表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多表位抗原的重组痘病毒 rMVA-mep 及其应用 【技术领域】
本发明属于基因工程疫苗领域， 涉及表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多表位抗原的重组 痘病毒 rMVA-mep 及其应用。背景技术
日本脑炎病毒 ( 简称乙脑 ) 属于黄病毒科黄病毒属， 是一种以蚊虫为媒介传播的 人畜共患的病毒性疾病。 对人类危害巨大， 是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一， 对猪 可引起繁殖障碍， 给养猪业造成巨大的经济损失。猪是 JEV 的中间宿主， 带毒猪是本病的主 要传染源。因此， 控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。
目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗， 但是有关它们的安全性、 生产和使 用费用等问题越来越突出。 WHO 正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗， 乙脑病毒的 E 蛋白与病 毒和细胞受体结合、 膜融合有关， 也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。
表位 (epitope) 是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团， 又称抗原决定簇 (antigenic determinant)。它是 T 细胞抗原受体 (T cell receptor， TCR) 和 B 细胞抗原 受体 (B cell receptor， BCR) 与抗体特异结合的基本单位。 在免疫应答中， TCR 和 BCR 所识 别的抗原表位不同， 分别被称为 T 细胞表位和 B 细胞表位。作为理想的免疫原， 抗原分子中 应同时包含目的抗原 B 细胞表位和自身或外源 T 细胞表位， 才能诱导出高度特异性的体液 及细胞免疫反应， 从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用， 赋予较广泛的保护性。 目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展， 因此表位疫苗成为近年来病毒新型 疫苗研究的热点。
E 蛋白表位研究 ：
Takada K 等 (2002) 通过 JEV E 蛋白在小鼠体内特异性的 CD8+CTLs 反应， 证明 60 68 CYHASVTDI 是 E 蛋白上主要的 CTL 表位。
Lin 等 (2004) 应用噬菌体展示肽库鉴定了 JEV 囊膜蛋白的模拟表位， 同单抗 2H2 结合的模拟表位拥有一个保守的基序 X(1)(D/E)(Y/T/S)X(2)， 该基序位于 E 蛋白区域 III 的外侧表面。
闫丽萍等 (2007) 用融合蛋白进行免疫学反应性扫描， 鉴定出了 9 个 E 蛋白线 性 抗 原 表 位： E1(1-16)、 E10-4(77-84)、 E11-2(83-94)、 E19(145-164)、 E33(257-272)、 E39-2(309-316)、 E45-3(359-362)、 E48-1(377-384)、 E49(385-400)。
多表位疫苗 (multi-epitope vaccine) 也称鸡尾酒式疫苗， 是同时携带多个与目 标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制备的， 代表了一种疫苗设计的新方向， 对它的研究 是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路， 是基因工程疫苗研究领域里的热点之一。 与传统疫苗相比， 多表位疫苗有很多优势 ： 能被具 有多种遗传背景的 MHC 分子识别、 结合， 从而得到高效的递呈 ； 在细胞免疫方面具有独特的 优势， 可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。抗原表位的选择
为了使机体获得最佳的免疫保护， 需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊 性， 有针对性的选择目的表位。体液免疫和细胞免疫共同构成了机体的免疫应答系统。体 液免疫主要是通过 B 细胞产生的抗体来发挥作用的， 故可以选择特异性 B 细胞表位来定向 诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括 CD4+ 辅助性 T 细胞 ( 分为 Th1 与 Th2 两个 亚群 ) 应答和 CD8+ 细胞毒性 T 细胞应答， 因此可根据机体对病原体的免疫应答特点， 选择 特异性的 Th1 表位、 Th2 表位或 CTL 表位诱导机体免疫应答向 Th1、 Th2 或 CTL 应答类型定 向发展。
考虑到多表位疫苗的保护范围， 可将目标抗原上的多个 B 细胞表位和外源性 ( 或 内源性 )T 细胞表位同时考虑进来， 以诱导特异的体液和细胞免疫， 从体液和细胞免疫水平 发挥预防控制作用， 这种设计可以拓宽多表位疫苗的保护谱。若选择的表位来自抗原分子 的保守氨基酸区域， 则可提供不同毒株之间的交叉免疫保护， 可有效应对宿主自身基因的 高频突变所造成的免疫逃避问题。 据此构建具有交叉保护作用的可准确到达靶标的复合型 多表位疫苗， 可能是预防具有多血清型及高突变率病毒 ( 如禽流感病毒 ) 感染的有效途径。
病毒表达系统 ： 历史上， 痘苗病毒 (Vaccinia virus， VV) 曾经为人类抗病毒斗争做出过巨大贡献， 曾作为预防天花的有效疫苗在世界范围内被广泛应用， 为人类在全世界范围内消灭天花做 出了决定性的贡献。痘苗病毒具有极高的免疫效率， 但是它也具有明显的副作用。由于痘 苗病毒的副作用， 人们在六、 七十年代就开始了痘苗病毒的致弱工作。
1960 年至 1974 年间， 德国教授 Anton Mayr 领导的研究小组通过将鸡胚成纤维细 胞 (CEF) 传代的方法， 成功地将从 Ankara 地区分离得到的痘苗病毒 CVA 株致弱。传到 516 代时， 这株致弱毒株被命名为 MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA 不但继承了 CVA 良好 的免疫原性， 以及对天花保护性高的特点， 同时在哺乳动物体内不能有效繁殖， 所以 MVA 还 具有对人和动物毒副作用小的特点。动物实验 ( 鸡、 兔和小鼠 ) 显示， MVA 对新生动物不产 生任何副作用， 甚至对于免疫缺陷的动物同样没有副作用。与亲本 VV 相比， MVA 在许可细 胞系中的产量远高于前者， 表现出明显的宿主细胞适应倾向。
研究表明， 限制 MVA 宿主范围 (Host Range， HR) 的基因突变主要分布在基因组左 端， 已知的有 KIL 基因和 SPI-1 基因， 本发明中利用的是 K1L 基因。
由于 MVA 的基因组庞大而复杂， 不可能通过基因拼接直接将外源基因插入到病毒 基因组中。因此， 必须依靠转移载体的协助， 通过痘病毒 DNA 复制过程中发生的体内同源重 组将外源基因导入痘病毒基因组。
Staib 等近期报道了利用 RK-13 生长限制筛选重组 MVA 的新方法。早先的研究已 表明， RK-13 是 MVA 的非许可宿主细胞， 但如果在 MVA 基因组中补偿 KIL 基因， 则可特异地 恢复其在 RK-13 中的增殖。pGEM-K1L 载体质粒中包含了表达宿主范围基因 KIL 的组件， 以 其作为瞬时选择标记， 同时在 KIL 基因两侧又设置了重复的 DNA 序列， 当重组基因插入 MVA 基因组后， 可通过在 RK-13 中选择性生长， 获得无野生型病毒混杂的重组病毒， 此时再感染 BHK-21 细胞， 在没有选择压力的条件下， KIL 基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法 省却了传统方法需要使用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节， 相对简化了筛选 过程。
发明内容 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷， 提供一种表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多 表位抗原的重组痘病毒 rMVA-mep。
本发明的另一目的是提供含有该重组痘病毒 rMVA-mep 的药用组合物。
本发明的又一目的是提供重组痘病毒 rMVA-mep 应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
一种重组转移载体 pGEM-K1L-mep， 包含表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多表位抗原的 DNA 序列 ： SEQ ID NO.1， 以及 MVA 转移载体 pGEM-K1L ； 所述的 MVA 转移载体 pGEM-K1L 保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.5340， 保藏日期为 2011-10-13。
一种重组痘病毒 rMVA-mep， 由所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 转染被野生型 MVA 感染的原代仓鼠肾细胞 BHK-21， 并先后经 RK-13 细胞和 BHK-21 细胞传代纯化所得。
该重组痘病毒 rMVA-mep 通过如下步骤得到 ：
(1) 所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 转染已被痘苗病毒野毒 MVA 感染的原代仓 鼠肾细胞 BHK-21， 得到的培养液命名为 BHK-21-mep ；
(2) 将 BHK-21-mep 在兔肾细胞 RK-13 上传代若干代， 直至不再存在痘苗病毒野毒 MVA， 得到的培养液命名为 RK-13-mep ；
(3) 将 RK-13-mep 感染原代仓鼠肾细胞 BHK-21， 并传代至重组病毒中宿主限制性 基因 K1L 已缺失， 从而得到重组痘病毒命名为 rMVA-mep。
所述的重组痘病毒 rMVA-mep 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13。
一种药用组合物， 包含所述的重组痘病毒 rMVA-mep 以及药学上可接受的载体和 辅料。
所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的 药物中的应用。
所述的重组痘病毒 rMVA-mep 在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的药物中 的应用。
所述的药用组合物在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
有益效果 ：
