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1、(10)申请公布号 CN 102405065 A (43)申请公布日 2012.04.04 CN 102405065 A *CN102405065A* (21)申请号 201080017388.6 (22)申请日 2010.04.30 0907553.2 2009.05.01 GB A61L 26/00(2006.01) (71)申请人 香榭有限公司 地址 英国贝德福德郡 (72)发明人 P. 戴维斯 A. 奥斯丁 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 张萍 李炳爱 (54) 发明名称 人或动物体表感染的治疗 (57) 摘要 一种人或动物体表感染特别是真菌感。
2、染的治 疗方法， 包括将一种水性液体应用到感染的体表 （例如， 指甲区域） 上， 然后应用一种包括过氧化氢 源的敷料。在此还提供了在该方法中使用的该液 体与该敷料的一种组合。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.10.20 (86)PCT申请的申请数据 PCT/GB2010/050721 2010.04.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/125398 EN 2010.11.04 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 102405069 A1/1 页 。
3、2 1. 一种水性液体与一种敷料的组合， 该敷料包括用于在人或动物体表感染的治疗中使 用的一种过氧化氢源。 2. 一种人或动物体表感染的治疗方法， 该方法包括将一种水性液体应用到该感染的体 表， 然后应用包括一种过氧化氢源的一种敷料。 3. 一种水性液体与包括过氧化氢源的一种敷料的组合在制造用于人或动物体表感染 的治疗的药物中的用途。 4. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该身体表感染是一种真菌感染。 5. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该体表是指甲区域， 具体而言是人的 指甲区域。 6. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该水性液体包括一种过氧化物酶。 7. 根。
4、据权利要求 6 所述的发明， 其中过氧化物酶包括乳过氧化物酶、 辣根过氧化物酶 或它们的一种混合物。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的发明， 其中在该水性液体中过氧化物酶的浓度是在从 1 g/ml 至 1000 g/ml 的范围内。 9. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该水性液体包括表面活性剂和 / 或溶 剂。 10. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该敷料在使用中向指甲区域提供水。 11. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该敷料包括一种水合水凝胶材料。 12. 根据以上权利要求的任一项所述的发明， 其中该过氧化氢源是一种过氧化氢产生 手段， 包括氧化还原。
5、酶、 一种氧源以及一种用于酶的底物源。 13. 根据权利要求 12 所述的发明， 其中氧化还原酶包括葡萄糖氧化酶。 14. 根据权利要求 12 或 13 所述的发明， 其中该敷料包括不连续的第一层和第二层， 该 第一层包括氧化还原酶并且被定位于该敷料的外部分的附近， 该第二层包括该底物源并且 被定位于该敷料的内部分的附近。 权 利 要 求 书 CN 102405065 A CN 102405069 A1/7 页 3 人或动物体表感染的治疗 技术领域 0001 本发明涉及人或动物体表感染特别是人指甲区域的真菌感染的治疗。 背景技术 0002 处于明显良好的状况下的健康指甲是很重要的并且是人的外观。
