色谱双层颗粒 【技术领域】
本发明涉及一种用作色谱基质的多孔聚合物颗粒的生产方法，该颗粒包含具有不同性质的两层。本发明还涉及上述颗粒以及使用了上述颗粒的色谱方法。
背景技术
术语色谱法包含了一系列密切相关的分离方法。上述方法均是基于将互不混溶的两相接触的特征，其中一相是固定的而另一相是流动的。色谱法可用于从污染化合物中纯化液体或者从液体中回收一种或多种产物。
近年来，其中色谱法引起巨大兴趣的一个领域是生物技术领域，例如用于新药大规模且经济的生产和诊断。而且，近年来蛋白质的纯化变得越加重要，这是由于蛋白质组学领域地开发，其中研究了由人类基因组表达的蛋白质的功能。一般地，蛋白质是通过细胞培养生产的，其要么在细胞内要么被分泌到周围介质中。因为所用的细胞系是活的机体，所以必须向它们供给包含糖类、氨基酸、生长因子等的复杂的生长介质。要从供给细胞的化合物混合物中和从细胞自身的副产物中分离所需的蛋白质使其达到足够的纯度，例如用作人类的治疗剂，这给人们提出了一个艰巨的挑战。
通常，细胞和/或细胞碎片已经通过过滤去除。一旦已经获得含有所需蛋白质的澄清溶液，通常利用不同色谱技术的组合进行该蛋白质与该溶液的其它组分的分离。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、亲和性、大小等来分离蛋白质混合物。对于这些技术的每一种，可获得多种不同的色谱基质，从而允许针对所涉及的特定蛋白质来设计纯化方案。
为了减少从细胞培养物或裂解物中获得产物所需步骤的数目，已经提出了改进的色谱技术。例如，在已知的膨胀床色谱技术中已经进行了避免去除细胞和/或细胞碎片步骤的尝试。膨胀床色谱是非填充床技术，其中基质优选呈颗粒形状，通过供应向上流动的流体使得基质呈流化或膨胀状态。随后将包含待分离化合物的溶液引入该流体中。(对于膨胀床色谱的举例说明性用途，参见例如国际专利申请WO98/33572(Amersham Pharmacia Biotech AB))。实验结果显示，在上述膨胀床中，原则上允许细胞通过该床，同时所需的化合物被吸附到该颗粒适当的配体上。但是，在离子色谱中会出现问题，在这种情况下细胞表面和基质的结合基团带有相反的电荷。随后产生聚集，这可以导致膨胀床的塌陷以及诱导蛋白质产量的减少。
用于分离蛋白质和相似化合物的改进的可利用方法的另一种选择是通过改善基质材料的方法。为此，已经建议了具有一种以上官能团及由此可以选择性地吸附一种以上化合物的基质。
因此，美国专利第5,522,994号公开了一种从样品中分离两种不同大小分子的方法，其中使用的分离介质具有至少两种不同类型的官能团。这种介质可以通过用大小改性剂处理孔中具有反应性基团的多孔材料而制得，该大小改性剂仅渗入该多孔材料的某些孔中。从而，该改性剂将仅仅化学改性渗入孔中的反应性基团。
为了提供具有不同性质的分离介质，WO 98/39094公开了位阻效应的另一种用途。在该种情况下，多孔基质的表面覆盖有聚合物，该聚合物所具有的分子量足以使其不能渗入基质的微孔体系。优选地，孔中的基质本身为用葡聚糖衍生的琼脂糖并且任选地被官能化。覆盖表面的聚合物的例子还可以是具有更大分子量的葡聚糖、纤维素等。在一些情况下，覆盖表面的聚合物在附着于基质上之前已经被官能化。因而，聚合物表层的目的是为了在空间上阻止大于某一大小的化合物穿过内部的微孔。通过提供所具有的官能团不同于微孔体系中存在的官能团的聚合物，可以建立一种体系，其中吸入微孔中的较小化合物避免了被吸附在表面上的聚合物上。所公开的基质可用于分离核酸、蛋白质和其它有机的和无机的化合物。