1、 本发明应用的痘苗病毒转移载体是经过改造的， 有一定的宿主限制性。该痘苗 病毒转移载体中包含了表达宿主限制范围基因的 KIL 组件， 以其作为瞬时选择标记， 同时 在 KIL 基因两侧又设置了重复的 DNA 序列， 当重组基因插入 MVA 基因组后， 可通过在 RK-13 中选择性生长， 获得无野生型病毒混杂的重组病毒， 此时再感染 BHK-21 细胞， 在没有选择 压力的条件下， KIL 基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法省略了传统方法需要使 用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节， 相对简化了筛选过程， 如此得到的重组 痘苗病毒， 是野毒核酸与外源基因的重组。
2. 本发明利用痘苗病毒表达系统构建表达外源基因的重组痘病毒 rMVA-mep ： 将 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因克隆入痘苗病毒表达系统中， 转
染 BHK-21 细胞后进行 PCR 鉴定和 Western-blotting 实验， 结果表明外源多表位抗原基因 在 BHK-21 细胞中高效表达。
3. 本发明构建的重组痘病毒疫苗与传统的原核表达系统表达目的蛋白作为疫苗 相比， 有如下优点 ： 一是重组痘苗病毒疫苗在动物体内产生的蛋白抗原具有天然构象， 能最 大程度的发挥抗原表位的作用 ； 二是病毒本身及收获病毒过程中附带的细胞营养液等不会 对动物产生不可预测的免疫干扰 ； 三是重组痘苗病毒疫苗能够方便快速大量获得， 能有效 地节省时间和成本， 可见具有明显的优势。 附图说明 图 1、 多表位基因 (mep) 的 SOE-PCR 扩增与重组质粒 pMD18-T-mep 的酶切鉴定其中 M 表示 Marker 2000，
1SOE-PCR 扩增产物 (437bp)，
2 重组质粒 pMD18-T-mep 酶切鉴定 ： (pMD18-T 载体 ： 2680bp ； 目的片段 ： 437bp)。
图2： 重组病毒的纯化
A 图为对 BHK-21-mep 转接于 RK-13 细胞传代鉴定
目的基因为 437bp， 痘苗病毒野毒特征性基因为 700bp 左右， 宿主限制性基因 K1L 为 1332bp ；
1： RK-13-mep-6，
2： RK-13-mep-4 ；
3： RK-13-mep-3 ；
4： RK-13-mep-1 ；
M 表示 Marker 2000 ；
2、 3、 4 泳道三者中同时含有三种基因， 1 泳道只有目的基因， 无痘苗病毒特征性基 因和宿主限制性基因， 证明重组痘病毒在 RK-13 细胞上传代至第六代已经得到初步纯化， MVA 野毒已经不存在。
B 图为对 RK-13-mep-6 进行 PCR 鉴定
6： 用 K1L 特异引物鉴定， 结果含有 K1L 基因 ；
7： 用 mep 特异引物鉴定， 结果含有 mep 基因 ；
8： 用 MVA 野毒特异性基因引物鉴定， 结果不含有 MVA 野毒特异基因 ；
M 表示 Marker 2000 ；
证明重组痘病毒在 RK-13 细胞上传代至第六代已经得到初步纯化， MVA 野毒已经 不存在。
C 图为 RK-13-mep-6 转接于 BHK-21 细胞传代鉴定
10 ： BHK-21-mep-6 ；
11 ： BHK-21-mep-4 ； 两者中只有目的基因 ；
12 ： BHK-21-mep-2 ；
13 ： BHK-21-mep-1 ； 两者中既含有目的基因也含有宿主限制性基因 K1l ；
M 表示 Marker 2000 ；
证明 RK-13-mep-6 在 BHK-21 细胞上传代已经丢失 K1L 基因， 重组毒得到充分纯
化， 纯化产物命名为 rMVA-mep。
图3： 重组痘病毒表达目的基因的蛋白印记
M 为低分子量蛋白质 Marker
1： 原核表达系统 pet28-mep 表达目的蛋白 rMEP 作阳性对照 ；
2： BHK-21-mep-6 表达目的蛋白 ；
3： BHK-21-mep-1 表达目的蛋白 ；
4： BHK-21 细胞 ( 未感染任何病毒 ) 作空白对照 ；
1、 2、 3 泳道三者的目的条带大小和浓度一致， 空白对照中无任何条带， 说明重组痘 病毒 rMVA-mep 能顺利表达目的蛋白并且具有一定的稳定性。
图4： 免疫程序示意图。
图5： JEV 抗体水平。
图6： JEV 抗体亚型 IgG1 水平。
图7： JEV 抗体亚型 IgG2 水平。
图8： 细胞因子 (IFN-γ 和 IL-4) 水平。
图9： 淋巴细胞增殖水平。 生物材料保藏信息
MVA 转移载体 pGEM-K1L， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 简称 CGMCC， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保藏号为 CGMCC NO.5340， 保藏日期为 2011-10-13， 分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
重组痘病毒 rMVA-mep， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 简称 CGMCC， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保藏 号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13， 分类命名为豆苗病毒。
具体实施方式
实施例 1
1. 获取 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因并克隆入 pMD18-T 载体
本发明选择了 E 蛋白上 6 个能诱导机体产生中和抗体的 B 细胞表位， 氨基酸残基 分别位于 75-92， 149-163， 258-285， 356-362， 373-399， 397-403。以及一个 CTL 表位和一个 Th 表位， 氨基酸残基分别位于 60-68 和 436-445， 见表 1。 根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则， 设计合成 10 条引物， 见表 2。采用重叠延伸 PCR(SOE) 合成 JEVE 蛋白的多表位基因， 命名为 mep， 将其克隆到 pMD18-T 载体， 测序分析正确获得阳性质粒， 命名为 pMD18-T-mep， 该 mep 基 因序列为 SEQ ID No.1。
重叠延伸 PCR(SOE) 扩增体系为 5×SP Buffer 10μL， dNTP(2.5mM)2μL， 引物 F1、 F2、 F3、 F4、 F5、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5 各 1μL， PrimeSTAR DNA 聚合酶 0.5μL， 去离子水补至 50μL。
重叠延伸 PCR(SOE) 扩增条件 ： 95℃预变性 5min， 扩增条件为 ： 94℃ 30s， 57℃ 30s， 72℃ 30s， 35cycles， 72℃延伸 10min。表 1 各表位的特点[1]Parker JM， Guo D and Hodges RS.New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data ： correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites.Biochemistry 1986 ； 25 ： 5425-32.
[2]Dewasthaly S， Ayachit VM， Sarthi SA and Gore MM.Monoclonal antibody raised against envelope glycoprotein peptide neutralizes Japanese encephalitis virus.Arch Virol 2001 ； 146 ： 1427-35.
[3]Kolaskar AS ， Kulkarni-Kale U.Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes ofenvelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus.Virology 1999 ； 261 ： 31-42.
[4]Seif SA， Morita K， Matsuo S， Hasebe F and Igarashi A.Finer mapping of neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system.Vaccine 1995 ； 13 ： 1515-1521.
[5]Takada K， Masaki H， Konishi E， Takahashi M and Kurane I.Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus(JEV)envelope protein recognized by JEV-specific murine CD8+cytotoxic T lymphocytes.Arch Virol 2000 ； 145 ： 523-34.
[6]Kutubuddin M， Kolaskar AS， Galande S， Gore MM， Ghosh SN and Banerjee K.Recognition of helper T cell epitopes in envelope(E)glycoprotein of Japanese encephalitis， west Nile and Dengue viruses.Mol Immunol 1991 ； 28 ： 149-54.
表 2SOE-PCR 引物
2. 重组转移载体 pGEM-K1L-mep 的构建与鉴定
利 用 双 酶 切 位 点 NheI/XhoI 将 pMD18-T-mep 和 MVA 转 移 载 体 pGEM-K1L(CGMCC NO.5340) 酶切， 琼脂糖凝胶鉴定后回收目的片段 mep 和 MVA 转移载体 pGEM-K1L。
将酶切后回收的目的片段 mep 和 MVA 转移载体 pGEM-K1L 按照合适的连接比例 ( 摩 尔数 2 ∶ 1)， 4℃连接过夜， 第二天转化大肠埃希氏 DH5a， 涂氨苄平皿， 第三天挑菌 PCR、 酶切 鉴定， 选取阳性克隆， 测序， 获得重组转移载体 pGEM-K1L-mep， 见图 1。其中 PCR 鉴定引物为
F1-5’ ： ctcgagatgccgaccaccggcgaagcgca(SEQ ID No.20) ；
F1-3’ ： catatgatttttataaaaatttaaaacacctgatgcaccgcacggccgatgctag(SEQ ID No.21)。
3. 重组痘病毒 rMVA-mep 的获得
用六孔板培养原代仓鼠肾细胞 (BHK-21， ATCC CCL-10)， 至细胞密度 70％ -80％ 时， 每孔接 100TCID50 改良安卡拉痘苗病毒 MVA(1987 年 11 月 15 日保藏于 CNCM， 保藏号 1-721)， 37 ℃， 5 ％ CO2， 孵育 2h ； 将重组转移载体 pGEM-K1L-mep 与脂质体的混合物接于每 孔， 37℃， 5％ CO2， 孵育 4h ； 换 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48 小时， 观察细胞病 变， 收毒保存， 命名为 BHK-21-mep， 其中包括重组 rMVA-mep 和未发生重组的野毒 MVA。用 PCR， SDS-PAGE 等来鉴定重组 rMVA-mep。PCR 鉴定引物 ： F1-5’ ： SEQ ID No.20 ； F1-3’ ： SEQ ID No.21。
实施例 2.
