低氧激活联合氯乙基亚硝基脲类化合物及制备方法和应用技术领域
本发明涉及药学技术领域,尤其涉及低氧激活联合氯乙基亚硝基
脲类化合物及制备方法和应用。
背景技术
氯乙基亚硝基脲(CENUs)是一类重要的双官能团抗肿瘤烷化
剂,在临床上应用十分广泛。如化合物Ⅰ结构所示,临床上具有代
表性的CENUs药物主要包括卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀
(Me-CCNU)、尼莫司汀(ACNU)、洛莫司汀(CCNU)。CENUs为广谱
抗肿瘤药物,临床上应用于脑瘤、骨髓瘤、恶性黑色素瘤、恶性淋
巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌和白血病的治疗。由于CENUs易于穿越
血脑屏障,其在脑脊髓液中的浓度可达到血浆浓度的30~35%,因此
尤其对脑瘤具有良好的疗效。CENUs发挥抗癌作用主要是通过导致
肿瘤细胞DNA发生股间交联。研究表明,CENUs能够在生理条件
下分解,产生的氯乙基碳正离子与DNA鸟嘌呤O6位发生亲电取代
反应生成O6-氯乙基鸟嘌呤,再经过N1,O6-桥亚乙基鸟嘌呤中间体进
一步与互补的胞嘧啶发生反应,最终在鸟嘌呤N1位和胞嘧啶的N3
位之间形成共价连接,即生成G-C交联。这种GC互补碱基对之间
的共价交联阻碍了肿瘤细胞中DNA的复制和转录过程,导致有丝分
裂不能正常进行或使得DNA双链发生断裂,最终诱导肿瘤细胞凋
亡。
O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)是一种重要的DNA修复
酶,它可以将O6-烷基鸟嘌呤上的烷基基团转移到自身第145位半胱
氨酸残基上,从而将烷化损伤的DNA碱基修复。在暴露于CENUs
的肿瘤细胞中,AGT能够阻断CENUs导致的O6-氯乙基鸟嘌呤和
N1,O6-桥亚乙基鸟嘌呤进一步与胞嘧啶反应形成dG-dC交联,使得
CENUs不能发挥DNA股间交联作用,导致肿瘤细胞对CENUs产生
耐药性,最终导致化疗失败。因此,设计和开发AGT抑制剂并将其
与烷化剂联合用药,是提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性从而保证
化疗效果的重要途径。
O6-苄基鸟嘌呤是一种有效的AGT抑制剂,它可将自身的苄基
转移到AGT活性中心的第145位半胱氨酸残基上,导致AGT失活
而失去修复DNA损伤的功能,从而提高肿瘤细胞对CENU的敏感
性。研究表明,浓度为2.5μM的O6-苄基鸟嘌呤作用于人结肠癌细
胞HT2930min即可导致90%的AGT失活;荷瘤无胸腺小鼠预先给
予O6-苄基鸟嘌呤处理2h后,再给予CENUs治疗,可明显抑制肿瘤
的生长,显著增强了CENUs的化疗效果。目前,通过O6-苄基鸟嘌
呤抑制肿瘤细胞中的AGT活性以降低DNA烷化损伤的修复,已经
成为了提高烷化剂疗效的重要途径。然而研究发现,由于O6-苄基鸟
嘌呤对AGT的抑制作用不具有靶向性,在与烷化剂的联合用药中,
O6-苄基鸟嘌呤在抑制肿瘤细胞中AGT活性的同时,也作用于正常
细胞,导致正常细胞中的AGT活性被抑制,从而破坏了正常细胞对
DNA损伤的修复机制,增加了正常细胞的DNA损伤,最终导致化
疗药物毒副作用的提高。
综上所述,CENUs在临床应用中所表现出来的耐药性是限制其进
一步开发和应用的重要因素。通过抑制AGT的活性虽然能够提高肿瘤
细胞对CENUs的敏感性,但由于现有AGT抑制剂的非靶向性,导致
CENUs对正常细胞的损伤作用增强,从而降低了CENUs的化疗效果。
因此,设计和开发能够同时导致DNA股间交联并抑制AGT活性,并
且具有肿瘤细胞靶向性的新型化合物,是解决亚硝基脲类双官能团烷
化剂现有问题、使其更广泛应用于肿瘤临床治疗的一条重要途径。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术存在的缺陷和不足,提供具
有式(Ⅱ)结构的化合物或药学上可接受的盐:
R1为H,NO2,OMe,NMe2,CO2Et,N-甲基哌嗪中的一种;
R2为H,NH2,CH3,CH2NH2,CH2OH中的一种;
R3=R4=H,或R3=H,R4=CH3,或R3=R4=CH3;
n为2-6的整数。
优选地,当R1为NO2时,该化合物或其盐具有较佳的抗肿瘤活性
和选择性。
进一步优选地,当R1为NO2,R2为H时,该化合物或其盐具有更
佳的抗肿瘤活性和选择性;
再进一步优选地,当R1为NO2,R2为H,R3=R4=H时,该化合物
或其盐的抗肿瘤活性和选择性进一步提高。
本发明最优选地,当R1为NO2,R2为H,R3=R4=H,且n分别为2,3,4
的时候,即分别具有如下结构式时,化合物或其盐的抗肿瘤活性和选
择性最佳。
可采用本领域常规的技术手段,将上述任一化合物与有机酸或无
机酸成盐,其中,本发明优选所述盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、
硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲
磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、
柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、葡萄糖酸盐。
采用本领域常规的技术手段,可将上述任一化合物成盐,成盐后
的化合物同样具有与未成盐化合物相同的药理活性。
本发明的第二个目的是提供一种药物组合物,所述药物组合物包
括治疗有效量的式(Ⅱ)结构化合物或药学上可接受的盐,和至少一
种药用载体。
所述药用载体为本领域常用物质,如崩解剂、分散剂、润滑剂、
乳化剂、稳定剂等。所述药物组合物可以采用本领域常规手段制备成
药学上常用的剂型,如片剂、注射剂、胶囊剂等。
经试验验证,上述任意一种化合物或其药学上可接受的盐、或药
物组合物均能够同时导致DNA股间交联并抑制AGT介导的耐药性,
尤其是能够靶向性地作用于肿瘤细胞,避免了对正常细胞的损伤作
用;此外,简化了CENUs与AGT抑制剂在临床应用中的联合用药
过程。
本发明的第二个目的是提供所述化合物的制备方法,所述方法的
反应历程为:
本发明同时提供了当R1为NO2,R2为H,R3=R4=H时,化合物
的制备方法,所述方法的反应历程为:
所述方法主要包括如下步骤:
(1)化合物a与二卤代烷烃反应得到化合物b;
(2)化合物b与邻苯二甲酰亚胺反应得化合物c;
(3)化合物c先与三光气反应,所得产物与反应
得化合物d;
(4)化合物d发生肼解反应得化合物e;
(5)化合物e与2-氯乙基异氰酸酯反应得化合物f;
(6)化合物f与亚硝鎓四氟硼酸盐反应得化合物h,即式(Ⅱ)
化合物。
所述方法的优选步骤为:
(1)化合物a与二卤代烷烃按照1:(1-7)的摩尔比,在碱的催
化作用下,于40-60℃反应,得化合物b;
(2)化合物b与邻苯二甲酰亚胺按照1:(1-4)的摩尔比,于
50-110℃反应,得化合物c;
(3)按照化合物c、三光气、的摩尔比为3:(1-3):
(3-12),化合物c先与三光气在0-10℃条件下反应,得化合物d,化
合物d与在10-50℃条件下反应,得化合物e;
(4)化合物e与水合肼在20-50℃条件下反应,得化合物f;
(5)化合物f与2-氯乙基异氰酸酯按照1:(1-4)的摩尔比,在
20-50℃反应,得化合物g;
(6)化合物g与亚硝鎓四氟硼酸盐按照1:(1-2)的摩尔比,在
冰浴条件下反应,得化合物h。
其中,步骤(1)中,所述二卤代烷烃可选自二溴代烷烃或二氯
代烷烃,进一步优选为二溴代烷烃,二溴代烷烃具有较高的反应活性,
能够保证反应顺利进行,获得较高的收率和较纯的产品。
所述水合肼为70%水合肼,且化合物e与70%水合肼的摩尔体积
比为(2-6):1(mmol:mL)。
以上是本发明的通用制备方法,以下以制备R1为NO2,R2为H,
R3=R4=H,n为2的化合物为例对本发明的制备方法进行详细说明,
其他化合物的制备方法与此方法类似。
步骤(1)的具体操作:将化合物a溶解,向其中加入催化剂无
机碱并滴加1,2-二溴代乙烷,然后在40-60℃条件下反应,即得化合
物b;
其中,化合物a、无机碱、1,2-二溴代乙烷的摩尔比优选为1:(1-6):
(1-7);所述无机碱优选为无水碳酸钾;溶解化合物a的溶剂优选为
丙酮或N,N-二甲基甲酰胺;步骤(1)还包括对化合物b进行提纯
的步骤,具体为浓缩反应液,采用柱层析法对浓缩液进行分离提纯,
优选柱层析的固定相为硅胶,流动相为石油醚和乙酸乙酯,进一步优
选按照石油醚/乙酸乙酯(v/v)1:2逐渐变为1:4的比例进行梯度洗脱
对化合物b进行提纯。
步骤(2)的具体操作为:化合物b与邻苯二甲酰亚胺按照1:(1-4)
的摩尔比,于50-110℃反应,得化合物c。
其中,步骤(2)所使用的反应溶剂优选为乙腈或N,N-二甲基
甲酰胺;步骤(2)还包括对化合物c进行提纯的步骤,具体为向反
应液中加入乙酸乙酯和水(v:v=1:1)进行萃取,收集有机相,使用
饱和氯化钠水溶液洗涤,干燥,蒸馏除去溶剂即得。
步骤(3)的具体操作为:按照化合物c、三光气、对硝基苯甲
醇的摩尔比为3:(1-3):(3-12),化合物c先与三光气反应,得化合
物d,化合物d与对硝基苯甲醇在10-50℃条件下反应,得化合物e。
步骤(3)的具体操作优选为:将化合物c溶解,加入缚酸剂,
在惰性气体保护下于0-10℃滴加溶解三光气的溶液,滴加完毕后,于
10-40℃反应,生成化合物d,然后向反应液中加入对硝基苯甲醇,于
10-50℃反应,得化合物e。
其中,溶解化合物c的溶剂优选为二氯甲烷或甲苯;缚酸剂优选
为吡啶或三乙胺;步骤(3)还包括对化合物e进行提纯的步骤,具
体为浓缩反应液,采用柱层析法对浓缩液进行分离提纯,优选柱层析
的固定相为硅胶,流动相为石油醚和乙酸乙酯,进一步优选按照石油
醚/乙酸乙酯(v/v)1:2逐渐变为1:5的比例进行梯度洗脱对化合物e
进行提纯。
步骤(4)的具体操作为:化合物e与水合肼在20-50℃条件下反
应,得化合物f,优选化合物e与70%水合肼的摩尔体积比为(2-6):
1(mmol:mL)。
其中,首先将化合物e溶解后再与水合肼反应,优选溶解化合物
