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1、(10)申请公布号 CN 102600481 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102600481 A *CN102600481A* (21)申请号 201210073529.7 (22)申请日 2012.03.20 CGMCC No. 5825 2012.02.29 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 39/187(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12N 15/861(2006.01) C12N 7/01(200。
2、6.01) (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427 号 (72)发明人 仇华吉 孙元 (74)专利代理机构 北京市德权律师事务所 11302 代理人 余光军 (54) 发明名称 腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟 疫苗及其应用 (57) 摘要 本发明公开了腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子 嵌合载体猪瘟疫苗及其应用。本发明首先构建了 携带日本脑炎病毒复制子、 稳定表达 EGFP 基因 的重组嵌合腺病毒， 在此基础上， 本发明进一步用 猪瘟病毒 E2 基因替换嵌合载体中的 EGFP 基因， 构建了含有猪瘟病毒 E2 基因的重。
3、组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-E2。间接免疫荧光试验证明， 猪瘟病毒 E2蛋白在重组嵌合腺病毒rAdV-JEV-E2感染后的 HEK293 细胞中得到稳定、 高效的表达 ； 免疫攻毒 试验结果显示， 本发明所构建的重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-E2 具有良好的免疫保护作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗 , 其特征。
4、在于， 包括 ： 复制缺陷性 人 5 型腺病毒、 日本脑炎病毒复制子和待表达的抗原基因。 2. 按照权利要求 1 所述的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗， 其特征在于 ： 在日本脑炎病毒复制子SpeI位点前插入质粒pCI的内含子序列 ； 所述质粒pCI的内含子序 列的核苷酸序列为 SEQ ID No.1 所示。 3. 按照权利要求 1 所述的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗， 其特征在于 ： 待表达的抗原基因位于 JEV 复制子载体的SpeI 和SalI 位点之间。 4. 按照权利要求 1-3 任何一项所述的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗， 其 特征在于 ： 所。
5、述的待表达的抗原基因是猪瘟病毒E2基因、 猪蓝耳病病毒GP5基因、 猪圆环病 毒 2 型 Cap 基因或猪流感病毒 HA 基因。 5. 权利要求 1-3 任何一项所述的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗在制备 动物疫苗中的用途。 6. 一种构建 1-3 任何一项所述腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗的方法， 包 括以下步骤 ： （1） 将日本脑炎病毒复制子插入到腺病毒穿梭载体中 ；（2） 将来自 pCI 载体的嵌合内含 子以及待表达的抗原基因插入到日本脑炎病毒复制子中， 得到重组转移载体 ；（3） 将转移 载体线性化后转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞， 得到重组腺粒 ；（4）。
6、 将重组腺粒线 性化后转染细胞， 传代直至出现细胞病变， 得到含有表达抗原基因的腺病毒 / 日本脑炎病 毒复制子嵌合载体疫苗。 7. 按照权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的腺病毒穿梭载体包括 pShuttle、 pShuttle-CMV、 pAdTrack 或 pAdTrack-CMV ； 优选为 pShuttle-CMV。 8. 按照权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中在日本脑炎病毒复制子SpeI 位点前插入质粒 pCI 的内含子序列 ； 待表达的抗原基因插入到 JEV 复制子载体的SpeI 和 SalI 位点之间。 9. 腺病毒 / 。