1 重组痘病毒粒子的纯化
用六孔板培养兔肾细胞 (RK-13， ATCC CCL-37)， 至细胞密度 70％ -80％时， 每孔 -2 接稀释至 10 浓度的 BHK-21-mep， 37 ℃， 5 ％ CO2， 孵育 2h ； 换 8 ％ DMEM 营养液， 37 ℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察细胞病变 ( 细胞不再成单层， 收缩聚堆成颗粒状 )， 收毒保存， 标记为 RK-13-mep-1。 将在 RK-13 细胞上的第一代纯化病毒 RK-13-mep-1 以 10 倍倍比稀释至 10-2， 将 10-2 稀释度接种于新单层 RK-13 细胞， 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察 细胞病变 ( 细胞不再成单层， 收缩聚堆成颗粒状 )， 收毒保存， 标记为 RK-13-mep-2， 依次稀
释传代至 RK-13-mep-6， 经 PCR 鉴定后确定收集病毒液里不再存在痘苗病毒野毒 MVA， 见图 2B， 此培养液命名为 RK-13-mep。其中 PCR 鉴定引物 ： F2-5’ gaatgcacatacataagtaccggcatc tctagca(SEQ ID No.22)， F2-3’ caccagcgtctacatgacgagcttccgagtt(SEQ ID No.23)。
将 RK-13-mep( 即 RK-13-mep-6) 以 10 倍倍比稀释至 10-2， 将 10-2 稀释度接种于新 单层 BHK-21 细胞， 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察细胞病变， 收毒保存， 标记为 BHK-21-mep-1， 依上述方法稀释传代纯化至 BHK-21-mep-6， 经 PCR 鉴定后确定重组 痘病毒中宿主限制性基因 K1l 已缺失， 证明重组痘病毒得到纯化 ( 见图 2C)。其中， PCR 鉴 定引物 ： F3-5’ acataagtaccggcatctctagcacacagc(SEQ ID No.24)， F3-3’ ttcgccggtggtcgg catctcgagagctac(SEQ ID No.25)。将 BHK-21-mep-6 病毒传代扩大培养并长期保存， 即重 组痘病毒 rMVA-mep。该重组痘病毒 rMVA-mep 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13。
2 蛋白印记
对重组痘病毒 rMVA-mep 进行超速离心浓缩后， 取适当的样品进行 SDS-PAGE 电泳， 同时设正常的 BHK-21 细胞培养物做空白对照和原核表达系统 pet28-mep 表达目的蛋白 (rMEP) 做阳性对照。 准备滤纸、 滤膜和胶 ： 电泳结束后， 取出凝胶根据加样孔的位置切下凝胶， 把凝胶 转移到一盘去离子水中略为漂洗一下。用刻度尺量好胶的长、 宽， 剪下相同大小的滤纸 6 张， 一张相同大小的硝酸纤维膜 (NC 膜 )， 用软铅笔在滤膜左上角作好标记。把硝酸纤维 素滤膜漂浮于一盘去离子水的水面上， 借毛细作用使之从上往下湿润后， 将之浸没于水中， 浸泡 5min 以上以驱除留于滤膜上的气泡 ； 将滤纸浸泡在转移缓冲液中 (48mmol/L Tris ； 39mmol/L 甘氨酸 ( 电泳级 ) ； 0.037％ SDS ； 20％甲醇 )5min。
在电转仪底部电极上， 放置 3 张用转移缓冲液浸泡过的 3mm 滤纸， 逐张叠放， 精确 对齐， 每铺一张滤纸后， 以玻璃棒均匀用力， 反复碾压纸面， 确保排除夹杂在滤纸间的气泡。 随后铺上 NC 膜， 要保证精确对齐， 而且在 3mm 滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。 将切下的凝胶小心放置在 NC 膜表面， 把凝胶左上角置于硝酸纤维素滤膜的标记角上。在凝 胶表面逐一叠加浸泡过的滤纸， 操作同前。最后合上电转仪盖子。接通电源， 以稳压方式转 印， 15V， 转移 15-20min。
转移结束后， 断开电源， 打开电转仪盖子， 从上到下拆卸转移装置， 逐一掀去各层。 把凝胶转移至盛有染色液的托盘中， 进行染色， 以便检查蛋白质转移是否完全。
封闭 ： 小心取出转移膜并将其转入盛有约 10 ～ 20ml 5％脱脂乳 ( 磷酸盐缓冲液 配制 ) 封闭液的平皿中， 室温下于摇床上温和地振摇 2h。 以 PBTS 缓冲液充分漂洗封闭后的 转移膜， 重复洗 3 次， 每次室温下温和振摇 10min， 每次约 10ml 缓冲液。封闭液 ： 5％ (W/V) 脱脂奶粉， 0.01％防沫剂， 0.02％叠氮钠， 溶于磷酸缓冲液 (PBS)。
与一抗结合 ： 洗涤完毕后， 将转移膜转入一个清洁平皿内。向 9.9ml 5％脱脂乳封 闭液中加入 0.1ml 猪抗 JEV 阳性血清， 混合均匀后， 倒入平皿内， 于室温温和振摇 2h。随后 用 PBS 漂洗 3 次， 每次 10 分钟。
与 HRP-SPA 结合 ： 将转移膜置于一个可封闭不透水的塑料袋内。用 5％脱脂乳封 闭液将 HRP-SPA 按照 1 ∶ 500 稀释， 倒入盛有转移膜的塑料袋中， 尽量排除袋内气泡， 封闭 袋口。将塑料袋放在一个平皿内， 置于 37℃摇床中缓慢振摇并温育 1h。结束后， 取出转移
膜置于一个洁净平皿内， 加入 PBS 缓冲液 20ml， 漂洗 3 次， 每次 10 分钟。
显色 ： 在一个清洁平皿中按照 DAB 显色试剂盒配制显色液 5mL( 现配现用 )， 然后 将洗涤好的硝酸纤维素滤膜放入其中， 轻轻摇动， 一旦条带显色较清楚即用蒸溜水漂洗硝 酸纤维素滤膜以终止反应， 取出后拍照保存备用。
结 果 见 图 3， 图 3 显 示 BHK-21-6 和 BHK-21-1 与 作 为 对 照 的 原 核 表 达 系 统 pet28-mep 表达目的蛋白 (rMEP) 的目的条带大小和浓度一致， 说明重组病毒 MVA-mep 能顺 利表达目的蛋白并且有一定的稳定性。
实施例 3
1 小鼠免疫与攻毒实验
动物分组及免疫剂量 ( 见表 3) ： 4 ～ 6 周龄的 BALB/c 雌性小鼠随机分为 8 组， 每 组 10 只。
表 3 动物分组及免疫剂量
注： 1. 乙脑灭活疫苗购于中牧集团成都生物制品公司。
2.rMEP 蛋白和 EDIII 蛋白的制备 ： 见参考文献 Jian-chao Wei， Yi-zhu Huang， Deng-ke Zhong， Le Kang， Hassan Ishag， Xiang Mao， Rui-bing Cao， Bin Zhou， Pu-yan Chen， *Design and evaluation of a multi-epitope peptide against Japanese encephalitis virus infection in BALB/c mice.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 396(2010)787-792.
