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1、(10)申请公布号 CN 103570652 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103570652 A (21)申请号 201210281442.9 (22)申请日 2012.08.09 C07D 307/77(2006.01) C12P 17/04(2006.01) A61K 31/343(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 山东国际生物科技园发展有限公司 地址 264670 山东省烟台市高新区科技大道 39 号 (72)发明人 谢则平 张淑敏 赵明 (54) 发明名称 一种环氧苯并蒽醌类化合物及其。
2、制备方法和 应用 (57) 摘要 本发明属医药技术领域， 具体的说是一种 环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法。具体 结构式 (I) 所示， 其制备方法为将海洋放线 菌 Streptomyces sp. 经 发 酵 积 累 粗 提 物， 利 用硅胶层析等多种层析方法分离得到， 命名为 Kiamycin。本发明化合物对包括白血病细胞株 K-562 和大肠癌细胞株 HCT-116， 宫颈癌细胞株 HELA， 乳腺癌细胞株 MCF-7 等人体肿瘤细胞具有 抑制作用， 为临床提供了新型药物或先导化合物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (1。
3、2)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103570652 A CN 103570652 A 1/1 页 2 1. 一种环氧苯并蒽醌类化合物， 其特征在于 ： 所述环氧苯并蒽醌类化合物的化学结构 如式 (I) 所示。 2. 一种环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法和应用， 其特征在于 ： 所述环氧苯并蒽醌 类化合物按如下步骤制备 ： 1) 固体培养 ： 将菌株划线接种于 M2+固体培养基上， 28-35， 恒温培养 3-4d， 直到长出 白色孢子 ； 2) 摇床培养 ： 接种所述白色孢子丝于 M2+液体培养基， 28-35， 以 90-150r/min 转速， 摇床。
4、培养 4-6d， 收集发酵液 ； 3) 粗提物制备 ： 发酵液经过滤后分别获得菌丝体和菌液， 菌丝体乙酸乙酯提取 3 次， 菌 液经大孔吸附树脂吸附， 甲醇洗脱， 收集洗脱液， 浓缩后直接用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并以 上乙酸乙酯提取液， 浓缩蒸干， 得到膏状粗提物 ； 4) 分离纯化 ： 粗提物经硅胶柱层析， 用二氯甲烷洗脱， 得到的组分经反相硅胶柱层析， 用甲醇 / 水 (60 40， 体积比例 ) 洗脱， 得到的组分进一步利用制备型薄层层析， 以二氯甲 烷 / 甲醇 (98 2) 为展开剂， 于 Rf 0.4 得到白色粉末状 Kiamycin。 3. 按权利要求 2 所述的环氧苯并蒽醌。
5、类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 所述 M2+固体 培养基为 ： 麦芽浸粉10g， 酵母浸粉4g， 葡萄糖4g， 海水500mL， 去离子水500mL， 琼脂18g， 调 整培养基 pH7.8。 4. 按权利要求 2 所述的环氧苯并蒽醌类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 所述 M2+液体 培养基为 ： 麦芽浸粉 10g， 酵母浸粉 4g， 葡萄糖 4g， 海水 500mL， 去离子水 500mL， ， 调整培养 基 pH7.8。 5. 按权利要求 2 所述的环氧苯并蒽醌类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 所述的大孔 吸附树脂为 Amberblite XAD16 聚苯乙烯型大孔吸附树脂。。
6、 6. 权利要求 1 所述的化合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103570652 A 2 1/5 页 3 一种环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属医药技术领域， 具体的说是一种环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法。 背景技术 0002 放线菌是一类最重要的药源微生物。 100年来， 放线菌资源的研究和开发利用取得 了极其辉煌的成就。从放线菌发现的生物活性物质大约有 12000 种， 占整个天然生物活性 物质的 50左右， 其中从链霉菌一个属就发现近万种。目前临床和农业上使用的 150 多种 抗生素中， 有100至120种是由放线菌产生的。