7、日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗， 其微生物保藏号是 ： CGMCC.5825。 10. 权利要求 9 所述的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗在制备预防日 本脑炎病毒或 / 和猪瘟病毒的疫苗中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102600481 A 2 1/7 页 3 腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种携带有抗原基因的嵌合载体疫苗及其应用， 尤其涉及腺病毒 / 日 本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用， 属于嵌合载体猪瘟疫苗领域。 背景技术 0002 腺病毒载体因其具有宿主范围广泛、 安全性高、 病毒粒子稳定、 基因。
8、组较少发生重 排、 易于 DNA 重组技术操作、 具有高效递送和表达外源基因等优点， 成为最常用的病毒载体 之一。 复制缺陷性人5型腺病毒载体因缺失了病毒非必需基因区(E1/E3)， 使其能够携带大 片段的外源基因， 又由于它是复制缺陷性的， 对人及动物产生一过性感染， 安全性高。 0003 RNA 复制子， 即自主复制病毒 RNA， 是在 RNA 病毒感染性克隆的基础上用其它外 源基因替换病毒结构蛋白基因、 保留其非结构蛋白基因和非编码区而发展的表达系统， 它利用正链 RNA 病毒的自主复制特性， 转染细胞后能够在表达病毒非结构蛋白的同时 高效表达外源蛋白 ( 余云舟， 俞炜源 . 黄病毒属。
9、病毒复制子载体研究进展 . 生物技术通 讯， 2006， 17(2) ： 228-231)。RNA 复制子疫苗具有很强的优势， 如 ： 有自主复制能力， 病毒 自身调节功能蛋白的表达不受细胞影响， 病毒蛋白表达量高等优点 (Polo JM， Dubensky TW.Virus-based vectors for human vaccine applications.Drug Discovery Today， 2002， 7(13) ： 719-727.)。不足之处是， RNA 复制子载体不能有效地进入体内。另外， 黄病毒 复制子载体蛋白对宿主菌具有一定的毒副作用， 这可能是造成黄病毒复制子载体。
10、不稳定的 主要因素 (Rice CM， Grakoui A， Galler R， et al.Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.New Biol， 1989， 1(3) ： 285-96.)。 0004 黄病毒eDNA在细菌中存在不稳定性， 日本脑炎病毒(JEV)复制子载体也存在这种 情况(Lai CJ， Zhao BT， Hori H， et al.Infectious RNA transcribed from s。
11、tably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus.Proc Natl Acad Sci USA， 1991， 88(12) ： 5139-5143 ； Sumiyoshi H， Hoke CH， Trent DW， et al.Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates.J Virol， 1992， 66(9) ： 5423-5431.)。目前国内外关于以腺病毒递送 JEV 复制子表达载。
12、体的研究尚未见报 道。 发明内容 0005 本发明的目的之一是提供一种携带抗原基因的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌 合载体疫苗 ； 0006 本发明的目的之二是提供一种构建所述携带抗原基因的腺病毒 / 日本脑炎病毒 复制子嵌合载体疫苗的方法 ； 0007 本发明的目的之三是提供一种腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗 ； 0008 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 ： 说 明 书 CN 102600481 A 3 2/7 页 4 0009 一种腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗， 包括 ： 复制缺陷性人 5 型腺病 毒、 日本脑炎病毒复制子和待表达的抗原基因 ； 。