免疫程序 ( 见图 4) ： 各组小鼠于第 0 天初免后， 第 14、 28 天各加强免疫一次。每
组小鼠在初免前和初免后的第 14、 28、 42 天采集血样。第二次加强免疫 7 天后 ( 第 35 天 )， 每组处死 2 只小鼠取脾细胞用于细胞因子、 淋巴细胞增殖实验， 剩下的 8 只小鼠用致死量 6 (5×10 PFU) 的 JEV 强毒株 SA14 进行腹腔攻击， 观察 15 天， 记录发病死亡情况 ( 见表 4)。
抗血清的收集保存 ： 采集的血样分别于室温、 4℃各放置 0.5h， 2000rpm 离心 8 分 钟， 收集上清， -20℃保存备用。
统计学分析
采用 SPSS 16.0 统计分析软件对实验结果进行方差分析和 t 检验。数据表示为平 均值 ± 标准差。P ＜ 0.05 认定为差异显著。
2ELISA 检测抗体滴度及抗体亚型
用 ELISA 来分析抗 rMEP 的抗体滴度， 具体操作方法如下 ： 纯化后的 rMEP( 原核表 达系统 pet28-mep) 用包被液稀释后包被 96 孔酶标板， 每孔 100μL， 37℃包被 1 小时后， 4℃ 包被过夜。弃去包被液， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 200μL 封闭液， 37 ℃孵育 1 个小时。 弃去封闭液， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入稀释后的免疫小鼠血清各 100μL， 37℃孵育 1 个 小时。弃去孔内液体， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 100μL 的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG(1 ∶ 5000 稀释 )， 37℃孵育 1 个小时。用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 100μL TMB 显色溶 液， 37℃显色 10-30min。每孔加 50μL 2M H2SO4 终止液， 酶标仪读取 450nm 波长吸光度值。 抗体亚型 IgG1 和 IgG2a 的分析方法同上， 除了二抗加的是辣根过氧化物酶标记的 羊抗鼠 IgG1 和 IgG2a 抗体 ( 购自杭州联科生物有限公司 )。
结果判定 ： 以 ODS/ODN ≥ 2.1 的最高血清稀释倍数为 ELISA 抗体的终点滴度。
结果分析 ： 从图 5 可以看出， 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml) 在首免后第 14、 28、 42 天产生的抗体滴度与灭活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组几乎一致。其次是重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 107TCID50， 0.1ml)， 6 第三是重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml)。最低的是 MVA 野毒免疫 组和 PBS 免疫组， 几乎没有抗 rMEP 抗体的产生。
通过对抗体亚型的分析 ( 见图 6 和图 7) 可知， 实验免疫组产生的 IgG1 都比 IgG2a 8 高。重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 在首免后第 14、 28、 42 天产 生的 IgG1 和 IgG2a 与灭活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组几乎一致。相 比较而言， 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 107TCID50， 0.1ml) 次之， 第三是重组痘 6 病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml)。对照组 (MVA 野毒组和 PBS 组 ) 没有 IgG1 和 IgG2a 产生。因此可以说明重组痘病毒 rMVA-mep 可以诱导产生 Th2 型的免疫应答， 并且当重组痘病毒达到一定的含量时可以引起与灭活苗等有效疫苗相同的免疫效应。
3 噬斑减少中和试验
将第 35 天收集的各免疫组小鼠血清分别等体积混合 ( 注释 ： 每个免疫组取 5 只小 鼠采血清， 5 管血清分别取等体积混合成为 1 管 )， 56℃灭活 30 分钟。然后与 100PFU 的乙 型脑炎强毒株 SA14 病毒 ( 购于中牧集团成都生物制品公司 ) 等体积混合， 37℃水浴作用 60 分钟。将病毒 -- 抗体混合物接种到长满单层 BHK-21 细胞的 24 孔板中， 每个稀释度各接种 4 孔， 每孔 200μL。37℃培养 1h 且每 15min 轻摇一次。1h 后弃残液， 每孔加入含终浓度为 1％甲基纤维素营养覆盖物 1ml， 于 37℃培养箱中培养 5d。取出 24 孔板， 吸出覆盖物， 每孔 加入 2ml 结晶紫染色液， 0.5h 后弃去染色液， 流水冲洗至可见噬斑。统计每孔噬斑数， 计算
每个稀释度的噬斑减少率， 以无抗体作用、 等量单纯病毒所致空斑数为标准， 能使噬斑减少 50％的最大血清稀释倍数为中和抗体滴度。
采用噬斑减少中和试验检测第二次加强免疫两周后 ( 第 42 天 ) 血清中中和抗体 的滴度。从表 4 可以看出， 有四个免疫组中和抗体滴度水平基本一致， 其中灭活苗免疫组 产生的中和抗体滴度最高， 达到 58±2.01。其次是 rMEP 蛋白免疫组， 中和抗体滴度达到 57±1.99。然后是 EDIII 蛋白免疫组和重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml)， 中和抗体滴度分别为 56±1.99 和 56±1.01。而重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免 疫剂量 107TCID50， 0.1ml) 和重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 106TCID50， 0.1ml) 的中 和抗体滴度依次降低。MVA 野毒组和 PBS 免疫组几乎没有中和抗体的产生。
表 4 中和抗体滴度水平和免疫保护水平
4 细胞因子检测
用制备好的各免疫组小鼠脾细胞悬液铺板， 每孔 100μL(5×105 细胞 /ml) 接种至 96 孔细胞培养板， 同时加入终浓度为 10μg/mL 的 rMEP 进行刺激， 37℃培养 72h 后收集上 清， 用细胞因子检测试剂盒来检测上清中 IL-4 和 IFN-γ 的含量， 操作方法按照说明书进 行。细胞因子 (IL-4 和 IFN-γ) 检测试剂盒为上海晶美生物公司产品。
结果如图 8 显示， 所有试验免疫组产生的 IL-4 水平都低于 IFN-γ 的水平。重组 痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml) 产生的 IL-4 和 IFN-γ 的水平与灭 活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组基本一致。MVA 野毒组及 PBS 免疫组 几乎没有 IL-4 和 IFN-γ 的产生。由于重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组产生的 Th1 型的细胞 因子 (IFN-γ) 水平高于其所产生的 Th2 型的细胞因子 (IL-4)， 因此可以说明重组痘病毒 rMVA-mep 又可以诱导产生 Th1 型的免疫应答。
5 淋巴细胞增殖分析
5.1 免疫小鼠脾脏单个淋巴细胞悬液的制备
(1) 打开超净工作台紫外灯照射 30min， 取 2 只三免一周后小鼠拉颈处死， 放入装 有 75％酒精的烧杯中， 随即放入超净台内。
(2) 用 75％酒精棉消毒小鼠腹部， 无菌手术开腹腔取出脾脏， 去除脂肪和结缔组 织， 剪成 5-7 段， 放入 200 目不锈钢网筛， 将网筛置于预先放入 3ml 无血清 RPMI 1640 营养 液的平皿中， 用研磨棒挤压出脾细胞， 尽量挤压干净。
(3) 在 10ml 的刻度离心管中先加入 6ml 淋巴细胞分离液， 将脾细胞悬液沿着管壁 慢慢加入分离液上方， 1500rpm 离心 10min。
(4) 离心后取中间的白膜层， 加入 3-6ml 无血清 RPMI 1640 营养液洗涤 2 次， 1500rpm 离心 10min。最后用 RPMI 1640 培养基 ( 含 10％ FCS， 1-2％双抗 ) 将淋巴细胞重 悬。
(5) 用细胞计数器对淋巴细胞计数后铺板。
5.2 淋巴细胞增殖水平
用制备好的各免疫组小鼠脾细胞悬液铺板， 每孔 100μL(5×105 细胞 /ml) 接种 至 96 孔细胞培养板， 同时加入终浓度为 10μg/mL 的 rMEP 进行刺激， 将细胞板培养 48h， 提前 4h 取出， 加 MTT( 原始浓度 5mg/mL)20LLP/ 孔， 继续培养 4h， 取出后弃上清， 每孔加 100μLDMSO， 使结晶溶解， 在微量震荡器震荡， 测 OD570 值。
从图 9 可以看出， 以原核表达的 rMEP 蛋白作为刺激原， 重组痘病毒 rMVA-mep 免 8 疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 免疫小鼠获得了较强的特异性淋巴细胞增殖， 明显高于 7 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 和 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 6 10 TCID50， 0.1ml)， 但与灭活苗、 EDIII 蛋白和 rMEP 蛋白免疫组的细胞增殖水平基本一致， 统计学分析结果显示， 这四组免疫组所引发的 T 细胞增殖反应强度差异不明显 (P ＞ 0.05)。 MVA 野毒组和 PBS 免疫组没有淋巴细胞增殖反应。 此结果表明， 采用改良型痘苗病毒安卡拉 株 MVA 构建的重组痘病毒 rMVA-mep 免疫小鼠后能够诱发较强的淋巴细胞增殖。
6 对致死量的 JEV 的保护力
本发明属于基因工程疫苗领域， 涉及表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多表位抗原的重组 痘病毒 rMVA-mep 及其应用。背景技术
日本脑炎病毒 ( 简称乙脑 ) 属于黄病毒科黄病毒属， 是一种以蚊虫为媒介传播的 人畜共患的病毒性疾病。 对人类危害巨大， 是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一， 对猪 可引起繁殖障碍， 给养猪业造成巨大的经济损失。猪是 JEV 的中间宿主， 带毒猪是本病的主 要传染源。因此， 控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。
