一种含异长春花苷内酰胺的胆木叶组合物及其制剂技术领域
本发明涉及一种中药组合物，特别是一种含异长春花苷内酰胺的胆木叶组合物。本发明还涉及上述胆木叶组合物的制剂。
背景技术
胆木，又名乌檀，药乌檀，黄羊木，为茜草科乌檀属植物乌檀（Nauclea officinalis Pierre ex Pitard）的干燥茎、枝、树皮和根。生于高山近顶或半山腰荫蔽潮湿地带的杂木林中，分布于广东(西部和西南部)、广西和海南等省区。胆木性味苦，寒，具有清热解毒、消肿止痛之功效。我国广西、广东和海南民间常用于感冒发热、肺炎、肠炎、痢疾、湿疹、皮疹、脓疡等病的治疗。国内目前有“胆木注射液”和“胆木浸膏片”中药制剂，临床用于急性扁桃腺炎，急性咽喉炎，急性结膜炎及上呼吸道感染。 “胆木注射液”和“胆木浸膏片”均以胆木心材作为原药材入药制备，年缺口500吨以上，备受原料的制约。而以胆木叶代替胆木心材作为原药材，有利于可持续开发利用和保护胆木资源。
目前针对胆木叶的公开专利文献主要为胆木叶制备工艺的技术方案，尚未见利用胆木叶制备总黄酮和3个生物碱（异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺、短小蛇根草苷）的总含量在50%~98%之间的组合物，也未见将该组合物用于制备清热化痰、止咳平喘的药物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种成分明确、质量可控、疗效确切的胆木叶组合物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了以上述胆木叶组合物为原料的制剂。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明所述的一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，其特点是：该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；所述的组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为50-98%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10～0.7 ：0.5～10。
根据对多批次胆木叶组合物的分析，以下是本发明的优选技术方案。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 3-46%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 1-24%；
短小蛇根草苷 0.2-21%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 0.5-20%；
芦丁 0.1-21%。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 4-40%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 2-20%；
短小蛇根草苷 0.2-15%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1-15%；
芦丁 0.1-15%。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 5-35%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 3-15%；
短小蛇根草苷 0.2-10%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1.1-13%；
芦丁 0.1-10%。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 5-34%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 3-10%；
短小蛇根草苷 0.2-5%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1.2-12%；
芦丁 0.1-5%。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10～2 ：2～10。
以上所述的胆木叶组合物，其特点是：该组合物中，异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10～3 ：3～10。
本发明还公开了一种如以上技术方案所述的胆木叶组合物制剂，其特点是，它以胆木叶组合物为有效原料，加入药剂学上可接受的药用辅料，制成临床上可接受的任何一种剂型的药剂，其剂型包括但不限于片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