6、的高度珍视的方 面。指甲的外观、 强度以及健康经常可能会不利地受到病原真菌细胞 （典型地是发癣菌） 感 染的影响， 并且对于通过消除感染的真菌而改善受累的指甲的外观的疗法存在一个强烈需 求。 尽管在市场上存在许多补救办法， 但是对可获得的技术和产品仍然存在普遍的不满意。 0003 全身性递送的药剂可以通过血流到达指甲区域， 但是从循环进入指甲区域的差的 渗透以及严重的负作用限制了该方法的有用性。 0004 在侵入真菌的作用下， 常常致使真菌感染的指甲是多孔的或开放的。 因此， 通常指 甲是被细菌共定植的， 通过释放额外的破坏性酶类和局部活性毒素这些细菌能够使真菌的 损伤效应加剧。 0005 普。
7、遍公认的是， 即使真菌性指甲感染通过一种已知疗法被减轻了， 但是它很少完 全被消除并且通常在治疗停止之后不久感染会复发。 发明内容 0006 诸位发明人已经发现， 活性成分不容易渗透指甲， 并且很少 （如果有一些的话） 的 应用到顶部表面的材料到达下面的结构， 在这些结构中这些真菌细胞能够相对安全地驻 留。 0007 在一个第一方面， 本发明涉及一种治疗人或动物体表感染 （例如， 真菌感染） 的方 法， 包括将一种水性液体应用到感染的体表 （例如， 指甲区域） ， 然后应用一种包括过氧化氢 源的敷料。 0008 在一个第二方面， 本发明涉及在人或动物体表感染 （例如， 具体地但不唯一地是人 或。
8、动物的指甲区域的真菌感染） 的治疗中的一种水性液体与包括过氧化氢源的一种敷料的 组合。 0009 在一个第三方面， 本发明涉及一种水性液体与包括过氧化氢源的一种敷料的组合 在制造用于人或动物体表感染 （例如， 具体地但不唯一地是人或动物的指甲区域的真菌感 染） 的治疗的药物中的用途。 0010 通过将一种水性液体应用到感染的体表， 体表变得柔软并且变得更加多孔。 例如， 这可以允许该液体经由现有的多孔性进入指甲区域的内部。 因此该液体提供了一种到体表 （例如指甲区域） 的内部的水性流动路径。 0011 因此包括一种过氧化氢源的敷料的后续应用导致了过氧化氢沿着产生的水性流 动路径的有效扩散， 进。
9、入体表 （例如， 指甲区域） 的内部的更不易接近的部分， 使得过氧化氢 能够深入地渗透， 这允许显著减轻或消除感染 （例如像在指甲区域的所有构件中的真菌感 染） 。 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A2/7 页 4 0012 当考虑针对甲板以及下面的甲床以及所有相关结构的新的治疗方法时， 必须了解 指甲具有一种特殊解剖以及构成。指甲的最突出部分 （甲板） 由一种坚硬的角质化结构组 成， 由死角质化细胞 （角质细胞） 构成， 从指甲基部的基质向上推移 （push up） 。甲板的大部 分是半透明的， 允许皮肤中的血液供给的颜色彻底显现， 给出一种粉红的颜色。 。
10、指甲本身是 相对缺乏水分的但是， 当将其暴露于水时， 它可以变得相对含水的， 假设一种软化的以及柔 韧的状态。 0013 甲廓， 与指甲的侧面重叠的皮肤褶， 将甲板保持在恰当的位置并且保护其边缘。 指 甲的唯一活的、 再生的部分是直接位于角质层下面的甲母质。在这个点处新的细胞形成并 且随着它们的成熟而不断向前推进以产生甲板。 甲母质也被提供有神经以及丰富的血管以 便为细胞提供营养和氧气。 0014 甲板支撑在甲床上， 甲床与甲母质是连续的。 它也被丰富地供应了血管以及神经。 其表面形成许多平行的脊， 与在甲板的下表面上的脊精确地吻合。角质层是与指甲重叠的 皮肤表皮的一部分。它保护了甲母质免受细。
11、菌侵入和物理损伤。 0015 真菌细胞可以驻留并且生长在这些结构的任何部分中， 并且渗透所有的区域对于 任何治疗是重要的， 以便消除任何残余感染病灶以及消除在甲板的主区域中的感染。 0016 在此定义了术语 “甲区域” ， 包括甲板、 甲床、 甲母质、 甲廓以及角质层。 0017 本发明还涉及一种治疗人类乳头瘤病毒感染的细胞的方法， 该方法包括将如在此 定义的一种水性液体应用于这些感染的细胞， 然后应用一种包括如在此定义的一种过氧化 氢源的敷料。 0018 本发明还涉及在治疗人类乳头瘤病毒感染的细胞中的如在此定义的一种水性液 体与如在此定义的包括一种过氧化氢源的一种敷料的组合。 0019 在一。