目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗， 但是有关它们的安全性、 生产和使 用费用等问题越来越突出。 WHO 正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗， 乙脑病毒的 E 蛋白与病 毒和细胞受体结合、 膜融合有关， 也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。
表位 (epitope) 是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团， 又称抗原决定簇 (antigenic determinant)。它是 T 细胞抗原受体 (T cell receptor， TCR) 和 B 细胞抗原 受体 (B cell receptor， BCR) 与抗体特异结合的基本单位。 在免疫应答中， TCR 和 BCR 所识 别的抗原表位不同， 分别被称为 T 细胞表位和 B 细胞表位。作为理想的免疫原， 抗原分子中 应同时包含目的抗原 B 细胞表位和自身或外源 T 细胞表位， 才能诱导出高度特异性的体液 及细胞免疫反应， 从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用， 赋予较广泛的保护性。 目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展， 因此表位疫苗成为近年来病毒新型 疫苗研究的热点。
E 蛋白表位研究 ：
Takada K 等 (2002) 通过 JEV E 蛋白在小鼠体内特异性的 CD8+CTLs 反应， 证明 60 68 CYHASVTDI 是 E 蛋白上主要的 CTL 表位。
Lin 等 (2004) 应用噬菌体展示肽库鉴定了 JEV 囊膜蛋白的模拟表位， 同单抗 2H2 结合的模拟表位拥有一个保守的基序 X(1)(D/E)(Y/T/S)X(2)， 该基序位于 E 蛋白区域 III 的外侧表面。
闫丽萍等 (2007) 用融合蛋白进行免疫学反应性扫描， 鉴定出了 9 个 E 蛋白线 性 抗 原 表 位： E1(1-16)、 E10-4(77-84)、 E11-2(83-94)、 E19(145-164)、 E33(257-272)、 E39-2(309-316)、 E45-3(359-362)、 E48-1(377-384)、 E49(385-400)。
多表位疫苗 (multi-epitope vaccine) 也称鸡尾酒式疫苗， 是同时携带多个与目 标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制备的， 代表了一种疫苗设计的新方向， 对它的研究 是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路， 是基因工程疫苗研究领域里的热点之一。 与传统疫苗相比， 多表位疫苗有很多优势 ： 能被具 有多种遗传背景的 MHC 分子识别、 结合， 从而得到高效的递呈 ； 在细胞免疫方面具有独特的 优势， 可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。抗原表位的选择
为了使机体获得最佳的免疫保护， 需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊 性， 有针对性的选择目的表位。体液免疫和细胞免疫共同构成了机体的免疫应答系统。体 液免疫主要是通过 B 细胞产生的抗体来发挥作用的， 故可以选择特异性 B 细胞表位来定向 诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括 CD4+ 辅助性 T 细胞 ( 分为 Th1 与 Th2 两个 亚群 ) 应答和 CD8+ 细胞毒性 T 细胞应答， 因此可根据机体对病原体的免疫应答特点， 选择 特异性的 Th1 表位、 Th2 表位或 CTL 表位诱导机体免疫应答向 Th1、 Th2 或 CTL 应答类型定 向发展。
考虑到多表位疫苗的保护范围， 可将目标抗原上的多个 B 细胞表位和外源性 ( 或 内源性 )T 细胞表位同时考虑进来， 以诱导特异的体液和细胞免疫， 从体液和细胞免疫水平 发挥预防控制作用， 这种设计可以拓宽多表位疫苗的保护谱。若选择的表位来自抗原分子 的保守氨基酸区域， 则可提供不同毒株之间的交叉免疫保护， 可有效应对宿主自身基因的 高频突变所造成的免疫逃避问题。 据此构建具有交叉保护作用的可准确到达靶标的复合型 多表位疫苗， 可能是预防具有多血清型及高突变率病毒 ( 如禽流感病毒 ) 感染的有效途径。
病毒表达系统 ： 历史上， 痘苗病毒 (Vaccinia virus， VV) 曾经为人类抗病毒斗争做出过巨大贡献， 曾作为预防天花的有效疫苗在世界范围内被广泛应用， 为人类在全世界范围内消灭天花做 出了决定性的贡献。痘苗病毒具有极高的免疫效率， 但是它也具有明显的副作用。由于痘 苗病毒的副作用， 人们在六、 七十年代就开始了痘苗病毒的致弱工作。
1960 年至 1974 年间， 德国教授 Anton Mayr 领导的研究小组通过将鸡胚成纤维细 胞 (CEF) 传代的方法， 成功地将从 Ankara 地区分离得到的痘苗病毒 CVA 株致弱。传到 516 代时， 这株致弱毒株被命名为 MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA 不但继承了 CVA 良好 的免疫原性， 以及对天花保护性高的特点， 同时在哺乳动物体内不能有效繁殖， 所以 MVA 还 具有对人和动物毒副作用小的特点。动物实验 ( 鸡、 兔和小鼠 ) 显示， MVA 对新生动物不产 生任何副作用， 甚至对于免疫缺陷的动物同样没有副作用。与亲本 VV 相比， MVA 在许可细 胞系中的产量远高于前者， 表现出明显的宿主细胞适应倾向。
研究表明， 限制 MVA 宿主范围 (Host Range， HR) 的基因突变主要分布在基因组左 端， 已知的有 KIL 基因和 SPI-1 基因， 本发明中利用的是 K1L 基因。
由于 MVA 的基因组庞大而复杂， 不可能通过基因拼接直接将外源基因插入到病毒 基因组中。因此， 必须依靠转移载体的协助， 通过痘病毒 DNA 复制过程中发生的体内同源重 组将外源基因导入痘病毒基因组。
Staib 等近期报道了利用 RK-13 生长限制筛选重组 MVA 的新方法。早先的研究已 表明， RK-13 是 MVA 的非许可宿主细胞， 但如果在 MVA 基因组中补偿 KIL 基因， 则可特异地 恢复其在 RK-13 中的增殖。pGEM-K1L 载体质粒中包含了表达宿主范围基因 KIL 的组件， 以 其作为瞬时选择标记， 同时在 KIL 基因两侧又设置了重复的 DNA 序列， 当重组基因插入 MVA 基因组后， 可通过在 RK-13 中选择性生长， 获得无野生型病毒混杂的重组病毒， 此时再感染 BHK-21 细胞， 在没有选择压力的条件下， KIL 基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法 省却了传统方法需要使用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节， 相对简化了筛选 过程。
发明内容 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷， 提供一种表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多 表位抗原的重组痘病毒 rMVA-mep。
本发明的另一目的是提供含有该重组痘病毒 rMVA-mep 的药用组合物。
本发明的又一目的是提供重组痘病毒 rMVA-mep 应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
一种重组转移载体 pGEM-K1L-mep， 包含表达乙型脑炎病毒 E 蛋白多表位抗原的 DNA 序列 ： SEQ ID NO.1， 以及 MVA 转移载体 pGEM-K1L ； 所述的 MVA 转移载体 pGEM-K1L 保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.5340， 保藏日期为 2011-10-13。
一种重组痘病毒 rMVA-mep， 由所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 转染被野生型 MVA 感染的原代仓鼠肾细胞 BHK-21， 并先后经 RK-13 细胞和 BHK-21 细胞传代纯化所得。
该重组痘病毒 rMVA-mep 通过如下步骤得到 ：
(1) 所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 转染已被痘苗病毒野毒 MVA 感染的原代仓 鼠肾细胞 BHK-21， 得到的培养液命名为 BHK-21-mep ；
(2) 将 BHK-21-mep 在兔肾细胞 RK-13 上传代若干代， 直至不再存在痘苗病毒野毒 MVA， 得到的培养液命名为 RK-13-mep ；
(3) 将 RK-13-mep 感染原代仓鼠肾细胞 BHK-21， 并传代至重组病毒中宿主限制性 基因 K1L 已缺失， 从而得到重组痘病毒命名为 rMVA-mep。
所述的重组痘病毒 rMVA-mep 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13。
一种药用组合物， 包含所述的重组痘病毒 rMVA-mep 以及药学上可接受的载体和 辅料。
所述的重组转移载体 pGEM-K1L-mep 在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的 药物中的应用。
所述的重组痘病毒 rMVA-mep 在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的药物中 的应用。
所述的药用组合物在制备预防和 / 或治疗日本脑炎病毒感染的药物中的应用。
有益效果 ：
1、 本发明应用的痘苗病毒转移载体是经过改造的， 有一定的宿主限制性。该痘苗 病毒转移载体中包含了表达宿主限制范围基因的 KIL 组件， 以其作为瞬时选择标记， 同时 在 KIL 基因两侧又设置了重复的 DNA 序列， 当重组基因插入 MVA 基因组后， 可通过在 RK-13 中选择性生长， 获得无野生型病毒混杂的重组病毒， 此时再感染 BHK-21 细胞， 在没有选择 压力的条件下， KIL 基因经基因组内部重组后很快被去除。此方法省略了传统方法需要使 用抗生素和生色底物以及软琼脂培养的繁琐环节， 相对简化了筛选过程， 如此得到的重组 痘苗病毒， 是野毒核酸与外源基因的重组。
2. 本发明利用痘苗病毒表达系统构建表达外源基因的重组痘病毒 rMVA-mep ： 将 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因克隆入痘苗病毒表达系统中， 转