13、其中， 在日本脑炎病毒复制子 SpeI 位点前 ( 即 ： 位于 JEV SA14-14-2 株基因组第 164-165 位核苷酸 ) 插入质粒 pCI 的内含子序列 ； 待 表达的抗原基因位于 JEV 复制子载体的 SpeI 和 SalI 位点之间。 0010 其中， 所述质粒 pCI 的内含子序列的核苷酸序列为 SEQ ID No.1 所示。 0011 本发明所述的 “待表达的抗原基因” 可以是猪瘟病毒E2基因、 猪蓝耳病病毒GP5基 因、 猪圆环病毒 2 型 Cap 基因或猪流感病毒 HA 基因等抗原基因 ； 优选为猪瘟病毒 E2 基因。 0012 本发明的另外一种目的是提供一种构建所述。
14、腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合 载体的方法， 包括以下步骤 ： 0013 (1)将日本脑炎病毒(JEV)复制子插入到腺病毒穿梭载体中 ； (2)将来自pCI载体 的嵌合内含子序列以及待表达的抗原基因插入到 JEV 复制子中， 得到转移载体 ； (3) 将转移 载体线性化后转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞， 得到重组腺粒 ； (4) 将所得重组腺 粒线性化后转染细胞， 传代直至出现细胞病变， 得到含有表达抗原基因的腺病毒 / 日本脑 炎病毒复制子嵌合载体疫苗。 0014 其中， 步骤 (1) 中所述的腺病毒穿梭载体包括 pShuttle、 pShuttle-CMV、 pAdTrack 或 。
15、pAdTrack-CMV 等 ； 优选为 pShuttle-CMV ； 0015 步骤 (2) 中在日本脑炎病毒复制子 SpeI 位点前插入质粒 pCI 的内含子序列 (SEQ ID No.1) ； 此外， 将待表达的抗原基因插入到 JEV 复制子载体的 SpeI 和 SalI 位点之间。 0016 步骤 (4) 中所述的细胞优选为 HEK293 细胞。 0017 本发明中所使用的 JEV 复制子保留了 JEV 所有非结构蛋白， 能在抵抗外源病毒的 同时对 JEV 也有一定的保护作用。采用腺病毒递送 JEV 复制子表达系统， 充分利用了复制 子能高效表达外源基因的优点， 又解决了核酸疫苗不容易。
16、进入动物体内的问题。在本发明 人的前期工作中， 获得了表达 EGFP 蛋白的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子载体嵌合病毒， 但 用其它基因 ( 如猪瘟病毒 E2 基因或猪流感病毒 HA 基因 ) 替换 EGFP 基因后， 尽管采用不同 改进措施， 比如转化过程中使用能容纳大片段且生长较慢的 DH10B 菌株， 并且使用低温、 低 转速、 低浓度抗生素筛选， 却始终无法得到插入外源基因的嵌合载体克隆， 无法获得嵌合病 毒， 这可能是由于黄病毒 cDNA 在大肠杆菌中的不稳定性造成的。为了解决这个问题， 本发 明尝试了往 JEV 复制子序列中引入内含子的方法， 避免 JEV 蛋白翻译所产生对宿主菌有。
17、毒 害作用的蛋白， 也尝试了引入突变来消除 JEV 序列中隐含的大肠杆菌启动子等方法， 最终 发现引入内含子序列能使 JEV 复制子载体变得稳定， 用猪瘟病毒 E2 基因替换 EGFP 基因后， 很容易挑到阳性克隆， 转染细胞后 E2 蛋白也能正确稳定表达 ( 表 1)。 0018 表 1 引入来自 pCI 载体的嵌合内含子对 JEV 复制子的影响 0019 0020 说 明 书 CN 102600481 A 4 3/7 页 5 0021 本发明首先获得了携带 JEV 复制子、 稳定表达 EGFP 基因的重组嵌合腺病毒， 重组 病毒对 HEK293 细胞的感染性高， 致细胞病变快， 荧光显微镜。
18、下观察 EGFP 表达量也非常高。 其中， 本发明的携带 JEV 复制子、 稳定表达 EGFP 基因的重组嵌合腺病毒的具体构建方法可 参考以下技术方案 ： 0022 首先将构建的含有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的 JEV 复制子插入到经过改 造后带有SwaI位点的pShuttle-CMV载体中， 再将来自pCI载体的嵌合内含子插入JEV复制 子中， 得到转移载体pSh-JEV-In-EGFP， 经SwaI线性化后转化BJ5183感受态细胞， 将所得重 组腺粒经 PacI 线性化后转染 HEK293 细胞， 传代直至出现细胞病变， 得到含有表达 EGFP 的 JEV复制子的重组嵌合腺病。