本发明所述的胆木叶组合物可以通过现有技术中公开的方法获得。也可以采用常规中药提取方法获得。采用前述方法获得胆木叶提取物后，按现有技术方法或者按本发明提供的方法进行检测本发明组合物所述的主要成份的含量，当含量达不到本发明要求的含量时，可以进行相关单体添加，或者对提取物进行进一步提纯，从而得到本发明所述的胆木叶组合物。
以下列举如下3种方法制备3批本发明所述的胆木叶组合物。
1、取胆木叶300kg，粉碎，加70%的乙醇溶液回流提取，提取液滤过，减压浓缩，放至室温，进行碱溶酸沉处理：加NaOH溶液调节pH至弱碱性，滤过；滤液加盐酸溶液调节pH至弱酸性，离心，上清液备用；沉淀再进行2次碱溶酸沉处理，合并3次碱溶酸沉处理的上清液，上HPD100树脂柱，依次用水、25%乙醇溶液洗脱除杂；以4倍柱体积的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，减压干燥，得浸膏粉5.8kg，批号为20091008。
2、取胆木叶300kg，粉碎，加70%的乙醇溶液回流提取，提取液滤过，减压浓缩，放至室温，加NaOH溶液调节pH至弱碱性，滤过；滤液上HPD100树脂柱，依次用水、30%乙醇溶液洗脱除杂；以4倍柱体积的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，喷雾干燥，得浸膏粉4.5kg，批号为20091026。
3、取胆木叶300kg，粉碎，加70%的乙醇溶液回流提取，提取液滤过，减压浓缩，放至室温，加NaOH溶液调节pH至近中性，离心，上清液上HPD100树脂柱，依次用水、30%乙醇溶液洗脱除杂；以3.5倍柱体积的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，减压或喷雾干燥，得浸膏粉3.2kg，批号为20091221。
本发明对胆木叶组合物进行了物质基础研究。经反复硅胶柱层析和半制备HPLC制备，分离得到5个主要成份，利用波谱分析，并与参考文献对照，鉴定出3个生物碱成分：异长春花苷内酰胺（strictosamide）、10-羟基异长春花苷内酰胺（10-hydroxy strictosamide）、短小蛇根草苷（Pumiloside）；2个黄酮成分：山奈酚-3-O-芸香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside）、芦丁（Rutin），结构鉴定数据如下：
异长春花苷内酰胺（strictosamide）：白色无定形粉末(甲醇)，mp 179~180℃。UV(CH3OH) λmax nm: 202，226.5。ESI-MS m/z: 499.2（M＋H+）。1H NMR (DMSO-d6，500MHz) δ: 7.37 (1H，d，J =6.96 Hz，H-9)， 7.23 (1H，d，J =2.30Hz，H-17)，7.33(1H，d，J = 6.96 Hz，H-12)，7.06 (1H，td，J = 6.96，1.88 Hz，H-11)，6.97 (1H，t，J =6.96 Hz，H-10)，5.60 (1H，dt，J = 19.47，10.2Hz，H-19)，5.37 (1H，d， J = 1.8Hz，H-21) ，5.33(1H，dd，J = 19.47，1.8 Hz，Ha-18)，5.30 (1H, dd，J = 10.2，1.8 Hz，Hb-18)， 5.02 (1H，d，J =3.91 Hz，H-3)，4.78 (1H，dt，J = 14.83，6.43 Hz，Ha-5)，4.44 (1H，d，J = 7.91Hz，H-1')，3.66(1H，ddd，J =11.63，5.71，1.84Hz，Ha-6')，3.41 (1H，dt，J = 11.63，5.71Hz，Hb-6')，2.95～3.12 (3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，2.97 (1H，m， Hb-5)，2.82 (1H，m，H-2')，2.79~2.84 (1H，m，Ha-6)，2.58~2.62 (3H，m，Hb-6，H-15，H-20)，2.49 (1H，br，Ha-14)，1.90 (1H，td，J = 13.43，5.72Hz，Hb-14)。13C NMR (DMSO-d6，125 MHz) δ: 134.64 (C-2)，52.75 (C-3)，42.98 (C-5) ，20.71 (C-6)，108.54 (C-7)，127.13 (C-8)，117.7 (C-9)，118.79(C-10)，121.06 (C-11)，111.40 (C-12)，135.81 (C-13)，25.78 (C-14) ，23.55 (C-15)，107.67 (C-16) ，149.69 (C-17)，119.97 (C-18)，133.43 (C-19)，42.47 (C-20)，95.93 (C-21)，163.55 (C-22)， 99.08 (C-1')，72.80 (C-2')，77.28 (C-3')，70.05 (C-4')，76.87(C-5')，61.11(C-6')。