e的溶剂为甲醇或乙醇;步骤(4)还包括对化合物f进行提纯的步骤,
具体为向反应液中加入二氯甲烷和水(v:v=1:1)进行萃取,收集有
机相,使用饱和氯化钠水溶液洗涤,干燥,蒸馏除去溶剂即得。
步骤(5)的具体操作为:化合物f与2-氯乙基异氰酸酯按照1:
(1-4)的摩尔比,在20-50℃反应,得化合物g。
其中,反应溶解优选为二氯甲烷,反应过程中有沉淀产生,反应
完全后蒸馏除去溶剂,加入去离子水洗涤沉淀,过滤干燥即得。
步骤(6)的具体操作为:化合物g、冰醋酸、与亚硝鎓四氟硼
酸盐按照1:(1-2):(1-2)的摩尔比,冰浴条件下反应,得化合物h。
其中,步骤(6)的反应溶剂优选为乙腈或丙酮。步骤(6)还包
括对化合物h进行提纯的步骤,具体为反应结束后,向反应液中加入
乙酸乙酯和冰水(v:v=1:1)进行萃取,洗涤有机相,干燥浓缩,采
用柱层析对浓缩液进行分离,所述柱层析优选为固定相为硅胶,流动
相为石油醚和乙酸乙酯,进一步优选按照石油醚/乙酸乙酯(v/v)为
1:1逐渐变为1:4的梯度进行洗脱,即得。
本发明的第三个目的是提供式(Ⅱ)结构化合物或药学上可接受
的盐、或上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤优选为脑瘤、骨髓瘤、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肺
癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺肿瘤、白血病中的一种或多种;
进一步优选为脑瘤、前列腺肿瘤、结肠癌中的一种或多种。
本发明通式Ⅱ中的化合物或药学上可接受的盐,为新型的具有
抗耐药性和肿瘤细胞靶向性的联合氯乙基亚硝基脲,本发明对通式
Ⅱ中的化合物进行了体外抗肿瘤筛选试验。结果表明,在低氧条件
下通式Ⅱ中的化合物对人脑神经胶质瘤细胞SF126、SF763、SF767,
人前列腺肿瘤细胞DU145,人结肠癌细胞HT29和小鼠白血病细胞
WEHI-3等多种肿瘤细胞系均有明显的抑制作用,而在有氧条件下通
式Ⅱ中的化合物对上述肿瘤细胞的抑制作用并不明显。因此,通式
Ⅱ中的化合物具有良好的靶向性和杀死肿瘤细胞的能力,可以用于
靶向性肿瘤化疗药物。一方面,它可以在体内分解生成氯乙基碳正
离子,导致DNA股间交联的产生,发挥抑制肿瘤细胞生长的作用,
另一方面,可以选择性地在处于低氧条件下的癌细胞中释放出O6-
苄基鸟嘌呤类似物药效团,靶向性地发挥抑制肿瘤细胞AGT活性的
作用,降低肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的耐药性。该化合物能选择
性的作用于处于缺氧状态的肿瘤细胞,降低了联合用药的毒副作用,
提高了药物的靶向性,与现有亚硝基脲类抗癌药物相比具有耐药性
更低、抗癌活性更高的优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。以下
实施例中涉及到的药品无特殊说明,均可市购获得;涉及到的操作,
无特殊说明,均为本领域常规的操作。
实施例1:N-(2-氯乙基)-N’-3-(O6-苄基-N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)9-
鸟嘌呤基)乙基-N-亚硝基脲(化合物1)的合成
1)N9-溴乙基-O6-苄基鸟嘌呤的合成
称取O6-苄基鸟嘌呤(0.96g,4mmol),无水碳酸钾(1.66g,12mmol)
加入到三口烧瓶中,加入100mL丙酮,缓慢升温至50℃,滴加1,2-
二溴乙烷(1.4mL,16mmol),滴毕后继续反应60h,过滤反应液,收
集滤液,40℃减压蒸馏旋干溶剂后,用硅胶柱层析法分离纯化,洗
脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积
比从1:2逐渐增加到1:4,40℃真空干燥得到白色固体N9-溴乙基-O6-
苄基鸟嘌呤(1.11g,3.2mmol),产率80%。
UVλ:250,283nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3468.6(N-(CH2)2-);
3319.9(N-H);2961.9(C-H);1638.1(C=C);1262.4(C-O-C);
1064.3(C-N);704.9(C-Br)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.71-3.74(t,2H,
CH2);4.45-4.52(t,2H,CH2);4.98(s,2H,NH2);5.57(s,2H,CH2);
7.32-7.52(m,5H,C6H5);7.68(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z348(M+H)+。
2)N9-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤
将所得固体N9-溴乙基-O6-苄基鸟嘌呤(1.11g,3.2mmol),加入
20mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入邻苯二甲酰亚胺钾固体
(1.18g,6.4mmol),加热至65℃,搅拌反应6h,过滤反应液,收集滤
液,加入40mL乙酸乙酯和40mL去离子水进行萃取,有机相用饱
和氯化钠水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,40℃真空干燥得到白
色固体N9-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.24g,
3mmol),产率94%。
UVλ:249,285nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3470.6(N-(CH2)2-);
3326.5(N-H);2981.7(C-H);1832.4(C=O);1678.1(C=C);
1226.4(C-O-C);1047.3(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.87-3.91(t,
2H,CH2);4.52-4.55(t,2H,CH2);5.08(s,2H,CH2);6.97(s,2H,NH2);
7.34-7.53(m,5H,C6H5);7.86-7.89(m,4H,C6H4);8.01(s,1H,CH)。
ESI-MS:m/z415(M+H)+。
3)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙基)-O6-
苄基鸟嘌呤的合成
将所得固体N9-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤
(1.24g,3mmol),加入70mL无水二氯甲烷溶解,再加入3mL无水吡
啶充分搅拌,称取三光气(0.45g,1.5mmol)加入到三口瓶中,加入
15mL甲苯溶解,在冰浴、氩气保护的条件下将N9-(2-(N-邻苯二甲
酰亚胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤溶液滴加到三光气溶液中,滴加完毕
后,将温度缓慢升到25℃,搅拌反应12h,再加入10mL含有对硝
基苯甲醇(0.46g,3mmol)的二氯甲烷溶液,25℃搅拌3h,40℃减压蒸
馏除去溶剂,用硅胶柱层析法分离纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙
酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5,
40℃真空干燥得到白色固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(2-(N-邻
苯二甲酰亚胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.42g,2.4mmol),产率80%。
UVλ:235,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3489.4(N-(CH2)2-);
3327.9(N-H);3174.9(C-H);1797.4(C=O);1645.1(C=C);1382.4(N-O);
1265.5(C-O-C);1086.7(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.85-3.90(t,
2H,CH2);4.51-4.62(t,2H,CH2);4.71(s,2H,CH2);5.15(s,2H,CH2);
7.35-7.46(m,5H,C6H5);7.59-7.64(d,1H,CH);7.82-7.86(m,4H,C6H4);
8.02(s,1H,CH);8.18-8.21(d,1H,CH);9.12(s,1H,NH)。ESI-MS:
m/z594(M+H)+。
4)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(2-胺基)乙基-O6-苄基鸟嘌呤的合
成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(2-(N-邻苯二甲酰亚
胺基)乙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.42g,2.4mmol)溶于20mL甲醇,并加入
0.6mL水合肼,控温于30℃搅拌反应3h,使其发生肼解,加入40mL
二氯甲烷和40mL去离子水进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶液
洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,30℃真空干燥得N2-(((4-硝基苄基)氧)
羰基)-N9-(2-胺基)乙基-O6-苄基鸟嘌呤(0.93g,2mmol),产率83%。