染 BHK-21 细胞后进行 PCR 鉴定和 Western-blotting 实验， 结果表明外源多表位抗原基因 在 BHK-21 细胞中高效表达。
3. 本发明构建的重组痘病毒疫苗与传统的原核表达系统表达目的蛋白作为疫苗 相比， 有如下优点 ： 一是重组痘苗病毒疫苗在动物体内产生的蛋白抗原具有天然构象， 能最 大程度的发挥抗原表位的作用 ； 二是病毒本身及收获病毒过程中附带的细胞营养液等不会 对动物产生不可预测的免疫干扰 ； 三是重组痘苗病毒疫苗能够方便快速大量获得， 能有效 地节省时间和成本， 可见具有明显的优势。 附图说明 图 1、 多表位基因 (mep) 的 SOE-PCR 扩增与重组质粒 pMD18-T-mep 的酶切鉴定其中 M 表示 Marker 2000，
1SOE-PCR 扩增产物 (437bp)，
2 重组质粒 pMD18-T-mep 酶切鉴定 ： (pMD18-T 载体 ： 2680bp ； 目的片段 ： 437bp)。
图2： 重组病毒的纯化
A 图为对 BHK-21-mep 转接于 RK-13 细胞传代鉴定
目的基因为 437bp， 痘苗病毒野毒特征性基因为 700bp 左右， 宿主限制性基因 K1L 为 1332bp ；
1： RK-13-mep-6，
2： RK-13-mep-4 ；
3： RK-13-mep-3 ；
4： RK-13-mep-1 ；
M 表示 Marker 2000 ；
2、 3、 4 泳道三者中同时含有三种基因， 1 泳道只有目的基因， 无痘苗病毒特征性基 因和宿主限制性基因， 证明重组痘病毒在 RK-13 细胞上传代至第六代已经得到初步纯化， MVA 野毒已经不存在。
B 图为对 RK-13-mep-6 进行 PCR 鉴定
6： 用 K1L 特异引物鉴定， 结果含有 K1L 基因 ；
7： 用 mep 特异引物鉴定， 结果含有 mep 基因 ；
8： 用 MVA 野毒特异性基因引物鉴定， 结果不含有 MVA 野毒特异基因 ；
M 表示 Marker 2000 ；
证明重组痘病毒在 RK-13 细胞上传代至第六代已经得到初步纯化， MVA 野毒已经 不存在。
C 图为 RK-13-mep-6 转接于 BHK-21 细胞传代鉴定
10 ： BHK-21-mep-6 ；
11 ： BHK-21-mep-4 ； 两者中只有目的基因 ；
12 ： BHK-21-mep-2 ；
13 ： BHK-21-mep-1 ； 两者中既含有目的基因也含有宿主限制性基因 K1l ；
M 表示 Marker 2000 ；
证明 RK-13-mep-6 在 BHK-21 细胞上传代已经丢失 K1L 基因， 重组毒得到充分纯
化， 纯化产物命名为 rMVA-mep。
图3： 重组痘病毒表达目的基因的蛋白印记
M 为低分子量蛋白质 Marker
1： 原核表达系统 pet28-mep 表达目的蛋白 rMEP 作阳性对照 ；
2： BHK-21-mep-6 表达目的蛋白 ；
3： BHK-21-mep-1 表达目的蛋白 ；
4： BHK-21 细胞 ( 未感染任何病毒 ) 作空白对照 ；
1、 2、 3 泳道三者的目的条带大小和浓度一致， 空白对照中无任何条带， 说明重组痘 病毒 rMVA-mep 能顺利表达目的蛋白并且具有一定的稳定性。
图4： 免疫程序示意图。
图5： JEV 抗体水平。
图6： JEV 抗体亚型 IgG1 水平。
图7： JEV 抗体亚型 IgG2 水平。
图8： 细胞因子 (IFN-γ 和 IL-4) 水平。
图9： 淋巴细胞增殖水平。 生物材料保藏信息
MVA 转移载体 pGEM-K1L， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 简称 CGMCC， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保藏号为 CGMCC NO.5340， 保藏日期为 2011-10-13， 分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
重组痘病毒 rMVA-mep， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 简称 CGMCC， 保藏地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保藏 号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13， 分类命名为豆苗病毒。
具体实施方式
实施例 1
1. 获取 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因并克隆入 pMD18-T 载体
本发明选择了 E 蛋白上 6 个能诱导机体产生中和抗体的 B 细胞表位， 氨基酸残基 分别位于 75-92， 149-163， 258-285， 356-362， 373-399， 397-403。以及一个 CTL 表位和一个 Th 表位， 氨基酸残基分别位于 60-68 和 436-445， 见表 1。 根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则， 设计合成 10 条引物， 见表 2。采用重叠延伸 PCR(SOE) 合成 JEVE 蛋白的多表位基因， 命名为 mep， 将其克隆到 pMD18-T 载体， 测序分析正确获得阳性质粒， 命名为 pMD18-T-mep， 该 mep 基 因序列为 SEQ ID No.1。
重叠延伸 PCR(SOE) 扩增体系为 5×SP Buffer 10μL， dNTP(2.5mM)2μL， 引物 F1、 F2、 F3、 F4、 F5、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5 各 1μL， PrimeSTAR DNA 聚合酶 0.5μL， 去离子水补至 50μL。
重叠延伸 PCR(SOE) 扩增条件 ： 95℃预变性 5min， 扩增条件为 ： 94℃ 30s， 57℃ 30s， 72℃ 30s， 35cycles， 72℃延伸 10min。表 1 各表位的特点[1]Parker JM， Guo D and Hodges RS.New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data ： correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites.Biochemistry 1986 ； 25 ： 5425-32.
[2]Dewasthaly S， Ayachit VM， Sarthi SA and Gore MM.Monoclonal antibody raised against envelope glycoprotein peptide neutralizes Japanese encephalitis virus.Arch Virol 2001 ； 146 ： 1427-35.
[3]Kolaskar AS ， Kulkarni-Kale U.Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes ofenvelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus.Virology 1999 ； 261 ： 31-42.
[4]Seif SA， Morita K， Matsuo S， Hasebe F and Igarashi A.Finer mapping of neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system.Vaccine 1995 ； 13 ： 1515-1521.
[5]Takada K， Masaki H， Konishi E， Takahashi M and Kurane I.Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus(JEV)envelope protein recognized by JEV-specific murine CD8+cytotoxic T lymphocytes.Arch Virol 2000 ； 145 ： 523-34.
[6]Kutubuddin M， Kolaskar AS， Galande S， Gore MM， Ghosh SN and Banerjee K.Recognition of helper T cell epitopes in envelope(E)glycoprotein of Japanese encephalitis， west Nile and Dengue viruses.Mol Immunol 1991 ； 28 ： 149-54.
表 2SOE-PCR 引物
2. 重组转移载体 pGEM-K1L-mep 的构建与鉴定
利 用 双 酶 切 位 点 NheI/XhoI 将 pMD18-T-mep 和 MVA 转 移 载 体 pGEM-K1L(CGMCC NO.5340) 酶切， 琼脂糖凝胶鉴定后回收目的片段 mep 和 MVA 转移载体 pGEM-K1L。
将酶切后回收的目的片段 mep 和 MVA 转移载体 pGEM-K1L 按照合适的连接比例 ( 摩 尔数 2 ∶ 1)， 4℃连接过夜， 第二天转化大肠埃希氏 DH5a， 涂氨苄平皿， 第三天挑菌 PCR、 酶切 鉴定， 选取阳性克隆， 测序， 获得重组转移载体 pGEM-K1L-mep， 见图 1。其中 PCR 鉴定引物为
F1-5’ ： ctcgagatgccgaccaccggcgaagcgca(SEQ ID No.20) ；
F1-3’ ： catatgatttttataaaaatttaaaacacctgatgcaccgcacggccgatgctag(SEQ ID No.21)。
3. 重组痘病毒 rMVA-mep 的获得
用六孔板培养原代仓鼠肾细胞 (BHK-21， ATCC CCL-10)， 至细胞密度 70％ -80％ 时， 每孔接 100TCID50 改良安卡拉痘苗病毒 MVA(1987 年 11 月 15 日保藏于 CNCM， 保藏号 1-721)， 37 ℃， 5 ％ CO2， 孵育 2h ； 将重组转移载体 pGEM-K1L-mep 与脂质体的混合物接于每 孔， 37℃， 5％ CO2， 孵育 4h ； 换 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48 小时， 观察细胞病 变， 收毒保存， 命名为 BHK-21-mep， 其中包括重组 rMVA-mep 和未发生重组的野毒 MVA。用 PCR， SDS-PAGE 等来鉴定重组 rMVA-mep。PCR 鉴定引物 ： F1-5’ ： SEQ ID No.20 ； F1-3’ ： SEQ ID No.21。
实施例 2.