19、毒rAdV-JEV-EGFP。 PCR及酶切鉴定结果表明， pSh-JEV-In-EGFP 在细菌中传 20 代仍然保持稳定， EGFP 蛋白在 rAdV-JEV-EGFP 感染的 HEK293 细胞中稳定、 高效地表达。 0023 本发明首次对腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体表达系统进行了初步探索， 证实了由腺病毒递送 JEV 复制子表达系统的可行性， 将稳定表达外源基因的 JEV 复制子有 效地递送到宿主体内， 为进一步研发以腺病毒递送 JEV 复制子为基础的新型疫苗打下基 础。在此基础上， 本发明进一步用猪瘟病毒 E2 基因替换嵌合载体中的 EGFP 基因， 利用腺 病毒递送的日本。
20、脑炎病毒复制子为载体， 构建了表达猪瘟病毒 E2 基因的重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-E2。 0024 本发明将所构建的重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-E2 提交到专利认可的保藏机构进 行保藏， 其微生物保藏号是 ： CGMCC No.5825 ； 分类命名是 ： 递送表达猪瘟病毒 E2 蛋白的日 本脑炎病毒复制子的重组腺病毒 ； 保藏时间是 ： 2012年2月29日 ； 保藏单位是 ： 中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中 国科学院微生物研究所。 0025 本发明采用间接免疫荧光试验确证猪瘟病毒 E2 蛋白在重组。
21、病毒 rAdV-JEV-E2 感 染后的 HEK293 细胞中得到稳定、 高效的表达 ； 家兔免疫攻毒试验结果显示， rAdV-JEV-E2 免 疫后 2 周即可检测到猪瘟特异性抗体的产生， 在免疫后 5 周达到峰值 ( 部分家兔抗体阻断 率达到 80以上 )， 攻毒后与接种 C 株的家兔一样均未出现定型热， 而接种 rAdV-JEV-EGFP 的对照家兔在攻毒后全部出现定型热， 这说明 rAdV-JEV-E2 具有较好的免疫原性。利用猪 瘟兔化弱毒株对免疫家兔进行攻毒是经典的猪瘟疫苗评价策略， 因此本发明重组嵌合腺病 说 明 书 CN 102600481 A 5 4/7 页 6 毒 rAdV。
22、-JEV-E2 具有良好的免疫保护作用， 可作为猪瘟疫苗应用， 这也进一步表明本发明 所构建的腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体疫苗是一个很有应用潜力的新型疫苗载 体。 附图说明 0026 图 1 引入内含子序列结构示意图 ； PCMV： CMV 启动子 ； 5 NCR 和 3 NCR ： JEV 的 5 和3非编码区 ； C23 ： JEV C蛋白前23个氨基酸 ； Intron ： 来自pCI载体嵌合内含子 ； EGFP ： 绿色荧光蛋白 ； E2 ： 猪瘟病毒 E2 蛋白 ； E25 ： JEVE 蛋白前 25 位氨基酸 ； NS1-5 ： JEV 非结构蛋 白 ； HDVRz ： 。
23、丁型肝炎病毒核酶 ； polyA ： SV40 polyA 信号。 0027 图2pSh-JEV-In-EGFP细菌中传至20代酶切鉴定 ； 1 ： DL15,000DNA分子量标准 ； 2 ： BglII ； 3 ： EcoRI ； 4 ： BglII+EcoRI ； 5 ： DL2,000DNA 分子量标准。 0028 图 3EGFP 在重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-EGFP 感染 HEK293 细胞中的表达 ； A ： rAdV-JEV-EGFP 感染的 HEK293 细胞 ； B ： 正常 HEK293 细胞。 0029 图 4 用间接免疫荧光试验检测重组嵌合腺病毒 rAdV-JE。
24、V-E2 感染 HEK293 细胞中 E2 蛋白表达 ； A ： rAdV-E2 感染的 HEK293 细胞 ； B ： rAdV-JEV-E2 感染的 HEK293 细胞 ； C ： 正常 HEK293 细胞。 0030 图 5 家兔免疫后产生的猪瘟特异性抗体水平。 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 003。
