / 或治疗甲基苯丙胺引 起的神经毒性的药物中的应用。 0006 由于替普瑞酮在保护神经元免于甲基苯丙胺毒性损伤中的应用是发明人的首次 发现， 因此， 凡是涉及上述内容， 无论是 GGA 单独使用为活性成分制成的药剂， 还是与其他 活性成分配合使用制成的药剂， 均在本专利的保护范围之内。 0007 本发明实验结果显示 ：（1） 四噻唑蓝 （MTT） 法测定替普瑞酮能保护 PC12 细胞免于 甲基苯丙胺引起的细胞生长抑制 ；（2） Western Blot 检测替普瑞酮能恢复甲基苯丙胺所致 的pro-caspase3蛋白的降低， 进一步证明，。
16、 替普瑞酮保护PC12细胞免于甲基苯丙胺引起的 细胞凋亡， 而非生长抑制。 0008 本发明所述替普瑞酮具有疗效显著、 安全性高、 成本低等优势， 适于实际推广利 用。 附图说明 0009 图 1 是本发明四噻唑蓝 （MTT） 法测定替普瑞酮保护 PC12 细胞免于甲基苯丙胺引 起的细胞生长抑制实验分析结果示意图。 说 明 书 CN 102600116 A 4 3/5 页 5 0010 图 2 是本发明 Western Blot 检测替普瑞酮恢复甲基苯丙胺所致的 pro-caspase3 蛋白的降低的实验分析结果示意图。 0011 图中 “-” 为不添加，“+” 为添加。 具体实施方式 001。
17、2 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明保护范围不局限于 所述内容。 0013 本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， 本发明实施例中使用的细 胞、 试剂和仪器设备如下 ： 1、 细胞 PC12 细胞 ： 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞， 购自中国科学院昆明动物所。 0014 2、 药品及主要试剂 替普瑞酮 （日本卫材公司生产， 分子量 330.55 ； 采用 5% 阿拉伯胶溶解后使用） ； 甲基苯 丙胺由云南省公安厅提供 ； 一抗 Anti-rabbit caspase-3（抗兔的半胱氨酸天冬氨酸蛋白 酶 -3 抗体） 和 Anti-mouse -actin（抗鼠的 - 。
18、肌动蛋白抗体） 购自 santa ； Protein Marker（蛋白分子量标准）购自 Fermentas 公司 ； RPMI Medium 1640 购自 Invitrogen corporation ； 蛋白质定量试剂盒 （BCA法） 购自Bio-Rad公司 ； Chemiluminesent substrate （化学发光底物） 购自生物晶美公司 ； PVDF 膜购自 Millipore 公司 ； TRIS 缓冲液购自 NOVON 公司 ； Acrylamide（丙烯酰胺） 购自 Solarbio 公司 ； 十二烷基硫酸钠购自 xiamen sanland chemicals comp。
19、any limited ； 琼脂糖、 考马斯亮蓝 R-250、 Aprotimin（抑肽酶） 、 PMSF（苯 甲基磺酰氟）和 NP-40（表面活性剂） ， 均购自 Sanland-chem International InC ； TEMED （N,N,N,N- 四甲基乙二胺， 一种促凝剂） 购自 HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ； X 射线胶片购自 中国乐凯胶片集团公司 ； 二抗为经过纯化的带有过氧化物酶标记的山羊抗鼠及山羊抗兔抗 体， 购自美国 Kirkegaard & laboratories ； 四噻唑蓝 （MTT） 购自美国 Promega 公司。 0015 3、 主。
20、要实验仪器 BHC-1300 A/B3 生物安全柜， 苏州安泰空气技术有限公司生产 ； TS100 生物倒置相 差显微镜， 日本 NIKON 公司生产 ； CO2培养箱， 美国 NBS 公司生产 ； TS-1 脱色摇床， 金纭市 杰瑞尔电器有限公司生产 ； 电子分析天枰， 北京塞多利斯仪器系统有限公司生产 ； 旋涡混 合器， 海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产 ； BYY-6C 双稳定时电泳仪， 北京六一仪器有 限公司生产 ； 酶标仪， 美国 MD 公司生产 ； J-25 离心机， 美国贝克曼公司生产 ； XJX- X 射 线摄影暗匣， 上海跃进医用光学器械厂生产 ； 血球计数板， 上海市求精。
21、生化试剂仪器有限公 司 ； 96 孔板细胞培养板， Biousing Biotechnology 有限公司生产。 0016 实施例 1 ： 四噻唑蓝 （MTT） 法测定替普瑞酮对甲基苯丙胺刺激的 PC12 细胞的保护 作用 1、 PC12 细胞株的培养 PC12 细胞用含 10马血清， 5胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基， 于 37、 5 CO2和 95湿度下进行贴壁培养。每 1-2 天更换培养基一 次， 细胞达约 70 80融合时， 传代或用于实验。 0017 2、 PC12 细胞的排板 说 明 书 CN 102600116 A 5。