1 重组痘病毒粒子的纯化
用六孔板培养兔肾细胞 (RK-13， ATCC CCL-37)， 至细胞密度 70％ -80％时， 每孔 -2 接稀释至 10 浓度的 BHK-21-mep， 37 ℃， 5 ％ CO2， 孵育 2h ； 换 8 ％ DMEM 营养液， 37 ℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察细胞病变 ( 细胞不再成单层， 收缩聚堆成颗粒状 )， 收毒保存， 标记为 RK-13-mep-1。 将在 RK-13 细胞上的第一代纯化病毒 RK-13-mep-1 以 10 倍倍比稀释至 10-2， 将 10-2 稀释度接种于新单层 RK-13 细胞， 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察 细胞病变 ( 细胞不再成单层， 收缩聚堆成颗粒状 )， 收毒保存， 标记为 RK-13-mep-2， 依次稀
释传代至 RK-13-mep-6， 经 PCR 鉴定后确定收集病毒液里不再存在痘苗病毒野毒 MVA， 见图 2B， 此培养液命名为 RK-13-mep。其中 PCR 鉴定引物 ： F2-5’ gaatgcacatacataagtaccggcatc tctagca(SEQ ID No.22)， F2-3’ caccagcgtctacatgacgagcttccgagtt(SEQ ID No.23)。
将 RK-13-mep( 即 RK-13-mep-6) 以 10 倍倍比稀释至 10-2， 将 10-2 稀释度接种于新 单层 BHK-21 细胞， 8％ DMEM 营养液， 37℃， 5％ CO2， 培养 24-48h， 观察细胞病变， 收毒保存， 标记为 BHK-21-mep-1， 依上述方法稀释传代纯化至 BHK-21-mep-6， 经 PCR 鉴定后确定重组 痘病毒中宿主限制性基因 K1l 已缺失， 证明重组痘病毒得到纯化 ( 见图 2C)。其中， PCR 鉴 定引物 ： F3-5’ acataagtaccggcatctctagcacacagc(SEQ ID No.24)， F3-3’ ttcgccggtggtcgg catctcgagagctac(SEQ ID No.25)。将 BHK-21-mep-6 病毒传代扩大培养并长期保存， 即重 组痘病毒 rMVA-mep。该重组痘病毒 rMVA-mep 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.5322， 保藏日期为 2011-10-13。
2 蛋白印记
对重组痘病毒 rMVA-mep 进行超速离心浓缩后， 取适当的样品进行 SDS-PAGE 电泳， 同时设正常的 BHK-21 细胞培养物做空白对照和原核表达系统 pet28-mep 表达目的蛋白 (rMEP) 做阳性对照。 准备滤纸、 滤膜和胶 ： 电泳结束后， 取出凝胶根据加样孔的位置切下凝胶， 把凝胶 转移到一盘去离子水中略为漂洗一下。用刻度尺量好胶的长、 宽， 剪下相同大小的滤纸 6 张， 一张相同大小的硝酸纤维膜 (NC 膜 )， 用软铅笔在滤膜左上角作好标记。把硝酸纤维 素滤膜漂浮于一盘去离子水的水面上， 借毛细作用使之从上往下湿润后， 将之浸没于水中， 浸泡 5min 以上以驱除留于滤膜上的气泡 ； 将滤纸浸泡在转移缓冲液中 (48mmol/L Tris ； 39mmol/L 甘氨酸 ( 电泳级 ) ； 0.037％ SDS ； 20％甲醇 )5min。
在电转仪底部电极上， 放置 3 张用转移缓冲液浸泡过的 3mm 滤纸， 逐张叠放， 精确 对齐， 每铺一张滤纸后， 以玻璃棒均匀用力， 反复碾压纸面， 确保排除夹杂在滤纸间的气泡。 随后铺上 NC 膜， 要保证精确对齐， 而且在 3mm 滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。 将切下的凝胶小心放置在 NC 膜表面， 把凝胶左上角置于硝酸纤维素滤膜的标记角上。在凝 胶表面逐一叠加浸泡过的滤纸， 操作同前。最后合上电转仪盖子。接通电源， 以稳压方式转 印， 15V， 转移 15-20min。
转移结束后， 断开电源， 打开电转仪盖子， 从上到下拆卸转移装置， 逐一掀去各层。 把凝胶转移至盛有染色液的托盘中， 进行染色， 以便检查蛋白质转移是否完全。
封闭 ： 小心取出转移膜并将其转入盛有约 10 ～ 20ml 5％脱脂乳 ( 磷酸盐缓冲液 配制 ) 封闭液的平皿中， 室温下于摇床上温和地振摇 2h。 以 PBTS 缓冲液充分漂洗封闭后的 转移膜， 重复洗 3 次， 每次室温下温和振摇 10min， 每次约 10ml 缓冲液。封闭液 ： 5％ (W/V) 脱脂奶粉， 0.01％防沫剂， 0.02％叠氮钠， 溶于磷酸缓冲液 (PBS)。
与一抗结合 ： 洗涤完毕后， 将转移膜转入一个清洁平皿内。向 9.9ml 5％脱脂乳封 闭液中加入 0.1ml 猪抗 JEV 阳性血清， 混合均匀后， 倒入平皿内， 于室温温和振摇 2h。随后 用 PBS 漂洗 3 次， 每次 10 分钟。
与 HRP-SPA 结合 ： 将转移膜置于一个可封闭不透水的塑料袋内。用 5％脱脂乳封 闭液将 HRP-SPA 按照 1 ∶ 500 稀释， 倒入盛有转移膜的塑料袋中， 尽量排除袋内气泡， 封闭 袋口。将塑料袋放在一个平皿内， 置于 37℃摇床中缓慢振摇并温育 1h。结束后， 取出转移
膜置于一个洁净平皿内， 加入 PBS 缓冲液 20ml， 漂洗 3 次， 每次 10 分钟。
显色 ： 在一个清洁平皿中按照 DAB 显色试剂盒配制显色液 5mL( 现配现用 )， 然后 将洗涤好的硝酸纤维素滤膜放入其中， 轻轻摇动， 一旦条带显色较清楚即用蒸溜水漂洗硝 酸纤维素滤膜以终止反应， 取出后拍照保存备用。
结 果 见 图 3， 图 3 显 示 BHK-21-6 和 BHK-21-1 与 作 为 对 照 的 原 核 表 达 系 统 pet28-mep 表达目的蛋白 (rMEP) 的目的条带大小和浓度一致， 说明重组病毒 MVA-mep 能顺 利表达目的蛋白并且有一定的稳定性。
实施例 3
1 小鼠免疫与攻毒实验
动物分组及免疫剂量 ( 见表 3) ： 4 ～ 6 周龄的 BALB/c 雌性小鼠随机分为 8 组， 每 组 10 只。
表 3 动物分组及免疫剂量
注： 1. 乙脑灭活疫苗购于中牧集团成都生物制品公司。
2.rMEP 蛋白和 EDIII 蛋白的制备 ： 见参考文献 Jian-chao Wei， Yi-zhu Huang， Deng-ke Zhong， Le Kang， Hassan Ishag， Xiang Mao， Rui-bing Cao， Bin Zhou， Pu-yan Chen， *Design and evaluation of a multi-epitope peptide against Japanese encephalitis virus infection in BALB/c mice.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 396(2010)787-792.