UVλ:234,283nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3457.3(N-(CH2)2-);
3327.9(N-H);3174.9(C-H);1789.5(C=O);1692.6(C=C);1426.4(N-O);
1288.7(C-O-C);1097.4(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.11-3.14(t,
2H,CH2);4.54-4.59(t,2H,CH2);4.67(s,2H,CH2);5.09(s,2H,NH2);
5.18(s,2H,CH2);7.25-7.50(m,5H,C6H5);7.62-7.65(d,1H,CH);8.07(s,
1H,CH);8.19-8.21(d,1H,CH);9.19(s,1H,NH)。ESI-MS:
m/z464(M+H)+。
5)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)乙基脲的合成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(2-胺基)乙基-O6-苄基
鸟嘌呤(0.93g,2mmol)溶于20mL二氯甲烷,滴加2-氯乙基异氰酸酯
(0.34mL,4mmol),35℃搅拌6h,反应完毕后30℃减压蒸馏得N-(2-
氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)乙基
脲粗品,向其中加入少量去离子水,搅匀、抽滤并水洗,60℃真空
干燥得N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟
嘌呤基)乙基脲(0.74g,1.3mmol),收率65%。
UVλ:236,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3345.7(N-H);3096.2(C-H);
1762.1(C=O);1657.9(C=C);1365.4(N-O);1234.5(C-O-C);
1120.2(C-N);749.7(C-Cl)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.47-3.52(t,2H,
CH2);3.66-3.72(m,2H,CH2);4.52-4.57(t,2H,CH2);4.63(s,2H,CH2);
5.14(s,2H,CH2);5.92(s,1H,NH);6.07(s,1H,NH);7.22-7.69(m,5H,
C6H5);7.79-7.82(d,1H,CH);8.09(s,1H,CH);8.22-8.26(d,1H,CH);
9.21(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z569(M+H)+。
6)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)乙基-N-亚硝基脲的合成
将所得固体N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄
基-9-鸟嘌呤基)乙基脲(0.74g,1.3mmol)溶于8mL丙酮,加入冰乙酸
(112μL,2mmol),在冰浴条件下,加入亚硝鎓四氟硼酸盐(0.24g,
2mmol),冰浴条件下搅拌反应4h,反应完毕后加入30mL乙酸乙酯
和30mL冰水组成的混合液进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶液
洗涤,无水硫酸钠干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析法分离
纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙
酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4,27℃真空干燥得N-(2-氯乙
基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)乙基-N-亚
硝基脲(0.39g,0.65mmol),产率50%。
UVλ:235,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3365.6(N-H);3024.5(C-H);
1745.1(C=O);1685.8(C=C);1574.5(N=O);1372.6(N-O);
1293.4(C-O-C);1132.1(C-N);1065.7(N-N);752.8(C-Cl)。1H
NMR(400MHz,CDCl3)δ:3.42-3.45(t,2H,CH2);3.59-3.68(m,2H,
CH2);4.57-4.62(t,2H,CH2);4.72(s,2H,CH2);5.23(s,2H,CH2);5.98(s,
1H,NH);7.40-7.71(m,5H,C6H5);7.86-7.89(d,1H,CH);8.15(s,1H,