WO 98/39364描述了一种在多孔的基质层上引入第二种官能团的方法。该方法的实现是通过将所述基质与一种试剂接触，该试剂以比其扩散入所述基质更高的反应速率与基质表面上的配体反应。反应性通常受溶剂、pH等的影响，并且向基质的扩散作用取决于基质和试剂的化学性质。因此，该方法得到了一种基质，其中原始的配体仍然存在于内孔体系中，而加入的试剂则在外层上提供了另一种官能团。从而，外层的厚度将取决于加入的试剂的数量。优选的基质是琼脂糖，并且该试剂可以是根据常规方法的溴。
发明概述
本发明的一个目的是提供生产用于色谱基质的颗粒的选择性的方法，其中该颗粒包含具有不同性质的明确的两层。该方法可以利用一种两相体系来实施，其中仅在其中一相中反应的试剂被用于改性该色谱基质的外层。
本发明的另一个目的是提供一种生产包括两层的色谱颗粒的方法，该方法避免了将涂敷聚合物施加到该颗粒表面的需要。这可以通过一种方法实现，即其中两层均由一种相同的材料制备并且利用两相体系，该两相体系在化学改性内孔体系期间保护外层或者在化学改性外层期间保护内孔体系。
本发明的再一个目的是提供一种生产包括具有不同性质的两层的色谱颗粒的方法，所述层由一种相同的材料制备，并且不需要添加临界量的试剂和不需要确定该试剂的扩散和反应速率。这可以通过一种方法实现，即其中该颗粒的外层通过与一种试剂反应而被保护，该试剂在该颗粒的内相不具有化学反应活性。因而，可以在不影响保护的表面外层的情况下，进行官能团与内层的连接。
本发明的另一个目的是提供适于用作色谱基质的颗粒，该颗粒易于制备并且在吸附过程中，该颗粒能选择性地吸附一种需要的化合物到结合基团上，从而在空间上阻止了与大分子如细胞或细胞碎片的接触。这可以通过提供包含具有不同性质的两层的颗粒而实现，其中整个颗粒由一种材料构成并且在外层存在非官能化的表面。本发明的具体目的是提供如上所述的颗粒，在色谱吸附过程中该颗粒能排斥大分子。这可以通过包括明确的两层颗粒来实现，其中该颗粒的外层已经被改性并且具有能化学排斥大分子的基团，例如带负电荷的基团。
本发明的再一个目的是提供一种膨胀床吸附(EBA)方法，其中减少或甚至消除了细胞和细胞碎片的聚集作用。这可以通过利用本发明的颗粒而实现，该颗粒的外层上具有带负电荷的基团，从而可排斥细胞、细胞碎片和核酸。
本发明的上述以及其它目的在所附的权利要求书中会获得更加具体的限定。通过下面详细的描述将清楚地说明本发明进一步的实施方式和优点。
附图简介
图1是根据本发明的两相体系的示意图，该两相体系用于氧化颗粒表面上的烯丙基。
图2是颗粒的示意图，该颗粒具有中性的，即非官能的外层和由本发明方法制备的配体-官能化的内部或内层。
发明详述
本发明的第一方面是一种色谱分离基质的生产方法，其中在两相体系中制备包含具有不同性质的两层的多孔聚合物颗粒，包括：
(a)提供至少一种多孔聚合物颗粒，在该颗粒的孔表面和外表面上存在反应性基团；
(b)用第一种溶剂洗涤所述的颗粒并沥干颗粒，从而密封第一相；
(c)通过加入基本上不溶于第一种溶剂的第二种溶剂来润湿密封的颗粒外层，获得在外层中的第二相；
(d)通过加入一种基本上在第一种溶剂中是非反应活性的试剂，使外层上的反应性基团反应；和
(e)使色谱结合基团偶联到内层的反应性基团上。
在本文中，在步骤(b)密封的颗粒部分被命名为该颗粒的“内层”，而“外层”是指该颗粒的剩余部分。当在本文中讨论到外层表面时，应当理解为包括了外表面以及其孔体系的表面。
在优选的实施方案中，反应性基团是碳-碳双键，例如烯丙基、乙烯基等，在该种情况下，所述试剂可以是氧化剂。但是，可以设想的其它反应性基团是羟基、氨基、羧基、巯基等。