10-羟基异长春花苷内酰胺（10-hydroxy strictosamide）：浅黄色无定形粉末(甲醇)。UV(CH3OH) λmax nm: 207、230、276。ESI-MS m/z: 515.3（M＋H+）。1H NMR (CD3OD，300MHz) δ: 6.76 (1H， d，J =1.92 Hz，H-9)，7.37 (1H，d，J =2.34 Hz，H-17)，7.15(1H，d，J = 8.16 Hz，H-12)，6.65(1H，dd，J = 8.34，2.34 Hz，H-11)，5.58~5.70 (1H，m，H-19)，5.39 (1H, dd，J =6.48，1.68Hz，Hb-18，H-21)，5.31(1H，dd，J =10.11，2.04 Hz，Ha-18)，5.03(1H，s，H-3)，4.92 (1H，dd，J =5.22，12.69Hz，Hb-5)，2.94~3.11 (1H，m，Ha-5)，4.58 (1H，d，J = 7.89Hz，H-1')，3.63 (1H，dd，J =5.43，11.82Hz，Ha-6')，3.86 (1H，dd，J =5.43，9.99Hz，Hb-6')，3.16~3.32 (3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，2.94~3.11 (1H，m，H-2')，2.88 (H，m，Hb-6)，2.56 (1H，m，Ha-6)， 2.77 (1H，m，H-15)， 2.66 (H，m，H-20)，1.95~2.06 (1H，m，Ha-14) ，2.40~2.44 (1H，m，Hb-14)。13C NMR (CD3OD， 75 MHz) δ: 135.5 (C-2)，55.1 (C-3)，44.7 (C-5)，22.1 (C-6) ，109.6 (C-7) ，129.4 (C-8) ，103.1 (C-9)，151.5 (C-10)，112.6 (C-11)，112.2 (C-12)，132.5 (C-13)，27.2 (C-14)，24.9 (C-15)，109.2 (C-16)，120.4 (C-17)，134.3 (C-18)，44.8 (C-19) ,98.0 (C-20)，167.0 (C-21)， 100.5 (C-1')，74.3 (C-2')，78.2 (C-3')，71.3 (C-4')，77.9 (C-5')， 62.6 (C-6')。
短小蛇根草苷（Pumiloside）：白色具棒状结晶(甲醇)，mp 286～288℃。UV(CH3OH) λmax nm: 210、244、315、328。ESI-MS m/z: 513.3（M＋H+）。1H NMR (DMSO-d6，500MHz) δ: 8.13(1H，d，J = 8.1 Hz，H-9)，7.67 (1H，m，H-11)，7.60 (1H，d，J =8.2Hz，H-12)，7.35 (1H，t，J = 8.1 Hz，H-10)，7.05 (1H，d，J =2.6 Hz，H-17)，5.82 (1H，m，H-19)，5.48 (1H，dd，J = 17.1，1.7Hz，H-18a)，5.40 (1H，s，H-21)，5.35 (1H，dd，J = 10.3，1.7Hz，H-18b)，4.77 (1H，d，J =12.0 Hz，H-3)，4.55 (1H，m，H-1')，4.48(1H，d，J =14.2 Hz，H-5a)，4.33 (1H，d，J =14.2 Hz，H-5b)，3.70(1H，m，Ha-6') ，3.44 (1H，m，Hb-6')，3.29 (1H，m，H-15) ，3.16~3.21 (2H，m，H-5'，H-3')， 2.97~3.07 (2H，m，H-4'，H-2') ，2.66(1H，m，H-20)，2.66 (1H, m，H-14a)，2.02 (1H, m，H-14b)。13C NMR (DMSO-d6，125MHz) δ: 149.60 (C-2)，59.40(C-3)，47.40(C-5)，112.89 (C-6)，172.89 (C-7)，125.28 (C-8)，124.66(C-9)，123.15(C-10)，131.48(C-11) ，118.31(C-12)，140.31 (C-13)，28.13 (C-14)，23.63 (C-15)，108.89 (C-16)，145.02 ( (C-17)，120.41 (C-18)，132.47(C-19)，43.56 (C-20)，94.81 (C-21) ，163.88(C-22) ，97.78(C-1') ，73.12(C-2')，77.23 (C-3')，70.05 (C-4')，76.44 (C-5')，61.04 (C-6')。