25、2 实施例 1 重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-EGFP 和 rAdV-JEV-E2 的构建和鉴定 0033 1 材料方法 0034 1.1 细胞、 菌株、 质粒载体 0035 HEK293细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存。 腺病毒穿梭 载体pShuttle-CMV及含腺病毒骨架载体的AdEasy-1感受态菌购自Stratagene公司。 携带 绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的 JEV 复制子 pOK-JEV-EGFP 按照文献报道的方法进行构建 ( 陈 孝明.JEV复制子载体系统的建立及其在PRRS疫苗的应用.广州 ： 华南农业大学兽医学院， 2010)。 0036 。
26、1.2 转移载体 pShuttle-CMV 的改造 0037 根据 pShuttle-CMV 序列设计合成一对 5端有 9 个碱基相同的引物 P1、 P2， 并引 入酶切位点 KpnI、 EcoRI、 NotI。引物序列如下 ( 下划线为引入酶切位点 ) ： 0038 P1 ： 5 -TCAGAATTCGGTACCCGGATCTGGGCGTGGTTAAG-3 (SEQ ID No.2) 0039 P2 ： 5 -TCAGAATTCGCGGCCGCACAGTATTACGCGCTATGAGTAACA-3 (SEQID No.3) 0040 以 pShuttle-CMV 为模板， 以HS DNA 聚。
27、合酶进行 PCR 扩增， 获得 6500bp 大小的环状质粒 ( 删去 CMV-MCS-SV40polyA)， 经 DNA 试剂盒纯化后， 加入 DpnI 限制 性内切酶消化掉质粒模板， 再经 DNA 纯化试剂盒纯化， 转化 DH5， 提取质粒酶切鉴定， 重组 说 明 书 CN 102600481 A 6 5/7 页 7 质粒命名为 pShuttle。 0041 根据 pShuttle PmeI 附近的已知序列， 设计合成一对引物 P3/P4， 上下游引物引入 相同的酶切位点 SwaI， 以将 PmeI 突变为 SwaI。引物序列如下 ( 下划线为酶切位点 )。 0042 P3 ： 5 -AA。
28、TTTAAATGAATTCAATAGCTTGT-3 (SFQ ID No.4) 0043 P4 ： 5 -TTCATTTAAATTCCCTCTCAAGTCT-3 (SEQ ID No.5) 0044 以质粒pShuttle为模板， 用HS DNA聚合酶进行PCR扩增， 扩增片段 为不带 PmeI 位点的质粒全长序列， 纯化 PCR 产物， 用 SwaI 限制性内切酶消化完全后自连， 挑选能被 SwaI 酶切且不能被 PmeI 酶切的克隆， 命名为 pShuttle-SwaI。 0045 1.3pSh-JEV-EGFP 穿梭载体的构建 0046 将质粒 pOK-JEV-EGFP 用 NotI/K。
29、pnI 双酶切， 胶回收 CMV 到 SV40polyA 片段， 插入 到 pShuttle-SwaI 的 NotI 和 KpnI 之间， 得到 pSh-JEV-EGFP。 0047 1.4 引入内含子序列 0048 为增加 JEV 复制子的稳定性， 在复制子载体 SpeI 位点前通过同源重组引入质粒 pCI(Promega公司)内含子序列(图1)， 以阻止复制子隐含细菌启动子控制的蛋白表达。 引 物序列如下 ( 下划线为同源臂序列 ) ： 0049 PJEV-IN-EGFP-S ： 0050 5 -GGGCTATCAATATGCTGAAACGCGGCCTACCCCGCGTAAGTATCAAG。
30、GTTACAAG-3 (SEQ ID No.6) 0051 PJEV-IN-EGFP-R ： 0052 5 -AACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACTAGTCTGTGGAGAGAAAGGCAAAG-3 (SEQ ID No.7) 0053 以 pCI 为模板扩增携带 JEV 载体同源序列的内含子序列， 将 PCR 产物与经 SpeI 线 性化的质粒 pSh-JEV-EGFP 共转化 DH5 感受态菌， 利用细菌内的重组酶进行同源重组， 提 取质粒经 PCR 鉴定， 阳性质粒命名为 pSh-JEV-In-EGFP。将 pSh-JEV-In-EGFP 在细菌中传 代 20 次， 。
31、经 BglII、 EcoRI 单酶切及 BglII 与 EcoRI 双酶切鉴定， 能切出与预期大小相符的 条带 ( 图 2)。 0054 1.5 穿梭载体 pSh-JEV-In-E2 的构建 0055 根据 pSC-E2 序列 (Yuan Sun， Qiaofen Qi， Bingbing Liang， et al. 表达猪瘟病 毒 E2 蛋白的重组嵌合腺病毒的构建及其在兔体内的免疫原性分析 . 生物工程学报， 2008， 24(10) ： 1734-1739.)， 通过 PCR 的方法扩增猪瘟病毒的 E2 基因。E2 的引物设计 ( 下划线 为引入酶切位点 ) ： 0056 PE2S ： 0。