实施步骤(b)中的沥干是为了除去足够量的第一种溶剂，使得第二种溶剂可润湿该颗粒。如果需要，可以重复进行步骤(c)的润湿。步骤(d)的反应产生了一个外层，该外层的表面可不带电荷或带电荷，这将在下面进行更详细的讨论。在优选的实施方案中，本发明方法还包括在步骤(d)之后洗涤颗粒的步骤，从而产生一个可在其中进行结合基团的常规连接的相。在本文中，应理解的是第一种和第二种溶剂应充分地不相互溶解，以阻止步骤(d)中使用的试剂在未加入该试剂的相中反应。
在一个有利的实施方案中，该颗粒由包含侧链羟基(-OH)的聚合物如琼脂糖制成。根据众所周知的方法，本领域熟练技术人员可容易地制备出多孔的且化学交联的琼脂糖颗粒。但是，另选地，可使用其它的材料，例如二氧化硅、苯乙烯、二乙烯基苯等。正如本领域熟练技术人员将认识到的，如果使用了合成聚合物如上述最后提到的两种，则会需要使颗粒表面具有亲水性的步骤，例如通过常规方法添加OH-基。
另外，使用商业产品，例如StreamlineTM A 300或SepharoseTM6FF(它们均来自阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)作为起始原料。
天然聚合物如琼脂糖的烯丙基化在本领域中是众所周知的，并且可由本领域熟练技术人员容易地实施。在本发明方法的有利实施方案中，通过使羟基与烯丙基缩水甘油醚(AGE)反应而获得烯丙基化。该实施方案将在下面的实验部分介绍。
在一个实施方案中，所述试剂在水相中是反应性的。该实施方案中的一种有利的试剂是氧化剂高锰酸钾(KMnO4)，但是另选地，可使用其它的氧化剂，例如氢化硼、氧化铬、四氧化锇、氧化硒。
在另选的实施方案中，所述试剂在有机相中是反应性的。本领域熟练技术人员可选择一种适合的试剂，例如上述提到的，但这需要对该溶液进行改性。例如，可以通过KMnO4的钾离子与冠醚络合或用季铵或磷鎓离子替代该钾离子，在非极性溶剂例如苯和二氯甲烷中通过KMnO4进行相转移辅助的烯丙基的氧化反应。
在一个实施方案中，在步骤(b)中密封的第一种溶剂是有机溶剂。该有机溶剂可以是甲苯、己烷、二氯甲烷或任何其它公知的不溶于或基本上不溶于水相的有机溶剂。在该实施方案中，优选地，用醇例如乙醇洗涤烯丙基化的颗粒，然后沥干，例如在玻璃过滤器上沥干。由此，在该实施方案中，通过将该颗粒加入含水溶液中来实施步骤(c)的润湿。
在另选的实施方案中，在步骤(b)中密封的第一种溶剂是含水溶剂，例如水溶液。由此，在该实施方案中，通过将该颗粒加入如上举例的有机溶剂中来实施步骤(c)的润湿。
在优选的实施方案中，水相包含乳化剂，例如DextranTM T500(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)。正如本领域熟练技术人员将认识到的，该乳化剂的作用是从外层中除去甲苯。由此，本领域熟练技术人员将认识到，对于每种情况应小心地决定乳化剂的量，这是由于除去的甲苯以及乳化剂的量会间接地决定外层的厚度。在最优选的实施方案中，乳化剂在水中的浓度为约10％。
在具体的实施方案中，最多原始存在于该颗粒中的反应性基团总数的约30％在步骤(d)中进行了反应。在优选的实施方案中，反应性基团的3-20％如4-10％进行了反应。该外层可以被认为是一种罩子，它围绕着具有常规组成的色谱颗粒，因此“罩珠(lid beads)”这一名称有时用来表示这类颗粒。通常，对于大小约160μm的颗粒，第二层，即由本发明方法制得的该罩子大约有3μm。