山奈酚-3-O-芸香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside）：黄色粉末(甲醇)，mp 191～192℃。UV(CH3OH) λmax nm: 209 nm、233 nm、269nm、372nm。ESI-MS m/z: 617.2[M＋Na]+。1H NMR (DMSO-d6，300MHz) δ: 12.53 (1H，s，5-OH)， 7.98(2H，d，J=8.58Hz，H-2'，6')，6.87(2H，d，J =8.73Hz，H-5'，3')，6.17 (1H，s，H-6)，6.38(1H，s，H-8)， 0.99 (3H，d ，J =6.03Hz，H-6''')。13C NMR (DMSO-d6，75MHz) δ: 156.6 (C-2)，133.1 (C-3)，177.2 (C-4)，161.1 (C-5)，98.9 (C-6)，161.1 (C-7)，93.8 (C-8)，156.5 (C-9)，103.6 (C-10)，120.9 (C-1') ，130.8(C-2')， 115.0(C-3')，159.8(C-4')，115.1 (C-5')，120.9 (C-6')，101.4 (C-1'') ，74.1 (C-2'')，76.3 (C-3'')，70.6 (C-4'')，75.7 (C-5'')，66.9 (C-6'') ，100.7 (C-1''') ，70.3 (C-2''')，70.6 (C-3''')，71.8 (C-4''')，68.2 (C-5''')，17.7 (C-6''')。
芦丁（Rutin）：黄色粉末(甲醇)，mp185～187℃。UV(CH3OH) λmax nm: 203 nm、258 nm、358 nm。1H NMR (DMSO-d6，300MHz) δ: 6.19 (1H，s，H-6)，6.38(1H ，s，H-8)，6.84(1H，d，J =8.31Hz，H-5')，7.54(2H，d，J =6.78Hz，H-6'，2')，0.99d（3H，J =5.82，H-6'''）。 13C NMR (DMSO-d6，75MHz) δ: 156.5 (C-2)，133.3 (C-3)，177.3 (C-4)，156.5 (C-5)，98.6 (C-6)，164.1 (C-7)，93.5 (C-8)，161.2 (C-9)，103.9 (C-10)，121.5 (C-1') ，115.2 (C-2')， 144.7(C-3')，148.4(C-4')，116.2 (C-5')，121.1 (C-6')，101.2 (C-1'') ，74.0 (C-2'')，76.4 (C-3'')，70.5 (C-4'')，75.9 (C-5'')，66.9 (C-6'') ，100.7 (C-1''') ，70.3 (C-2''')，70.5 (C-3''')，71.8 (C-4''')，68.2 (C-5''')，17.7 (C-6''')。
本发明对胆木叶组合物进行了含量分析，包括5个主要成份：异长春花苷内酰胺（strictosamide）、10-羟基异长春花苷内酰胺（10-hydroxy strictosamide）、短小蛇根草苷（Pumiloside）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside）、芦丁（Rutin）的HPLC分析，及总黄酮的UV检测。具体方法和结果如下：
一、胆木叶组合物的HPLC分析：
1、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈，从15% B开始以线性梯度方式经30min达到32% B，再经5min达到95% B，检测波长：226nm（异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺、短小蛇根草苷）、360nm（山奈酚-3-O-芸香糖苷、芦丁），流速：1ml/min，柱温：30℃，理论板数按异长春花苷内酰胺计应不低于3000。
2、对照品溶液的制备：取各对照品适量，精密称定，加乙醇溶解，制成0.1mg/ml的溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
3、供试品溶液的制备：精密称取浸膏粉20mg至10ml量瓶中,加乙醇适量使溶解并定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
4、测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算。
二、总黄酮的UV检测：参照2010版药典一部槐花项下总黄酮含测方法。
1、对照品溶液的制备：精密称取置P2O5干燥器中真空干燥24h的芦丁50mg，置25ml量瓶中，用甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1ml中含芦丁0.2mg）。
2、标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亚硝酸钠1ml，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白，照紫外-可见分光光度法，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3、供试品溶液的配制：取胆木叶组合物10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用甲醇适量，置水浴上微热，使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