12、个优选的实施方案中， 该水性液体包括一种过氧化物酶。过氧化物酶扩散进 入体表 （例如， 指甲区域） 的内部。 0020 过氧化物酶， 当它已经渗透体表 （例如指甲） 的内部区域时， 实质上保持是无活性 的， 直到过氧化氢经由来自敷料的水性途径扩散时为止。 在过氧化物酶的存在下， 过氧化氢 的氧化作用被增强。 0021 因此已经发现过氧化物酶实质性地增强了过氧化氢的活性， 特别是抗真菌活性， 因为它催化了在真菌细胞的细胞膜和 / 或细胞质之上或之内的这些脆弱而重要的真菌分 子的氧化。 0022 可以采用一些适合的过氧化物酶， 包括乳过氧化物酶、 辣根过氧化物酶、 碘化过氧 化物酶、 氯化物过氧化。
13、物酶以及髓过氧化物酶。然而乳过氧化物酶以及辣根过氧化物酶目 前是优选的。 0023 在水性液体中过氧化物酶的浓度优选地是在从1 g/ml至1000 g/ml的范围内， 优选地是从 50 g/ml 至 1000 g/ml， 更优选地是从 100 g/ml 至 500 g/ml。 0024 该水性液体还优选地包括表面活性剂和 / 或溶剂， 已经发现它们增强了液体进入 体表 （例如， 指甲） 的渗透。 0025 该敷料优选地处于一种水合条件下， 以便在应用该敷料时过氧化氢可以有效地 扩散进入指甲区域。敷料中的足够的水是必需的， 以便在指甲区域与该敷料之间形成一个 接触液界。 说 明 书 CN 102。
14、405065 A CN 102405069 A3/7 页 5 0026 优选地， 该水性液体的渗透强度与该敷料中的液体的渗透强度是相同的或相似 的， 以增加所希望的流体以及溶质流量。 0027 在使用中该敷料优选地将水提供到指甲区域， 这通过以已知的方式选择适当的渗 透特性而实现。 0028 该敷料的材料可以是处于水凝胶、 海绵、 泡沫的形式或一些其他的亲水基质的形 式， 这些形式可以保持足够的水以允许在该敷料与指甲区域之间的受控的扩散路径。优选 地， 该敷料将包含用于通过例如氢键结合而调节过氧化氢的通路的溶质， 该氢键结合可以 通过适当的聚合物 （例如， 多糖， 包括糖胺聚糖） 浓度而实现。。
15、 0029 该敷料可以包括一种湿润的棉敷料或可以包括一种带有湿润成分的结构芯材料。 然而， 优选地该敷料包含一种或多种水基凝胶或水性凝胶， 也被称为水合水凝胶。 这种凝胶 可以由多种材料形成并且可以包含如将在下面讨论的多种试剂。 0030 典型地， 该敷料将处于一种薄片、 层或薄膜的形式。可替代地， 该敷料可可以是处 于一种无定形凝胶或洗液的形式， 优选地是能够三维变形或成形 （包括通过一个喷嘴进行 挤压的） 的不具有固定形式或形状的一种水凝胶。无定形凝胶典型地不是交联的或具有低 水平的交联。可以使用一种剪切稀化的无定形凝胶。当其经受剪切应力 （例如， 当通过一个 喷嘴被注出或挤出时） 时这样。
16、的凝胶是一种液体但是在静态时该凝胶是固定的。 0031 在 WO 03/090800 中披露了适合的水合水凝胶。该水合水凝胶合宜地包括亲水聚 合物材料。适合的亲水聚合物材料包括聚丙烯酸酯以及甲基丙烯酸酯， 例如， 如由 First Water Ltd 提供的处于薄片水凝胶的形式， 包括聚 2- 丙烯酰氨基 -2- 甲基丙磺酸 （聚 AMPS） 或它的盐类 （例如， 在 WO 01/96422 中所描述的） 、 多糖例如多糖胶特别地黄原胶 （例如， 在 商标 Keltrol 下可获得的） 、 各种糖类、 多聚羧酸 （例如， 在来自 ISP 欧洲的商标 Gantrez AN-169 BF下可获得的。