32、057 5 -TAGGTACCTCTAGAGCCACCATGGTATTAAGAGGACAG-3 (SEQ ID No.8) 0058 PE2R ： 5 -CGAAGCTTGTCGACTTAACCAGCGGCGAGCTGTTC-3 (SEQ ID No.9) 0059 引物分别引入 XbaI 和 SalI 酶切位点。用 XbaI/SalI 双酶切， 胶回收 E2 片段， 插 入到 pSh-JEV-In-EGFP 的 SpeI/SalI 之间， 得到 pSh-JEV-In-E2。 0060 1.6 重组腺粒 pAdV-JEV-In-EGFP 及 pAdV-JEV-In-E2 的构建 0061 将质。
33、粒 pSh-JEV-In-EGFP 及 pSh-JEV-In-E2 分别用 SwaI 线性化， DNA 纯化试剂 盒纯化后电转化至含腺病毒骨架载体 AdEasy-1 的 BJ5183 感受态细菌中进行同源重组。 说 明 书 CN 102600481 A 7 6/7 页 8 经卡那霉素抗性筛选， 提取质粒用 PacI 酶切鉴定， 得到重组腺粒 pAdV-JEV-In-EGFP 及 pAdV-JEV-In-E2。 0062 1.7 转染 0063 提取pAdV-JEV-In-EGFP及pAdV-JEV-In-E2， 分别用PacI线性化后， 再用DNA纯化 试剂盒进行纯化， 用Lipofectam。
34、ine 2000转染试剂按说明书以6g DNA/孔的浓度分别转 染至六孔板中的 HEK293 单层细胞， 其中一孔不做任何处理作为阴性对照。 0064 1.8 重组嵌合腺病毒的纯化与鉴定 0065 转染后每两天换一次维持液， 直到第 8 天， 收集培养物反复冻融 3 次， 5000r/ min 离心 5min， 收集上清液于 -20保存。并于六孔板中培养 HEK293 细胞， 当细胞达到 80 -90时， 弃去培养液， 接种 1ml 冻存的培养物上清， 吸附 2h 后， 加入维持液至 2ml 进 行培养， 并于 3d 后如上方法传代一次， 每天观察荧光表达与致细胞病变 (CPE) 情况， 当转。
35、 染pAdV-JEV-In-EGFP组有大量荧光表达且细胞大量病变与转染pAdV-JEV-In-E2组出现大 量病变时， 取 2l 病毒液到新鲜单层细胞中， 观察荧光表达情况， 48h 后分别收集细胞提取 细胞总 DNA， 以腺粒 pAdV-JEV-In-EGFP 及 pAdV-JEV-In-E2 为 PCR 阳性对照， 另外提取正常 HEK293 细胞 DNA 作为阴性对照。用相同的引物扩增， 1琼脂糖电泳进行分析， 鉴定正确的 重组病毒分别命名为 rAdV-JEV-EGFP 和 rAdV-JEV-E2。 0066 同时用猪瘟病毒 E2 蛋白单克隆抗体 5B1 对重组嵌合腺病毒 rAdV-J。
36、EV-E2 感染 HEK293 细胞进行间接免疫荧光试验。方法如下 ： 将 HEK293 细胞铺于 6 孔板中， 当长到 80 单层时， 接种 2l rAdV-JEV-E2， 48h 后将 rAdV-JEV-E2 感染的 HEK293 细胞用 4多聚甲 醛室温固定 20min， 1 BSA 室温封闭 30min， 加入抗 CSFV 的单克隆抗体 5B1， 37作用 2h， 用 PBS 洗涤后， 加入荧光标记羊抗鼠 IgG 37作用 30min， 用 PBS 洗涤后， 吹干， 加入缓冲甘 油， 于荧光显微镜下观察。 0067 用重组腺粒 pAdV-JEV-EGFP 转染 HEK293 细胞后， 。
37、有瞬时荧光表达， 8d 后未见 CPE 形成， 盲传至4-5代， 细胞出现病变(细胞变圆、 发亮、 向周边扩散)， 荧光显微镜下能观察到 EGFP 蛋白在 rAdV-JEV-EGFP 感染的 HEK293 细胞中大量表达 ( 图 3)。 0068 重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-E2 传至第 5 代时开始出现病变， 并于 48h 病变完全， 间 接免疫荧光试验可检测到猪瘟病毒 E2 蛋白在感染的 HEK293 细胞中的表达 ( 图 4)。 0069 试验例 1 动物免疫和攻毒试验 0070 选取 14 周龄健康长耳大白兔 13 只 ( 购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实 验动物中心 )， 。
38、随机分成 A、 B、 C 三组， A 组 4 只， B 组 5 只， C 组 4 只。A、 B 组分别经后腿肌 肉注射接种 1mL 105TCID50的重组嵌合腺病毒 rAdV-JEV-EGFP、 rAdV-JEV-E2， C 组通过耳静 脉注射 100RID50猪瘟兔化弱毒疫苗 C 株 (C 株购自哈尔滨维科生物技术有限公司 )。免疫 后 7w， 用 100RID50通过耳静脉接种途径对所有试验兔进行攻击， 攻毒后每隔 6h 测直肠温 度， 连续测定 3d， 确定家兔是否存在定型热反应， 体温比基础温度高 1以上并维持 18h 判 为有定型热反应。攻毒后 3d， 剖杀所有试验兔， 采集脾脏，。