4、样品测定：精密量取供试品溶液5ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的重量（μg），计算，即得。
三、胆木叶组合物主要成分的含量分析结果：详见下表。
胆木叶组合物中五种化合物及总黄酮的含量测定结果(%)一览表
发明人采用多批胆木叶组合物开展了的相关药效作用实验。在药效实验中，胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC均分别设置了不同剂量（为本文剂量的0.5、1、2倍等）进行相关药效考察，均具有相关的药效作用，且在不同实验中体现出了一定的量效关系，本发明中仅列出了各组单剂量（等效量）的考察结果，其余剂量组在本发明中不再赘述。
一、胆木叶组合物止咳试验－对浓氨水所致小鼠咳嗽的影响。
ICR小鼠50只，雄性，体重18~22g，随机分5组：(1) 空白对照组：给予生理盐水；(2) DMYA组：0.4g/kg；(3) DMYB组：0.4g/kg；(4) DMYC组：0.4g/kg；(5) 急支糖浆组：22 ml/kg。(1)~(4)给药容积均为10 ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5 d。末次给药45 min，将小鼠置于500 ml的钟罩中，以超声雾化器将25%浓氨水喷雾5秒钟，然后观察和记录小鼠咳嗽的潜伏期和5分钟内咳嗽的次数。结果见表1。
胆木叶组合物对小鼠氨水所致引咳潜伏期和咳嗽次数的影响()
与空白对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。
实验结果表明：胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组能明显延长氨水所致小鼠咳嗽潜伏期，减少小鼠的咳嗽次数。
二、胆木叶组合物止咳试验－对电刺激所致豚鼠咳嗽的影响。
取豚鼠60只，雌雄兼用，体重300~400g，随机分6组：(1) 空白对照组：给予生理盐水；(2) DMYA组：0.14g/kg鼠重给药；(3) DMYB组：0.14g/kg鼠重给药；(4) DMYC组：0.14g/kg鼠重给药； (5)急支糖浆组：8.6 ml/kg鼠重给药；(1)~(5)给药容积均为10 ml/kg，各组每天给药一次，连续给药5 d，末次给药后30 min，以25%的乌拉坦1 g/kgip麻醉，分离气管，插入Y形气管套管，一个支管与压力换能器相连，连接二道生理记录仪器，记录呼吸运动。用一白金制的单极电极固定于气管背面，另一无关电极插入胸部皮下组织中(手术过程10 min做完)。于给药45 min时，采用刺激强度3.5 V，脉冲宽度50 ms，频率10次/秒，刺激时间20 s，从记录纸读取咳嗽次数。结果见表2。
表2 胆木叶组合物对豚鼠电刺激所致的咳嗽次数的影响()
与空白对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。
实验结果表明：胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数。与对照组比较有显著性差异（P<0.01）。
三、胆木叶组合物平喘作用－对氯化乙酰胆碱和磷酸组胺诱发豚鼠哮喘作用。
健康豚鼠100只，180～200g，雌雄各半。适应性饲养3日后，进行筛选试验。将豚鼠分别置于小动物多功能诱咳引喘仪中，恒压喷入引喘试剂（2%氯化乙酰胆碱和0.1%磷酸组胺1:1混合液，临用前混合）15s，观察豚鼠引喘潜伏期（从喷雾开始至哮喘发作、呼吸困难、直至抽搐跌倒的时间），一般不超过120s，超过者则作为不敏感，不予选用（根据实验时的实际情况对喷雾时间及观察时间等参数进行调整）。
将筛选合格的豚鼠，按体重随机分组，即（1）空白对照组：等量生理盐水；（2）阳性药组：氨茶碱片0.05g/kg； (3) DMYA组：0.14g/kg鼠重给药；(4) DMYB组：0.14 g/kg鼠重给药；(5) DMYC组：0.14g/kg鼠重给药。以上各组均灌胃给药，给药体积10ml/kg。连续3天，第3次给药后1小时，将豚鼠逐一置于小动物多功能诱咳引喘仪中，恒压喷入引喘试剂15s（根据预试结果），记录引喘潜伏期及3min内跌倒的只数。不跌倒者引喘潜伏期以180s计算。结果见表3。
表3 胆木叶组合物对氯化乙酰胆碱和磷酸组胺诱发豚鼠哮喘的影响()
与模型对照组比较， ** P<0.01。
实验结果显示：与模型对照组相比，各给药组豚鼠哮喘发作期和引喘潜伏期均有一定的延长，胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组对组胺、乙酰胆碱诱发的豚鼠哮喘具有一定的抑制活性，对豚鼠哮喘发病程度具有一定缓解作用。
四、胆木叶组合物平喘作用－对卵白蛋白OVA诱发小鼠过敏性哮喘作用。