7、。 (文献1 ： Jnos Brdy.Bioactive microbial metabolites， a personal review.J Antibiot， 2005， 58(1) ： 1-26.) 0003 随着陆地放线菌研究的不断深入， 目前在陆地上发现新的放线菌资源以及新颖的 活性先导化合物的几率越来越小。 海洋生态环境的特殊性造就了巨大的生物多样性和独特 的化学多样性， 由此而形成的次生代谢产物复杂独特的结构及其特异高效的活性， 使得海 洋生物资源已成为创新药物发现的重要源泉， 海洋已经成为发现新种甚至新属微生物的重 要场所， 并且是新颖生物活性物质的新来源。美国哥伦比亚大学斯克。
8、里普斯海洋研究所海 洋生物技术与生物药物研究中心的 Fenicial 等 2005 年报道了第一株专性海洋放线菌， 为 一个新属 Salinispora 属。同时， 对 100 多株 Salinispora 属的放线菌进行了生物活性评 估， 发现 80具有抑制人体肿瘤细胞的生长的作用， 35对人类病原体耐药菌具有抑制作 用。并成功的从 S.tropica CNB-392 的发酵液中分离到了一个新颖结构的潜在的抗肿瘤药 物 salinisporamide A。salinisporamide A 与蛋白酶抑制剂 omuralide 结构相似， 但是抑 制 20S 蛋白酶的活性是后者的 35 倍 (。
9、IC50 1.3nM)， 目前已经作为抗多发性骨髓瘤药物进 入I期临床阶段(文献2 ： Fenical， W.&Jensen， P.R.Developing a new resource for drug discovery ： marine actinomycete bacteria.Nat.Chem.Biol.2006(2) ： 666-673.)。因此， 海洋放线菌是新颖的活性先导化合物的新的重要来源。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种海洋放线菌来源的环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方 法和应用。 0005 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 0006 一种环氧苯并蒽醌类。
10、化合物及其制备方法和应用， 其特征在于 ： 所述环氧苯并蒽 醌类化合物的化学结构如式 (I) 所示。 0007 说 明 书 CN 103570652 A 3 2/5 页 4 0008 一种环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法和应用， 其特征在于 ： 所述环氧苯并蒽 醌类化合物可制备抗肿瘤药物。 0009 一种环氧苯并蒽醌类化合物及其制备方法和应用， 其特征在于 ： 所述环氧苯并蒽 醌类化合物按如下步骤制备 ： 0010 1)固体培养 ： 将菌株划线接种于M2+固体培养基上， 28-35， 恒温培养3-4d， 直到 长出白色孢子 ； 0011 2) 摇床培养 ： 接种所述白色孢子丝于 M2+ 液体培。
11、养基， 28-35， 以 90-150r/min 转速摇床培养 4-6d， 收集发酵液 ； 0012 3) 粗提物制备 ： 发酵液经过滤后分别获得菌丝体和菌液， 菌丝体乙酸乙酯提取 3 次， 菌液经大孔吸附树脂吸附， 甲醇洗脱， 收集洗脱液， 浓缩后直接用乙酸乙酯萃取 3 次， 合 并以上乙酸乙酯提取液， 浓缩蒸干， 得到膏状粗提物 ； 0013 4) 分离纯化 ： 粗提物经硅胶柱层析， 用二氯甲烷洗脱， 得到的组分经反相硅胶柱 层析， 用甲醇/水(6040， 体积比例)洗脱， 得到的组分进一步利用制备型薄层层析， 以二 氯甲烷 / 甲醇 (98 2) 为展开剂， 于 Rf 0.4 得到白色粉。
12、末状 Kiamycin。 0014 步骤1)中的M2+固体培养基为 ： 麦芽浸粉10g， 酵母浸粉4g， 葡萄糖4g， 海水500mL， 去离子水 500mL， 琼脂 18g， 调整培养基 pH7.8。 0015 步骤2)中的M2+液体培养基为 ： 麦芽浸粉10g， 酵母浸粉4g， 葡萄糖4g， 海水500mL， 去离子水 500mL， ， 调整培养基 pH7.8。 0016 步骤 3) 中的大孔吸附树脂为 Amberblite XAD16 聚苯乙烯型大孔吸附树脂。 0017 本发明具有以下优点 ： 0018 1. 本发明充分利用尚未深入开发的丰富的海洋放线菌资源， 本发明化合物是第一 个海洋。
13、来源的环氧苯并蒽醌类化合物。 0019 2. 本发明化合物具有很强的抗肿瘤活性， 在 10 微克 / 毫升时， 对白血病细胞株 K-562 和大肠癌细胞株 HCT-116， 宫颈癌细胞株 HELA， 乳腺癌细胞株 MCF-7 的抑制率均在 80以上， 为临床提供了新型药物或先导化合物。 具体实施方式 0020 实施例一 0021 制备环氧苯并蒽醌类化合物 Kiamycin ： 0022 (1) 样品采集 ： 从青岛胶州湾采集海泥样品， 在实验室利用高氏一号培养基， 通过 梯度稀释培养法纯化到一株海洋放线菌 Streptomyces sp.。 说 明 书 CN 103570652 A 4 3/5。