22、 4/5 页 6 用 0.25的胰酶将贴壁的 PC12 细胞消化起来， 1500rpm 离心 5min， 除去胰酶。将细胞 均匀的排在 96 孔板中， 排板密度为 1104cell/ 孔， 在含有 10马血清， 5胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基， 于 37、 5 CO2和 95湿度下进 行贴壁培养。 0018 3、 分组刺激 PC12 细胞 细胞培养过夜， 换新鲜 RPMI1640 培养基， 对照组不加药物， 实验组分为三个组， 分别添 加 ：（1） 2 mM 的甲基苯丙胺刺激 24 小时 ；（2） 10 M 替普瑞酮提前 4 小时。
23、预刺激后， 再加 入 2 mM 的甲基苯丙胺刺激 24 小时 ；（3） 单独 10 M 替普瑞酮提前 4 小时预刺激。各组设 3 个平行实验。 0019 4、 四噻唑蓝 （MTT） 试验 取出待测的 96 孔细胞培养板， 每孔加 MTT 溶液 （5 mg/ml） 20 l, 继续孵育 4 小时后， 3000 rpm 室温下离心 15 min， 小心去掉上清， 每孔加入 150 l 二甲基亚砜， 小心混匀， 用 酶标仪在波长 490 nm 处测定吸光度值。 0020 5、 细胞的存活率计算 存活率 = 加药组吸光值 / 对照组吸光值 100 6、 实验结果分析 如图 1 所示， 本发明采用四噻唑。
24、蓝 （MTT） 实验证明， 由甲基苯丙胺 （2 mM） 引起的细胞存 活率的降低可以通过提前30 min 添加替普瑞酮 （10M） 得以恢复， 说明替普瑞酮能够保护 PC12 细胞免于甲基苯丙胺引起的细胞生长抑制。 0021 实施例2 ： Western Blot检测替普瑞酮恢复甲基苯丙胺所致的pro-caspase3蛋白 的降低 1、 细胞株培养和药物刺激 PC12 细胞用含 10马血清， 5胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 1640 培养基， 于 37、 5 CO2和 95湿度下进行贴壁培养， 每 2-3 天更换培养液一次， 细 胞达约 70 80融合时，。
25、 传代或用于实验。 0022 将细胞接种于六孔板中， 培养过夜后， 药物处理细胞。分组处理如下 ： 对照组不加 药， 实验组分别加 ：（1） 2 mM 的甲基苯丙胺 ；（2） 10M 替普瑞酮提前 4 小时预刺激后， 再加 入2 mM的甲基苯丙胺 ；（3） 单独10M替普瑞酮提前4小时预刺激。 上述处理后， 置于37 和 5 CO2培养箱中培养 24 小时， 然后收集细胞， 以提取蛋白 ： 1800 rpm 离心 5 min 收获细 胞， 分别加入100l细胞裂解液 （150 mM NaCl， 0.5 NP-40， 10 mM Tris-HCl， pH 7.2， 0.1 mM PMSF， 2 。
26、g/ml aprotinin， 200 g/ml NaN3） ， 充分混悬后于冰浴下放置裂解 50 min （中间振荡 5 6 次） ， 4下 15000 rpm 离心 15 min， 转上清至新离心管中， -80保存。 0023 2、 免疫印迹 1. 蛋白含量的测定 用BCA试剂盒测定 ： 将5 l标准品或待测样本与200 l工作溶液 （购自美国Bio-Rad Laboratories 公司） 混合， 37孵育 30 min， 将反应管温度冷却至室温。测定 750 nm 光密 度值， 绘制标准曲线， 并计算蛋白浓度。 0024 2蛋白免疫印迹 （Western Blot） 总蛋白加样量为 2。
27、0g， 与 2SDS 凝胶加样缓冲液混合后， 95热变性 5 min， 用 15 说 明 书 CN 102600116 A 6 5/5 页 7 的 SDS-PAGE 胶电泳分离后， 将蛋白条带用电转移到 PVDF 膜上， 用 10脱脂牛奶 4封闭过 夜 ； 取出 PVDF 膜， 用含 0.1 Tween-20 的 TPBS 冲洗后， 加入 1000 倍稀释的一抗室温孵育 60 min ； 用含 0.1 Tween-20 的 TPBS 冲洗， 加入 5000 倍稀释的二抗室温孵育 60 min ； 用 含 0.1 Tween-20 的 TPBS 冲洗， 将 PVDF 膜浸入发光底物溶液中反应 5min， X 射线胶片曝 光。 0025 3、 实验结果分析 caspase-3是凋亡的执行分子， 由pro-casepase-3降解形成。 如图2所示， 本发明采用 蛋白免疫印迹 （Western Blot） 检测试验证明， 由甲基苯丙胺 （2 mM） 引起的pro-casepase-3 降解可以通过提前 30 min 添加替普瑞酮 （10M） 得以恢复， 说明替普瑞酮能够保护 PC12 细胞免于甲基苯丙胺引起的细胞凋亡。 说 明 书 CN 102600116 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102600116 A 8 。