根据任何适合的熟知的技术，可容易地完成步骤(e)-使色谱结合基团偶联到存在于该颗粒内层上的反应性基团上。如上所述，如果第一种溶剂是有机溶剂，则在步骤(e)之前，要洗涤该颗粒，例如用含水乙醇和水的溶液洗涤，从而为偶联提供一个含水的环境。
通常要进行活化，即引入官能化所必需的其它反应性基团。常见的活化试剂可选自亲电试剂、亲核试剂和经自由基化学活化的试剂。(参见例如WO 98/39364，对各种可利用的活化体系的更详细的综述。)在反应性基团是烯丙基的实施方案中，根据步骤(e)的偶联可以通过自由基活化来进行。在一个有利的实施方案中，所述活化使用溴进行，这将在下面的实验部分示例说明。
偶联在活化的内孔体系表面上的结合基团可以是色谱中常规用作配体的任何公知的基团，例如亲和基团、疏水性相互作用基团、离子交换基团如带负电荷的阳离子交换基团或带正电荷的阴离子交换基团等。因而，在本文中，术语“结合”是指任何一种吸附或偶联。由此，在本发明方法的一个实施方案中，该结合基团是离子交换基团。在具体的实施方案中，该阴离子交换剂是二乙胺(ANX)或乙二胺(EDA)，如下面的实验部分中的示例说明。
如上所述，步骤(d)中的反应产生了一个外层，该外层存在一个可不带电荷或带电荷的表面。本领域熟练技术人员将容易地选择合适的起始原料和试剂，以在该表面上提供所需的性质。例如，如果反应性基团是烯丙基，那么可在该外层的表面提供羧基(-COOH)和/或羟基(-OH)。众所周知，存在许多将结合基团偶联于OH基上的常规方法。包含COOH基的表面将带有弱负电荷。另外，如果需要进一步改性表面的话，则结合基团还可以与COOH基连接。
因而，本发明的另一方面是一种生产二官能的或双官能的色谱分离基质的方法，该方法是如上所定义的方法加上改性外层上的基团和/或将色谱结合基团偶联在外层上的另一步骤。在最有利的实施方案中，外层上的基团具有与色谱方法中不希望的化合物相同的电荷，例如带负电荷的基团，从而在从细胞裂解物中分离蛋白质的方法中排斥细胞和细胞碎片。
本发明的第二方面是一种适合用作色谱分离基质的多孔聚合物颗粒，该颗粒包含具有不同性质的两层，其中整个颗粒是由一种材料制成的。在具体的实施方案中，该颗粒存在一个中性的、即不带电荷或非官能的外层。由此，该实施方案不同于上述讨论的WO 98/39094中描述的颗粒，这是由于本发明的颗粒不存在不同于该颗粒材料的聚合物涂层。由于在上述讨论的WO 98/39364中描述的方法得到的颗粒的表面不是中性的，所以本发明的颗粒也不同于从上述WO 98/39364中的方法得到的颗粒。
在优选的实施方案中，本发明的颗粒是根据上述方法生产的。
本发明的第三方面是将所需化合物与溶液中的其它组分分离的方法，这是一种色谱分离方法，其中使用了根据本发明生产的基质或包含本发明颗粒的基质。
在一个有利的实施方案中，所述方法是膨胀床吸附法(EBA)。在本文中，应理解的是该方法可以另选地是另一种非填充床，例如搅拌的悬浮液，它基于与膨胀床吸附法相似的原理。
在最有利的实施方案中，所需的化合物是蛋白质并且所述的溶液是细胞裂解液。在该实施方案中，外层或罩子会阻止细胞吸附到该颗粒上。
在本发明方法的具体实施方案中，基质是阴离子交换剂。由于需要将阳离子交换剂的带负电荷的结合基团与带负电荷的细胞和细胞碎片隔离，这一实施方案变得尤其有利。
本发明的最后一个方面是由本发明方法生产的基质或包含上述颗粒的基质在膨胀床吸附法中的用途。
附图的详细描述