17、） 、 聚(甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物) （例如在商标Gantrez AN 139 下可获得的， 具有一个在 20,000 至 40,000 范围的分子量） 、 聚乙烯吡咯烷酮 （例如处于可商 购的被称为PVP K-30和PVP K-90的等级形式） 、 聚环氧乙烷 （例如， 在商标Polyox WSR-301 下可获得的） 、 聚乙烯醇 （例如， 在商标 Elvanol 下可获得的） 、 交联聚丙烯酸聚合物 （例如， 在 商标 Carbopol EZ-1 下获得的） 、 纤维素以及改性纤维素包括羟丙基纤维素 （例如， 在商标 Klucel EEF 下可获得的） 、 羧甲基纤维素钠 （例如， 。
18、在商标 Cellulose Gum 7LF 下可获得的） 以及羟乙基纤维素 （例如， 在商标 Natrosol 250 LR 下可获得的） 。 0032 可以将亲水聚合物材料混合物使用在一种凝胶中。 0033 在亲水聚合物材料的一种水合水凝胶中， 该亲水聚合物材料令人希望地以基于该 凝胶的总重量的按重量计至少0.1%、 优选至少0.5%、 优选至少1%、 优选至少2%、 更优选至少 5%、 还更优选至少 10%、 或至少 20%、 令人希望地至少 25% 并且甚至更令人希望地至少 30% 的 浓度而存在。基于该凝胶的总重量的甚至更高的量， 按重量计高达大约 40%。 0034 一种优选的水合水。
19、凝胶包括聚 2- 丙烯酰氨基 -2- 甲基丙磺酸 （聚 AMPS） 或它的盐 类， 优选地以该凝胶的总重量的按重量计大约 20% 的量。 0035 该过氧化氢源可以包括过氧化氢本身或过氧化氢与另一个实体的组合或复合。 可 替代地， 该过氧化氢源可以是一种过氧化氢产生手段。 0036 在一个优选的实施方案中， 该过氧化氢源是一种过氧化氢产生手段， 该手段包括 氧化还原酶、 一种氧源以及一种用于酶的底物源。氧化还原酶催化了一种适当的底物与氧 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A4/7 页 6 的反应以产生过氧化氢。 0037 适合用于本发明中的氧化还原酶以及对应的。
20、底物 （这些底物存在于血液和组织液 中） 包括以下各项 ： 酶底物 葡萄糖氧化酶-D 葡萄糖 己糖氧化酶己糖 胆固醇氧化酶胆固醇 半乳糖氧化酶D- 半乳糖 吡喃糖氧化酶吡喃糖 胆碱氧化酶胆碱 丙酮酸氧化酶丙酮酸 羟基乙酸氧化酶羟基乙酸 氨基酸氧化酶氨基酸 目前该优选的氧化还原酶是葡萄糖氧化酶。其催化了 -D 葡萄糖底物的反应以给出 过氧化氢以及葡萄糖酸。 0038 可以使用一种氧化还原酶的混合物。 0039 氧化还原酶和葡萄糖可以任选地与一种氧源精细地共混在一起。 可以通过任何方 便的氧供体提供氧， 但是一种方便的来源是大气氧。 0040 当氧源是大气氧时， 该敷料优选地包括不连续的第一层和第。
21、二层。该第一层包括 氧化还原酶并且定位于该敷料的外部分的附近， 即， 在使用中远离指甲区域， 在此处大气氧 水平是最高的。 该第二层包括该底物源并且定位于该敷料的内部分的附近， 即， 邻近指甲区 域， 这样使得产生的水凝胶过氧化物可以直接进入指甲区域。 0041 该分层的实施方案的一种优选的形式是其中该第一层和该第二层两者都包含交 联的水合水凝胶。可以将水凝胶设计 （cast） 在一个机械增强结构 （例如一个棉纱布片或一 个惰性柔性网） 的周围， 例如， 以此提供一种结构增强的水凝胶层或厚片。 0042 可替代地， 该第一含酶层可以处于干燥的条件下但是在使用过程中被置于与该第 二层的流体连通中。
22、， 这导致水迁移到该第一层以使该酶水化。 0043 在该分层的实施方案中优选的是， 该第一层是较薄的， 即从 0.01 mm 至 2.0 mm， 而 该第二层是较厚的， 即从 0.5 mm 至 5.0 mm。如果该第一层是一种水合水凝胶， 则它优选地 是从 0.1 mm 至 2.0 mm 厚。如果该第一层是一种干膜， 则它优选地是从 0.01 mm 至 0.1 mm 厚。 0044 第一层的厚度与该第二层的厚度的比率优选地是从1 : 2至1 : 200， 优选地从1 : 5 至 1 : 50， 更优选地从 1 : 5 至 1 : 20。 0045 氧化还原酶可以被合宜地固定， 这样可防止它朝着。