CH);8.29-8.31(d,1H,CH);9.27(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z598(M+H)+。
实施例2:N-(2-氯乙基)-N’-3-(O6-苄基-N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)9-
鸟嘌呤基)丙基-N-亚硝基脲(化合物2)的合成
1)N9-溴丙基-O6-苄基鸟嘌呤的合成
称取O6-苄基鸟嘌呤(1.44g,6mmol),无水碳酸钾(3.32g,24mmol)
加入到三口烧瓶中,加入150mL丙酮,缓慢升温至55℃,滴加1,3
二溴丙烷(3.03mL,30mmol),滴毕后继续反应65h,过滤反应液,收
集滤液,40℃减压蒸馏除去溶剂后,用硅胶柱层析法分离纯化,洗
脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积
比从1:2逐渐增加到1:4,40℃真空干燥得到白色固体N9-溴丙基-O6-
苄基鸟嘌呤(1.59g,4.4mmol),产率73%。
UVλ:250,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3452.4(N-(CH2)3-);
3312.6(N-H);2947.9(C-H);1634.7(C=C);1258.9(C-O-C);
1052.7(C-N);733.9(C-Br)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
2.73-2.78(m,2H,CH2);3.53-3.58(t,2H,CH2);4.26-4.32(t,2H,CH2);
4.57(s,2H,NH2);5.39(s,2H,CH2);7.24-7.32(m,5H,C6H5);
7.68(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z362(M+H)+。
2)N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤
将所得固体N9-溴丙基-O6-苄基鸟嘌呤(1.59g,4.4mmol),加入
30mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入邻苯二甲酰亚胺钾固体
(1.47g,8mmol),加热至65℃,搅拌反应7h,过滤反应液,收集滤液,
加入60mL乙酸乙酯和60mL去离子水进行萃取,有机相用饱和氯
化钠水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,40℃真空干燥得到白色固
体N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.24g,
4mmol),产率91%。
UVλ:247,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3482.7(N-(CH2)3-);
3341.1(N-H);2975.4(C-H);1783.9(C=O);1631.7(C=C);
1272.6(C-O-C);1087.7(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
2.57-2.66(m,2H,CH2);3.97-4.01(t,2H,CH2);4.53-4.56(t,2H,CH2);
5.12(s,2H,CH2);6.95(s,2H,NH2);7.38-7.46(m,5H,C6H5);
7.79-7.86(m,4H,C6H4);8.04(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z429(M+H)+。
3)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丙基)-O6-
苄基鸟嘌呤的合成
将所得固体N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤
(1.24g,4mmol),加入90mL无水二氯甲烷溶解,再加入4mL无水吡
啶充分搅拌,称取三光气(0.9g,3mmol)加入到三口瓶中,加入20mL
甲苯溶解,在冰浴、氩气保护的条件下将N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚胺
基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤溶液滴加到三光气溶液中,滴加完毕后,将
温度缓慢升到25℃,搅拌反应14h,再加入15mL含有对硝基苯甲
醇(1.23g,8mmol)的二氯甲烷溶液,25℃搅拌5h,40℃减压蒸馏除去
溶剂,用硅胶柱层析法分离纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采