图1是根据本发明的两相体系的示意图，该两相体系用于氧化颗粒表面上的烯丙基。更具体地，具有包含甲苯的第一内相和被氧化的表面的烯丙基化的颗粒显示于包含DextranTM T500(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)、KMnO4、NaOH和H2O2的水相中。
图2是颗粒的示意图，该颗粒具有中性的，即非官能的外表面和由本发明方法制备的配体-官能化的内部或内层。外层包含-COOH和/或-OH基，而内层可包含任何配体，例如乙二胺(EDA)、二乙胺(ANX)等。
实验部分
下面将通过实施例的方式描述本发明。但是，仅是出于说明的目的提供了本发明的实施例，它们不应被理解为限定了由所附的权利要求书限定的本发明。下面以及本说明书的其它部分给出的所有参考文献均包括在本文中作为参考。
实施例1：用烯丙基缩水甘油醚(AGE)烯丙基化StreamlineTM A 300的通用程序
在常规的合成中，将NaOH(50％)(200g)水溶液、NaBH4(0.2g)和Na2SO4(8g)加入装备有机械搅拌器的1L三颈圆底烧瓶中。将StreamlineTM A 300凝胶(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)(200g)用蒸馏水洗涤并在玻璃过滤器上沥干。随后在搅拌下将该胶珠加入三颈圆底烧瓶中；将反应混合物加热到50℃，并在该温度下连续搅拌1小时。然后将烯丙基缩水甘油醚(AGE)(300mL)加入到该反应混合物中，并在50℃下连续搅拌18小时。然后将反应混合物冷却到室温并通过加入浓醋酸使pH达到6-7。然后在玻璃过滤器上过滤该凝胶，并依次用蒸馏水(5*200mL)、EtOH(99.5％)(5*200mL)以及最后用蒸馏水(5*200mL)洗涤凝胶。通过首先将1mL烯丙基化的胶珠与溴反应，然后用硝酸银滴定所得的胶珠来测定烯丙基的含量。一般地，烯丙基的含量在200μmol/mL凝胶至250μmol/mL凝胶的范围内。
实施例2：实施例1中制备的胶珠的部分氧化的通用程序
在玻璃过滤器上，首先用EtOH(99.5％)(4*50mL)洗涤烯丙基化的StreamlineTM A 300(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)(50mL)，然后用甲苯(99％)(4*50mL)洗涤。在最后用甲苯洗涤后，将胶珠部分沥干。将蒸馏水(100mL)和Dextran T500(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)溶液(10％，水中，100mL)加入1L三颈圆底烧瓶中。机械搅拌该溶液。将部分沥干的凝胶加入到该烧瓶中，并向该烧瓶中加入蒸馏水(50mL)和Dextran T500溶液(10％，水中，50mL)。得到颗粒在溶液中的均匀悬浮液，并且连续搅拌15分钟。在连续搅拌下将高锰酸钾(KMnO4)(0.81g，5.12mmol，初始烯丙基的0.5倍当量)加入该烧瓶中。反应混合物变成紫色并且使反应进行15分钟。然后将NaOH(50％，水中，20mL)加入该烧瓶中，并且该反应混合物同时变为棕色，这提示形成了高锰酸盐二氧化物聚集体。在室温下反应1小时。然后将浓醋酸(大约10mL)加入混合物中直至pH值等于5。将H2O2水溶液(30％，水中)(2mL)小心地加入该混合物中，混合物变为灰白色。然后在玻璃过滤器上过滤该凝胶，并用蒸馏水(5*50mL)、EtOH(99.5％)(5*50mL)以及最后用蒸馏水(5*50mL)洗涤凝胶。根据实施例1中描述的方法测定烯丙基的含量。一般地，与初始的烯丙基含量相比，烯丙基的含量下降了5-20％(表1)。