23、该第二层迁移。 0046 该底物 （例如葡萄糖） 可以按不同的形式存在， 包括溶解在一种水合水凝胶结构之 内， 作为一种缓慢溶解的固体而存在， 或被包封在用于缓释的另一个结构之内。 0047 优选的是安排该敷料以具有过量的底物， 这样该敷料能够在使用中发挥作用以生 成过氧化氢经过一个延长的时期， 例如， 至少一个小时， 例如从 1 至 10 个小时或更长。 0048 根据本发明的该组合典型地是一种包装的套件， 该套件包括一种水溶液与一种敷 料的组合， 该敷料包括如以上所述的一种过氧化氢源。 0049 这些组件典型地是密封的、 不渗透水的封装。 0050 现在通过举例并且参照以下图形来说明本发明。
24、， 其中 ： 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A5/7 页 7 图 1 是显示了测量的电流对时间的一个图表， 显示了过氧化氢的产生。 0051 图 2a 是显示了真菌红色毛癣菌的杀菌曲线的一个图表。 0052 图 2b 是显示了真菌红色毛癣菌的杀菌曲线的另一个图表。 0053 实例 实验概述 将测试盘在含有 107个真菌细胞的 50% 的血清中浸泡以再产生一种高蛋白质环境。将 它们置于在一个凝胶床上， 该凝胶床也含有 50% 的血清以模拟与甲床的接触。对这些盘给 予一定剂量的辣根过氧化物酶或乳过氧化物酶的二者之一的水溶液， 每套盘具有这些酶类 的不同剂量水平。
25、。对照盘没有留下任何种类的过氧化物。一些盘未被覆盖而留置作为额外 的实验对照， 以确定当未经处理时这些真菌细胞存活得如何好。 在设定的时间间隔中， 将有 代表性的盘移开用于采样， 并且通过标准方法确定存活的真菌细胞的数量。 这些实验显示， 如果在合适的地方保留几个小时， 由分层的凝胶贴片递送的过氧化氢可以杀死这些真菌细 胞。然而， 通过另外的与真菌接触的过氧化物酶的存在而大大地提高了真菌杀死率。辣根 过氧化物酶比乳过氧化物酶是更加有效的， 并且其效果通常随着剂量的增加而增强。 0054 实例 1 ： 根据过氧化氢的产生对过氧化氢提供的分层的层贴片 （stratified layer patch。
26、） 进行构造和评价。 0055 使用电化学 （缓慢而长期的技术） 测量了过氧化氢 （H2O2） 的产生。将一种敷料置于 定制的传感器上， 施加越过电极的电位并且测量 H2O2的存在。 0056 该敷料包括两层 ： (i) 水合水凝胶层以及 (ii) 包含葡萄糖氧化酶的干膜活化 层。 0057 层 1 的制备 ： 如下所示制备了一种水凝胶片 ： 制备了具有 20% 的 2- 丙烯酰氨基 -2- 甲基丙磺酸钠 （Lubrizol Corporation， 50% 的含水储备溶液） 、 10% 的葡萄糖 （Fisher Scientific， 分析级） 、 以及 0.1% 的乳酸锌 （Aldrich。
27、） 的水溶液。包含了聚乙二醇 700 二丙烯酸酯 （Aldrich） 作为交联剂以及 2- 羟 基 -2- 甲基苯丙酮 （Aldrich） 作为光引发剂。将 6.5 g 和 13 g 的该溶液分散到 10 x 10 cm 的培养皿 （petri dish） 中并且使其经受 100 mW/cm2 的 UV 光照射持续 20 秒。 0058 层 2 的制备 ： 如下所示制备了一种干膜 ： 制备了 25% w/w 的 PVA（Gohsenol 聚乙烯醇， 通过日本 Gohsei 提供的代码为 EG05P） 溶液的水溶液。此外， 将 40.3 mg 葡萄糖氧化酶 （Biocatalysts， 150,。
28、000 单位 / 克） + 300 mg 组氨酸 （Sigma） + 150 mg 柠檬酸 （Fisher， 分析级） + 75 mg 碘化钾 （Sigma） 溶解在 2 ml 的分析级水 （Fisher） 中。将 30 g 的 25% PVA 溶液与葡萄糖氧化酶 / 组氨酸 / 柠檬酸 / 碘 化钾溶解混合并且允许沉降以移除任何截留的气泡。 然后将该混合物在50C下进行干燥 以给出一直厚度为 40-45 微米的干膜。 0059 电化学分析 ： 使用了定制的 3 个电极传感器 （工作电极、 对电极以及参比电极） 进行分析。Ezescan 仪器和软件购自英国卢顿市的 Whistonbrook T。