39、 应用已报道的荧光定量 RT-PCR 方法 (Zhao JJ， Cheng D， Li Na， et al.Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus.Vet Microbiol， 2008， 126(1/3) ： 1-10) 检测 其中兔化弱毒疫苗病毒 RNA 含量。 说 明 书 CN 102600481 A 8 7/7。
40、 页 9 0071 免疫后 7w， 用 C 株对所有试验兔进行攻击后， rAdV-JEV-E2 和 C 株免疫组所有家兔 均未出现热反应， 而rAdV-JEV-EGFP对照组中4只家兔全部出现了定型热反应(表2)， 荧光 定量RT-PCR检测表明， rAdV-JEV-E2免疫兔脾脏中无病毒RNA， 而对照兔脾脏中均存在大量 病毒 RNA， 最高达到了 104拷贝 /L( 表 3)， 表明 rAdV-JEV-E2 可诱导完全免疫保护。 0072 表 2 用 C 株攻毒后各免疫组家兔产生定型热反应的检测结果 0073 0074 表 3 免疫家兔攻毒后脾脏中病毒 RNA 定量检测 0075 0076。
41、 注 ： - 检测不到。 0077 免疫前及免疫后每周和攻毒后第 3 天对所有免疫家兔通过耳静脉采血， 收集血清 后应用基于 CSFV E2 蛋白中和性单克隆抗体的阻断 ELISA 试剂盒 ( 购自 IDEXX 公司 ) 检测 猪瘟抗体， 具体操作方法按说明书进行。 0078 rAdV-JEV-E2 免疫组于免疫后第 2 周开始产生猪瘟特异性抗体 ( 阻断率达到 40 以上判定为抗体阳性 )， 随后抗体水平逐渐升高 ； C 株免疫组在第 1 周开始产生较高滴度的 猪瘟抗体， rAdV-JEV-E2 在免疫后 4 周抗体全部转阳， 而 rAdV-JEV-EGFP 免疫对照组始终没 有产生猪瘟特异。
42、性抗体 ( 图 5)。 说 明 书 CN 102600481 A 9 1/3 页 10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 腺病毒 / 日本脑炎病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用 DQXL-0028 9 PatentIn version 3.5 1 133 DNA artifical sequence 1 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcc。
43、a cag 133 2 35 DNA artifical sequence 2 tcagaattcg gtacccggat ctgggcgtgg ttaag 35 3 42 DNA artifical sequence 3 序 列 表 CN 102600481 A 10 2/3 页 11 tcagaattcg cggccgcaca gtattacgcg ctatgagtaa ca 42 4 25 DNA artifical sequence 4 aatttaaatg aattcaatag cttgt 25 5 25 DNA artifical sequence 5 ttcatttaaa ttc。
44、cctctca agtct 25 6 55 DNA artifical sequence 6 gggctatcaa tatgctgaaa cgcggcctac cccgcgtaag tatcaaggtt acaag 55 7 52 DNA Abies alba 7 aacagctcct cgcccttgct caccatacta gtctgtggag agaaaggcaa ag 52 序 列 表 CN 102600481 A 11 3/3 页 12 8 38 DNA artifical sequence 8 taggtacctc tagagccacc atggtattaa gaggacag 38 9 35 DNA artifical sequence 9 cgaagcttgt cgacttaacc agcggcgagc tgttc 35 序 列 表 CN 102600481 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102600481 A 13 2/2 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 102600481 A 14 。