健康BALB/c小鼠10只，18-22g，全雌。适应性饲养3日后，用OVA10μg，佐剂为Al(OH)31.5 mg，i.p.3次，7d/次，末次注射后3d用1%OVA连续雾化吸入2 d，每次10min。观察小鼠反应，表现为明显的喷嚏，头面部瘙痒，呼吸加深加快，安静少动，弓背，前肢缩抬，尿便失禁为阳性反应，表明哮喘模型建立成功。
将健康BALB/c小鼠，按体重随机分组，即（1）空白对照组：等量生理盐水；（2）模型对照组：等量生理盐水；（3）阳性药组：氨茶碱片0.1ｇ/kg；（4) DMYA组：0.4g/kg；（5) DMYB组：0.4 g/kg；（6) DMYC组：0.4g/kg。适应性饲养3日后，用0.5mlOVA10μg，佐剂为Al(OH)31.5 mg，i.p.3次，7天/次，末次注射后3天用1%OVA连续雾化吸入2 天，每次10min，空白组用生理盐水。观察小鼠置于小动物多功能诱咳引喘仪中雾化10min引喘潜伏期，不发生哮喘的以10min记。结果见表4。
表4 胆木叶组合物对卵白蛋白OVA诱发小鼠过敏性哮喘的影响()
与模型对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。
实验结果显示：与模型对照组相比，各给药组小鼠哮喘发作期和引喘潜伏期均有一定的延长，胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组对卵白蛋白OVA诱发小鼠过敏性哮喘具有一定的抑制活性，对小鼠哮喘发病程度具有一定缓解作用。
五、胆木叶组合物化痰作用－对小鼠的祛痰作用(气管段酚红法)
取昆明种小鼠80只，雄性，体重20~25 g，随机分5组：(1) 空白对照组：给予容积生理盐水；(2) DMYA组：0.4g/kg；(3) DMYB组：0.4 g/kg；(4) DMYC组：0.4g/kg；(5) 氯化氨组：1.0 g/kg；各组每天给药一次，连续给药3 d，给药容积均为10 ml/kg。末次给药30 min后，腹腔注射5%酚红生理盐水溶液500 mg/kg，注射后30分钟，处死动物，分离气管，以1 ml注射器取2.24 mmol/L NaHCO3溶液0.5 ml，冲洗气道3次，吸取灌洗液0.5 ml，重复上述操作3次，共吸取灌洗液1.5 ml，将冲洗液吸入试管。在波长546 nm处，测量OD值。结果见表5。
表5 胆木叶组合物对小鼠气管内酚红排出量的影响()
与空白对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。
实验结果表明：胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组均能明显增加小鼠气道酚红排出量，与对照组比较具有明显差异。表明胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。
六、 胆木叶组合物化痰作用－对大鼠排痰量的影响(毛细玻管法)
取大鼠80只，随机分5组：(1) 空白对照组：给予容积生理盐水；(2) DMYA组：0.2g/kg鼠重给药；(3) DMYB组：0.2 g/kg鼠重给药；(4) DMYC组：0.2g/kg鼠重给药；(5) 氯化氨组：0.5g/kg鼠重给药。实验前禁食不禁水12小时。大鼠乌拉坦1g/kg腹腔麻醉后，仰位固定。剪开颈中部皮肤，分离出气管，在甲状腺软骨下缘正中两软骨环之间用尖锐的注射针头扎一小孔，然后插入玻璃毛细管一根，使毛细管刚好接触气管底部表面，借以吸取气管后部之痰液。当毛细管内被液充满时，立即换一根。以毛细管吸取痰液长度作为药物的化痰效果。记录前2小时的正常分必量后，灌胃给药，继续再观察4小时分泌量。结果见表6。
表6 胆木叶组合物对大鼠的祛痰作用(毛细管排痰量)
与空白对照组比较，* P<0.05，** P<0.01。
实验结果表明，胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组能明显增加大鼠的排痰量，表明胆木叶组合物有显著的祛痰作用。
通过上述实验，本发明的有益效果如下：
胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组能明显延长氨水所致小鼠引咳潜伏期，减少小鼠的咳嗽次数；胆木叶组合物各组能明显减少豚鼠电刺激所致咳嗽次数。提示胆木叶组合物具有治疗咳嗽的功效。
胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组对组胺、乙酰胆碱诱发的豚鼠哮喘具有一定的抑制活性，对豚鼠哮喘发病程度具有一定缓解作用。胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组对卵白蛋白OVA诱发小鼠过敏性哮喘具有一定的抑制活性，对小鼠过敏性哮喘发病程度具有一定缓解作用。提示胆木叶组合物具有治疗哮喘（过敏性哮喘）等功效。
胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组均能明显增加小鼠气道酚红排出量，与对照组比较具有明显差异。表明胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组具有增加气道分泌物，促进痰液排出的作用。胆木叶组合物DMYA、DMYB、DMYC各组能明显增加大鼠的排痰量，表明胆木叶组合物有显著的化痰作用。提示胆木叶组合物具有治疗咳痰的功效。
七、胆木叶组合物的初步毒性评价：以下结果表明，胆木叶组合物是安全的。
（1）小鼠MTD试验：以DMYA、DMYB、DMYC0.6g/ml药液，一日内2次给予小鼠，每次给药30ml/kg，折合剂量36g/kg，动物给药后除部分出现活动减少外，其它未出现死亡、毒性异常反应，解剖也未见异常。提示本品在小鼠最大给药量试验中较为安全。此剂量约为拟临床人用剂量的1050倍。
（2）大鼠MTD试验：以0.6g/ml药液，一日内两次给予大鼠，每次给药20ml/kg，折合剂量24g/kg，动物给药后活动减少，其它未出现死亡，解剖也未见异常。提示本品在大鼠最大给药量试验中有一定的不良反应。此剂量约为拟临床人用剂量的700倍。
（3）大鼠长毒预试验：以0.15g/ml、0.3g/ ml药液，一日内一次给予大鼠，每次给药10ml/kg，折合剂量1.5g/kg、3g/kg，动物给药后活动减少，血液检查、解剖和病检未见异常。提示本品高剂量运用在大鼠长毒试验中未见明显的不良反应。此剂量约为拟临床人用剂量的87.5倍。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为50%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10 ：0.5。
实施例2。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为98%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为0.7 ：10。
实施例3。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为80%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10～0.7 ：0.5～10。
实施例4。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为90%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10：3。
实施例5。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为70%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为3 ：10。
实施例6。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为55%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为8 ：10。
该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 3%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 24%；
短小蛇根草苷 0.2%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 20%；
芦丁 0.1%。
实施例7。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为85%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为10 ：4。
该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 46%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 1%；
短小蛇根草苷 21%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 0.5%；
芦丁 10%。
实施例8。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为62%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为4 ：10。
该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 4%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 10%；
短小蛇根草苷 3%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 10%；
芦丁 21%。