29、echnologies 公司。将这些电极安装在一个 特氟隆盒子内并且置于一个 25 C 的培养箱内。在使用中， 将 20 l 的 0.1 M KCl 溶液施 用在传感器的电极末端。将层 1 水凝胶片切割成 1.5 x 2 cm 的切片 （6.5 g 和 13 g 的设 计重量） 并且置于KCl溶液之上， 确保与这些电极均匀接触并且在凝胶与传感器之间没有截 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A6/7 页 8 留气泡。将这些凝胶覆盖以减少蒸发。将 + 950 mV 的电位施加越过这些电极并且记录产 生的电流。当获得稳定的基线电流时， 将 1.5 x 2 cm 的干。
30、膜切片施用到层 1 水凝胶片的表 面。记录所产生的电流。参见图 1 ： 图 1 用实例说明了当将 + 950 mV 的一个电势应用于该传感器的该层 1 水凝胶片， 存在 非常小的可测量的背景电流， 因此存在非常小的来自这些材料的干扰在此给定的电势下用 于该水凝胶的制备。在施用干酶膜之后 （在该图上在大约 4000 秒处） ， 葡萄糖氧化酶的化学 作用被激活并且产生了 H2O2， H2O2通过该层 1 水凝胶迅速扩散通过该电极， 在此处测量到一 个显著的电流上升。 这清楚地表明该双层体系在该双层体系之内产生了H2O2并且将其递送 到接触表面。关于该图表的主要稳定时期 （在 5,000 秒与 13。
31、,000 秒之间） 所产生的电流通 常等同于大约 0.1% 的 H2O2（水溶液） 。此外， 该层 1 水凝胶的不同厚度产生了非常相似的 曲线， 除了较薄的凝胶 （每 10 x 10 cm 面积 6.5 g 凝胶） 在施用的一小时 （在活化之后大约 3000 秒） 处给出了显著较高的峰电流 （因此 H2O2的浓度） 以外。然后， H2O2测量值逐渐下降直 到这些曲线在活化之后大约40,000秒 （大约11小时） 处返回到平坦响应 （flat response） 。 0060 实例 2 ： 包含引物样品的过氧化物酶制剂 （如水溶液） 。 0061 如下所示制备了一种适合的过氧化物酶的基本载体 ：。
32、 将 50 mM 的 pH 6-6.5 的磷 酸钠缓冲液与 0.2% w/w 的 Tween 20 （Sigma） 表面活性剂混合。将过氧化物酶溶解在其中 以给出一个 100 g/ml 的的终浓度。 0062 可以改变该载体的配方以提供所需要的不同的特性。例如， 可以改变缓冲盐的浓 度和类型以提供一个范围的缓冲极限值并且可以改变该溶液的 pH 值， 取决于所使用的酶 （例如， 过氧化物酶） 的施用和最适 pH ； 可以改变表面活性剂的浓度和类型以提供不同的湿 润特征 ； 可以包含另外的聚合物增稠剂以降低该流体的流动特征 （例如， 以有助于防止在施 用时该溶液流出指甲） ； 还可以改变所使用的酶。
33、的水平， 以允许在该处理的结构上或其之内 的过氧化物酶介导的作用更强或减弱。还可以结合另外的添加剂 （例如， 抗微生物剂） 以改 善该敷料的功效。 0063 实例 3 ： 在一个模型系统中针对红色毛癣菌测试本发明的抗真菌处理系统。 0064 基于在 “In vitro diffusion bed, 3-day repeat challenge capacity test for antimicrobial wound dressings” , J. Greenman, R. M. S. Thorn, S. Saad, A. Austin International Wound Journal 。
34、(2006), 3, 322-329中描述的技术， 使用了一种体 外平台静态扩散模型。 0065 通过在沙保氏液体培养基中的马铃薯葡萄糖琼脂上乳化红色毛癣菌的成熟的表 面生长生物质 （surface growth biomass） 制备测试接种物， 移开悬浮液， 进行涡旋混合， 进而允许大颗粒从溶液中沉降出来。通过分光光度法调整该生成的悬浮液以给出大约 107 cfu ml-1的标准化接种物， 该接种物是足够稠的以使任何杀真菌效应能过被检测出 （观察到 103 cfu 的减少指示一种杀菌效应） 。 0066 在一个聚 AMPS 测试台的表面上， 将 100 l 体积的确定的接种物再悬浮在重复 。