免疫程序 ( 见图 4) ： 各组小鼠于第 0 天初免后， 第 14、 28 天各加强免疫一次。每
组小鼠在初免前和初免后的第 14、 28、 42 天采集血样。第二次加强免疫 7 天后 ( 第 35 天 )， 每组处死 2 只小鼠取脾细胞用于细胞因子、 淋巴细胞增殖实验， 剩下的 8 只小鼠用致死量 6 (5×10 PFU) 的 JEV 强毒株 SA14 进行腹腔攻击， 观察 15 天， 记录发病死亡情况 ( 见表 4)。
抗血清的收集保存 ： 采集的血样分别于室温、 4℃各放置 0.5h， 2000rpm 离心 8 分 钟， 收集上清， -20℃保存备用。
统计学分析
采用 SPSS 16.0 统计分析软件对实验结果进行方差分析和 t 检验。数据表示为平 均值 ± 标准差。P ＜ 0.05 认定为差异显著。
2ELISA 检测抗体滴度及抗体亚型
用 ELISA 来分析抗 rMEP 的抗体滴度， 具体操作方法如下 ： 纯化后的 rMEP( 原核表 达系统 pet28-mep) 用包被液稀释后包被 96 孔酶标板， 每孔 100μL， 37℃包被 1 小时后， 4℃ 包被过夜。弃去包被液， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 200μL 封闭液， 37 ℃孵育 1 个小时。 弃去封闭液， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入稀释后的免疫小鼠血清各 100μL， 37℃孵育 1 个 小时。弃去孔内液体， 用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 100μL 的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG(1 ∶ 5000 稀释 )， 37℃孵育 1 个小时。用 PBST 洗板 3 次， 每孔加入 100μL TMB 显色溶 液， 37℃显色 10-30min。每孔加 50μL 2M H2SO4 终止液， 酶标仪读取 450nm 波长吸光度值。 抗体亚型 IgG1 和 IgG2a 的分析方法同上， 除了二抗加的是辣根过氧化物酶标记的 羊抗鼠 IgG1 和 IgG2a 抗体 ( 购自杭州联科生物有限公司 )。
结果判定 ： 以 ODS/ODN ≥ 2.1 的最高血清稀释倍数为 ELISA 抗体的终点滴度。
结果分析 ： 从图 5 可以看出， 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml) 在首免后第 14、 28、 42 天产生的抗体滴度与灭活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组几乎一致。其次是重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 107TCID50， 0.1ml)， 6 第三是重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml)。最低的是 MVA 野毒免疫 组和 PBS 免疫组， 几乎没有抗 rMEP 抗体的产生。
通过对抗体亚型的分析 ( 见图 6 和图 7) 可知， 实验免疫组产生的 IgG1 都比 IgG2a 8 高。重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 在首免后第 14、 28、 42 天产 生的 IgG1 和 IgG2a 与灭活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组几乎一致。相 比较而言， 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 107TCID50， 0.1ml) 次之， 第三是重组痘 6 病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml)。对照组 (MVA 野毒组和 PBS 组 ) 没有 IgG1 和 IgG2a 产生。因此可以说明重组痘病毒 rMVA-mep 可以诱导产生 Th2 型的免疫应答， 并且当重组痘病毒达到一定的含量时可以引起与灭活苗等有效疫苗相同的免疫效应。
3 噬斑减少中和试验
将第 35 天收集的各免疫组小鼠血清分别等体积混合 ( 注释 ： 每个免疫组取 5 只小 鼠采血清， 5 管血清分别取等体积混合成为 1 管 )， 56℃灭活 30 分钟。然后与 100PFU 的乙 型脑炎强毒株 SA14 病毒 ( 购于中牧集团成都生物制品公司 ) 等体积混合， 37℃水浴作用 60 分钟。将病毒 -- 抗体混合物接种到长满单层 BHK-21 细胞的 24 孔板中， 每个稀释度各接种 4 孔， 每孔 200μL。37℃培养 1h 且每 15min 轻摇一次。1h 后弃残液， 每孔加入含终浓度为 1％甲基纤维素营养覆盖物 1ml， 于 37℃培养箱中培养 5d。取出 24 孔板， 吸出覆盖物， 每孔 加入 2ml 结晶紫染色液， 0.5h 后弃去染色液， 流水冲洗至可见噬斑。统计每孔噬斑数， 计算
每个稀释度的噬斑减少率， 以无抗体作用、 等量单纯病毒所致空斑数为标准， 能使噬斑减少 50％的最大血清稀释倍数为中和抗体滴度。
采用噬斑减少中和试验检测第二次加强免疫两周后 ( 第 42 天 ) 血清中中和抗体 的滴度。从表 4 可以看出， 有四个免疫组中和抗体滴度水平基本一致， 其中灭活苗免疫组 产生的中和抗体滴度最高， 达到 58±2.01。其次是 rMEP 蛋白免疫组， 中和抗体滴度达到 57±1.99。然后是 EDIII 蛋白免疫组和重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml)， 中和抗体滴度分别为 56±1.99 和 56±1.01。而重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免 疫剂量 107TCID50， 0.1ml) 和重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 106TCID50， 0.1ml) 的中 和抗体滴度依次降低。MVA 野毒组和 PBS 免疫组几乎没有中和抗体的产生。
表 4 中和抗体滴度水平和免疫保护水平
4 细胞因子检测
用制备好的各免疫组小鼠脾细胞悬液铺板， 每孔 100μL(5×105 细胞 /ml) 接种至 96 孔细胞培养板， 同时加入终浓度为 10μg/mL 的 rMEP 进行刺激， 37℃培养 72h 后收集上 清， 用细胞因子检测试剂盒来检测上清中 IL-4 和 IFN-γ 的含量， 操作方法按照说明书进 行。细胞因子 (IL-4 和 IFN-γ) 检测试剂盒为上海晶美生物公司产品。
结果如图 8 显示， 所有试验免疫组产生的 IL-4 水平都低于 IFN-γ 的水平。重组 痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml) 产生的 IL-4 和 IFN-γ 的水平与灭 活苗免疫组、 EDIII 蛋白免疫组和 rMEP 蛋白免疫组基本一致。MVA 野毒组及 PBS 免疫组 几乎没有 IL-4 和 IFN-γ 的产生。由于重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组产生的 Th1 型的细胞 因子 (IFN-γ) 水平高于其所产生的 Th2 型的细胞因子 (IL-4)， 因此可以说明重组痘病毒 rMVA-mep 又可以诱导产生 Th1 型的免疫应答。
5 淋巴细胞增殖分析
5.1 免疫小鼠脾脏单个淋巴细胞悬液的制备
(1) 打开超净工作台紫外灯照射 30min， 取 2 只三免一周后小鼠拉颈处死， 放入装 有 75％酒精的烧杯中， 随即放入超净台内。
(2) 用 75％酒精棉消毒小鼠腹部， 无菌手术开腹腔取出脾脏， 去除脂肪和结缔组 织， 剪成 5-7 段， 放入 200 目不锈钢网筛， 将网筛置于预先放入 3ml 无血清 RPMI 1640 营养 液的平皿中， 用研磨棒挤压出脾细胞， 尽量挤压干净。
(3) 在 10ml 的刻度离心管中先加入 6ml 淋巴细胞分离液， 将脾细胞悬液沿着管壁 慢慢加入分离液上方， 1500rpm 离心 10min。
(4) 离心后取中间的白膜层， 加入 3-6ml 无血清 RPMI 1640 营养液洗涤 2 次， 1500rpm 离心 10min。最后用 RPMI 1640 培养基 ( 含 10％ FCS， 1-2％双抗 ) 将淋巴细胞重 悬。
(5) 用细胞计数器对淋巴细胞计数后铺板。
5.2 淋巴细胞增殖水平
用制备好的各免疫组小鼠脾细胞悬液铺板， 每孔 100μL(5×105 细胞 /ml) 接种 至 96 孔细胞培养板， 同时加入终浓度为 10μg/mL 的 rMEP 进行刺激， 将细胞板培养 48h， 提前 4h 取出， 加 MTT( 原始浓度 5mg/mL)20LLP/ 孔， 继续培养 4h， 取出后弃上清， 每孔加 100μLDMSO， 使结晶溶解， 在微量震荡器震荡， 测 OD570 值。
从图 9 可以看出， 以原核表达的 rMEP 蛋白作为刺激原， 重组痘病毒 rMVA-mep 免 8 疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 免疫小鼠获得了较强的特异性淋巴细胞增殖， 明显高于 7 重组痘病毒 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 10 TCID50， 0.1ml) 和 rMVA-mep 免疫组 ( 免疫剂量 6 10 TCID50， 0.1ml)， 但与灭活苗、 EDIII 蛋白和 rMEP 蛋白免疫组的细胞增殖水平基本一致， 统计学分析结果显示， 这四组免疫组所引发的 T 细胞增殖反应强度差异不明显 (P ＞ 0.05)。 MVA 野毒组和 PBS 免疫组没有淋巴细胞增殖反应。 此结果表明， 采用改良型痘苗病毒安卡拉 株 MVA 构建的重组痘病毒 rMVA-mep 免疫小鼠后能够诱发较强的淋巴细胞增殖。
6 对致死量的 JEV 的保护力
首免六周后用致死量 (5×106PFU) 的 JEV 强毒株 SA14 对各免疫组小鼠进行腹腔 攻击。结果如表 4 所示 ： 重组痘病毒 rMVA-mep( 免疫剂量 108TCID50， 0.1ml)、 rMEP、 EDIII 和灭活苗免疫组对小鼠的保护率最高， 达到了 100 ％。重组痘病毒 rMVA-mep( 免疫剂量 7 10 TCID50， 0.1ml) 免疫组对小鼠的保护率次之， 达到 85％； 重组痘病毒 rMVA-mep( 免疫剂量 6 10 TCID50， 0.1ml) 免疫组的保护率最差， 只有 60％。而 MVA 野毒免疫组和 PBS 免疫组对小 鼠没有保护作用， 结果见表 4。14102392048 A CN 102392056
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