14、 页 5 0023 其中， 高氏一号培养基 ： 可溶性淀粉 2.0g， MgSO47H2O 0.05g， K2HPO4 0.05g， KNO3 0.1g， FeSO47H2O 0.001g， 琼脂粉 18g， 海水 500ml， 去离子水 500ml， 调整 pH7.8。 0024 (2) 固体培养 ： 将菌株划线接种于 M2+固体培养基上， 28， 恒温培养 3d， 直到长出 白色孢子 ； 0025 (3) 摇床培养 ： 在 1000mL 的三角瓶中加入 200mL M2+液体培养基， 灭菌。无菌条件 下， 取 8-10mm2大小的菌苔 2 块接入 100 个装有 M2+液体培养基三角瓶中，。
15、 共计 20L， 28， 以 120r/min 转速， 摇床培养 6d， 收集发酵液 ； 0026 (4) 粗提物制备 ： 发酵液经过滤后分别获得菌丝体和菌液， 菌丝体分别用 2L 乙酸 乙酯提取 3 次， 菌液经过装有 10 千克 Amberblite XAD16 聚苯乙烯型大孔吸附树脂的层析 柱， 流速为2L/h， 先用20L去离子水冲洗， 去除糖和蛋白， 再用10L甲醇洗脱， 收集洗脱液， 浓 缩后得到甲醇浸膏， 甲醇浸膏加1L水悬浮后， 用等体积的乙酸乙酯萃取3次， 合并以上乙酸 乙酯提取液， 浓缩蒸干， 得到 5g 膏状粗提物 ； 0027 (5) 分离纯化 ： 粗提物经硅胶柱层析，。
16、 用二氯甲烷与甲醇梯度 (100/0-50/50) 洗脱， 收集纯二氯甲烷洗脱的组分 (260mg)， 经反相硅胶柱层析， 用甲醇 / 水梯度 (20/80-100/0) 洗脱， 收集甲醇 / 水 (60/40) 的组分 (20mg)， 利用制备型薄层层析， 以二氯 甲烷 / 甲醇 (98 2) 为展开剂， 于 Rf 0.4 得到白色粉末状 Kiamycin(6.3mg)， 化学结构 式如下 ： 0028 0029 化合物 Kiamycin 的物理常数及核磁共振数据 ： 0030 白色粉末状固体， ( c 0.01， MeOH).HRESIMS ： m/z 345.1103 M+Na+， 分子。
17、式为 C20H18O4。 0031 表 1 Kiamycin 的 1H，13C， COSY 和 HMBC NMR 数据 (CDCl 3) 0032 说 明 书 CN 103570652 A 5 4/5 页 6 0033 实施例二 0034 Kiamycin 的抗肿瘤活性实验 ： 0035 四氮唑盐 (Methyl-Thiazol-Tetrozolium， MTT) 还原法 ： 0036 分别取生长良好的白血病细胞株 K-562 和大肠癌细胞株 HCT-116， 经胰酶消化后 10牛血清 1640 悬浮 200L， 调细胞数为 2105mL-1， 加至 96 孔平底细胞培养板， 0.1ml/ 孔。
18、， 37， 5 CO2温育 24h 细胞长成单层， 将化合物制备成浓度为 10mg/mL 的溶液加入细胞 孔中， 设 4 孔， 37， 5 CO2作用 72h。加 MTT20L(5mg/mL IPMI-1640 培养基溶液 )， 继续 培养 4h， 离心， 甩去上清， 加溶解液 DMSO150L， 振荡 5-10min， 待结晶完全溶解， 离心， 待结 晶完全溶解， 酶标仪测 540nm 处的 OD 值。磺酰罗丹明 B(sulforhodamine B， SRB) 蛋白染色 法 分别取生长良好的宫颈癌细胞株 HELA 和乳腺癌细胞株 MCF-7， 经胰酶消化后 10牛血 清1640悬浮200L。
19、， 调细胞数为2105mL-1， 加至96孔平底细胞培养板， 0.1mL/孔， 将化合 说 明 书 CN 103570652 A 6 5/5 页 7 物制备成浓度为 10mg/mL 的溶液加入细胞孔中， 设 4 孔， 37， 5 CO2作用 72h。经过药物 暴漏后， 细胞用 12的三氯乙酸固定， 并用磺酰罗丹明 B 染色， 然后用酶标仪测 515nm 处的 OD 值。抑制率计算公式如下 ： 0037 Inhibition ratio (1-Asample/blank)100 0038 Asample： the absorbance of the sample at 540/515 ； 0039 Ablank： the absorbance of the blank at 540/515. 0040 实验结果 ： 专利化合物在 10mg/mL 的浓度下， 对白血病细胞株 K-562 和大肠癌细 胞株 HCT-116， 宫颈癌细胞株 HELA， 乳腺癌细胞株 MCF-7 的抑制率分别为 ： 85.2， 82.4， 81.3和 80.1。 说 明 书 CN 103570652 A 7 。