35、的纤维素盘中 （其配制与如在实例 1 中所描述的层 1 水凝胶是相同的， 但是设计为每个 10 x 10 cm 盘 25 g 凝胶片） ， 由此能够施用测试产品 （图 1） 。测试了一种双层敷料。如在实例 1 中描述制备了这些层。在使用之前通过以所需要的浓度溶解在分析水中制备了乳过氧化 物酶或辣根过氧化物酶。 乳过氧化物酶被认为可以增强该新颖的局部处理的一些抗真菌效 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A7/7 页 9 果， 并且用乳过氧化物酶或辣根过氧化物酶溶液针对一些实验系统的纤维素盘进行预处理 来确定不同的效果。所提出的实验测试和对照条件的范围显示于表 1。
36、 中。 0067 通过使这两个层结合在一起而激活这些双层敷料。 放置该水凝胶片使其与纤维素 盘接触， 进而将干膜施用到该水凝胶片的最高表面上。 在28C下孵育测试台， 并设置时间 间隔 （0， 1， 2， 4 & 以及 24 h） ； 将这些纤维素盘移开， 在 PBSa 中再次悬浮， 进行连续稀释， 进 而螺旋地铺板到沙保氏葡萄糖琼脂上。在孵育 （5 天） 之后， 通过集落计数 （cfu disc-1） 确 定在处理暴露之后的不同时间点处皮肤真菌存活者的数量。使用 GraphPad Prism（v.4） 将这些结果进行绘图和分析。 0068 结果 这些实验结果显示于图 2 中， 并且明显的是所。
37、有这些测试条件都引出了显著的抗微生 物效应， 而通过 3 个小时的处理暴露之后， 在这些局部处理下方不能检测到活细胞。在该盘 之内的乳过氧化物酶显得以浓度依赖性方式增强了该局部处理的效果， 尽管相比于该单独 的测试处理 1 g ml-1没有显著的效果 （图 2a） 。在该盘之内的辣根过氧化物酶也以浓度 依赖性方式增强了该局部处理的效果， 其中甚至最低的浓度 （1 g ml-1） 仍具有显著的效 果 （图2b） 。 在这些对照样品之内， 在红色毛癣菌细胞的数目方面存在着轻微的下降， 这表明 这种微生物在这些真菌测试台测定板上不被良好支持 （特别是在孵育 24 小时之后） ； 尽管相 比于对照而言。
38、所有测试处理都显示出显著的效果。有趣的是， 相比于在 24 小时处的未覆盖 的对照， 无活性的处理对照显得对该微生物提供了一定的保护。 0069 结论 从这些结果可见， 单独的局部处理对于红色毛癣菌具有显著的抗微生物效应， 在 3 小 时之内将活细胞数减少到低于此系统的最低检测点 （2 x 102个细胞） ， 这指示了一种杀真 菌效果 （减少 3 个对数倍） 。过氧化物酶和辣根过氧化物酶两者都增强了局部处理的效 果， 尽管明显的是辣根过氧化物酶是更有效的。 0070 表 1. 用于确定不同的新颖处理的抗真菌潜力的实验测试和对照条件。 对照1 未覆盖的盘 对照2 无活性局部处理 测试1 活性局部。
39、处理 测试2 活性局部处理 + 在盘中的 1g/ml 的乳过氧化物酶 测试3 活性局部处理 + 在盘中的 100g/ml 的乳过氧化物酶 测试4 活性局部治疗 + 在盘中的 500g/ml 的乳过氧化物酶 测试5 活性局部处理 + 在盘中的 1g/ml 的辣根过氧化物酶 测试6 活性局部处理 + 在盘中的 100g/ml 的辣根过氧化物酶 测试7 活性局部处理 + 在盘中的 500g/ml 的辣根过氧化物酶 说 明 书 CN 102405065 A CN 102405069 A1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102405065 A CN 102405069 A2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102405065 A 。