实施例3：实施例2中制备的胶珠的溴化的通用程序
部分氧化的StreamlineTM A 300(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)的残余烯丙基的溴化进行如下。在装备有机械搅拌器的250mL三颈圆底烧瓶中，将醋酸钠(0.1g)溶于蒸馏水(10mL)中。然后将部分氧化的凝胶(40mL，沥干的)和蒸馏水(40mL)加入该烧瓶中，在室温下快速搅拌该混合物15分钟。然后将溴逐滴加入反应容器中直到获得持久的黄色为止(大约2mLBr2)。连续搅拌15分钟。然后加入甲酸钠直到黄色消失。随后在玻璃过滤器上用蒸馏水(5*50mL)洗涤该凝胶。该溴化的凝胶被直接用于加工成阴离子交换剂。
实施例4：加工成阴离子交换剂的通用程序
实施例4-1：二乙胺(ANX)的偶联
通常，将实施例3制备的溴化凝胶(50mL，沥干)、二乙胺(20mL)和蒸馏水(20mL)加入一个500mL的三颈圆底烧瓶中，并在室温下机械搅拌该混合物约15分钟。然后用浓HCl将pH调到11.5。再将NaBH4(0.13g)加入烧瓶中，在室温下反应18小时。然后通过加入浓醋酸终止该反应。最后，在玻璃过滤器上用蒸馏水(10*50mL)洗涤该凝胶。一般地，该ANX凝胶离子交换剂的产量在78μmol/mL凝胶至141μmol/mL凝胶的范围内。
实施例4-2：乙二胺(EDA)的偶联
通常，将实施例3制备的溴化凝胶(50mL，沥干的)、乙二胺(75mL)和蒸馏水(30mL)加入一个500mL的三颈圆底烧瓶中，并在室温下机械搅拌该混合物约15分钟。然后在60℃下搅拌反应18小时。将反应混合物冷却到室温，并且在烧瓶放置于冰浴中的情况下用浓醋酸中和该反应混合物。最后，在玻璃过滤器上用蒸馏水(10*50mL)洗涤该凝胶。一般地，该EDA凝胶离子交换剂的产量在166μmol/mL凝胶至224μmol/mL凝胶的范围内。
表1 样品 部分氧化之前烯丙基 的含量 (μmol/mL凝胶) 部分氧化之后烯丙基 的含量 (μmol/mL凝胶) 氧化的 烯丙基 (％) ANX1 ANX2 ANX3 EDA1 EDA2 EDA3 222 222 203 201 201 203 196 177 198 190 190 198 12 20 3 6 6 3
实施例5：细胞吸附测试
在不同样品上实施了细胞吸附测试。其结果记录在表2中。该结果是以不同NaCl浓度下的流通部分(FT)中和洗脱部分(E)中的细胞百分数给出的。称为REF.ANX和REF.EDA的凝胶相当于根据标准方法制备的凝胶，该标准方法包括烯丙基化StreamlineTM A 300(阿默森生物科学有限公司，乌普萨拉，瑞典)、溴化和连接相应的阴离子交换剂，即是按照上述原理但不用部分氧化外层。
表2 样品 0mM ％FT NaCl ％E 25mM ％FT NaCl ％E 50mM ％FT NaCl ％E 100mM ％FT NaCl ％E REF.ANX ANX1 ANX2 ANX3 2 27 19 25 101 16 40 16 2 89 44 78 99 15 1 5 2 74 46 43 96 16 2 2 3 73 73 94 54 4 7 0 REF.EDA EDA1 EDA2 EDA3 1 30 67 79 17 0 2 0 1 48 67 81 18 0 1 0 2 77 78 77 16 2 0 1 1 82 78 84 40 4 2 0