实施例9。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为71%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为8 ：1。
该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 40%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 2%；
短小蛇根草苷 10%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1%；
芦丁 5%。
实施例10。一种含异长春花苷内酰胺胆木叶组合物，该组合物在制备清热化痰、止咳平喘的药物中的应用；或者在制备治疗支气管哮喘、急慢性支气管炎、阻塞性肺气肿疾病引起的咳痰、咳喘以及过敏性哮喘的药物中的应用；该组合物由从胆木叶中提取的生物碱与黄酮类化合物组合而成；所述的生物碱中含有异长春花苷内酰胺、10-羟基-异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷；所述的黄酮类化合物中含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁；组合物中，前述3种生物碱与黄酮类化合物的总重量占组合物的重量百分比为51%，且前述3种生物碱的总重量与黄酮类化合物的总重量比为7：2。
该组合物中，主要原料所占的重量百分比为：
异长春花苷内酰胺 5%；
10-羟基-异长春花苷内酰胺 15%；
短小蛇根草苷 2%；
山奈酚-3-O-芸香糖苷 1.2%；
芦丁 1.5%。
实施例11。一种如实施例1-10任何一项所述的胆木叶组合物制剂，它以胆木叶组合物为有效原料，加入药剂学上可接受的药用辅料，制成临床上可接受的任何一种剂型的药剂，其剂型包括但不限于片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
实施例12。实施例1-10任何一项所述的胆木叶组合物，可以通过以下所述的方法之一获得：
1、取胆木叶，加75%乙醇回流提取2次，提取液滤过，滤液合并，减压浓缩，碱溶酸沉二次，上清液上HPD100大孔吸附树脂柱，分别以水、35%乙醇溶液除杂，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，粉碎成细粉，即得胆木叶组合物。
2、取胆木叶，加65%乙醇回流提取2次，提取液滤过，滤液合并，减压浓缩，碱溶，滤过，滤液上D101大孔吸附树脂柱，分别以水、25%乙醇溶液除杂，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩真空干燥，粉碎成细粉，即得胆木叶组合物。
3、取胆木叶，加80%乙醇，热回流提取2次，提取液过滤，滤液合并，减压浓缩，碱溶，滤过，调pH至5.5，滤过，滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，分别以水、30%乙醇溶液除杂，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，即得胆木叶组合物。
4、取胆木叶，加水提取，滤过，浓缩，用醇沉与过大孔树脂方法除去杂质，即得胆木叶组合物。
5、取胆木叶，加水提取，滤过，浓缩，经有机溶剂氯仿、醋酸乙酯或正丁醇萃取并回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
6、取胆木叶，加水提取，滤过，浓缩，经有机溶剂异丙醇、戊醇、醋酸乙酯、醋酸丁酯或其它有机溶剂萃取并回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
7、取胆木叶，加乙醇适量提取，滤过，浓缩，经水沉方法除去杂质，即得胆木叶组合物。
8、取胆木叶，加乙醇提取，滤过，浓缩，用有机溶剂氯仿、醋酸乙酯或正丁醇的萃取并回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
9、取胆木叶，加乙醇提取，滤过，浓缩，用有机溶剂异丙醇、戊醇、醋酸乙酯、醋酸丁酯或其它有机溶剂萃取并回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
10、取胆木叶，用乙醇提取，滤过，用水沉的方法除去杂质，即得胆木叶组合物。
11、取胆木叶，加亲脂性有机溶剂正丁醇适量提取，过滤，回收有机溶剂正丁醇，即得胆木叶组合物。
12、取胆木叶，加亲脂性有机溶剂醋酸乙酯适量提取，滤过，回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
13、取胆木叶，加亲脂性有机溶剂氯仿或异丙醇适量提取，滤过，合并提取液，回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。
14、取胆木叶，加亲脂性有机溶剂戊醇、醋酸乙酯、醋酸丁酯或其它亲脂性有机溶剂适量提取，滤过，合并提取液，回收有机溶剂，即得胆木叶组合物。