用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到1:5,40℃
真空干燥得到白色固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(3-(N-邻苯二
甲酰亚胺基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.88g,3.1mmol),产率78%。
UVλ:234,285nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3492.5(N-(CH2)3-);
3362.7(N-H);3214.2(C-H);1841.5(C=O);1652.7(C=C);1391.5(N-O);
1245.4(C-O-C);1061.6(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
2.59-2.64(m,2H,CH2);3.97-4.01(t,2H,CH2);4.48-4.52(t,2H,CH2);
4.61(s,2H,CH2);5.12(s,2H,CH2);7.37-7.49(m,5H,C6H5);7.61-7.65(d,
1H,CH);7.86-7.92(m,4H,C6H4);8.04(s,1H,CH);8.20-8.23(d,1H,
CH);9.17(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z608(M+H)+。
4)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(3-胺基)丙基-O6-苄基鸟嘌呤的合
成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(3-(N-邻苯二甲酰亚
胺基)丙基)-O6-苄基鸟嘌呤(1.88g,3.1mmol)溶于25mL甲醇,并加入
0.7mL水合肼,控温于35℃搅拌反应4h,使其发生肼解,加入50mL
二氯甲烷和50mL去离子水进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶液
洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,35℃真空干燥得N2-(((4-硝基苄基)氧)
羰基)-N9-(3-胺基)丙基-O6-苄基鸟嘌呤(1.19g,2.5mmol),产率80%。
UVλ:232,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3467.9(N-(CH2)3-);
3347.9(N-H);3014.3(C-H);1802.9(C=O);1682.1(C=C);1417.8(N-O);
1259.5(C-O-C);1072.7(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:2.56-2.67(m,
2H,CH2);4.01-4.05(t,2H,CH2);4.62(s,2H,CH2);5.06(s,2H,NH2);
5.15(s,2H,CH2);7.22-7.46(m,5H,C6H5);7.59-7.61(d,H,CH);8.01(s,
1H,CH);8.16-8.18(d,1H,CH);9.13(s,1H,NH)。ESI-MS:
m/z478(M+H)+。
5)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)丙基脲的合成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(3-胺基)丙基-O6-苄基
鸟嘌呤(1.19g,2.5mmol)溶于25mL二氯甲烷,滴加2-氯乙基异氰酸
酯(0.4mL,5mmol),35℃搅拌8h,反应完毕后35℃减压蒸馏得N-(2-
氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)丙基
脲粗品,向其中加入少量去离子水,搅匀、抽滤并水洗,60℃真空
干燥得N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟
嘌呤基)丙基脲(0.87g,1.5mmol),收率60%。
UVλ:234,285nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3357.4(N-H);2997.1(C-H);
1749.3(C=O);1676.5(C=C);1357.6(N-O);1268.4(C-O-C);
1146.7(C-N);739.8(C-Cl)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:2.49-2.57(m,
2H,CH2);3.36-3.43(m,2H,CH2);3.58-3.62(t,2H,CH2);3.97-4.02(t,
2H,CH2);4.61(s,2H,CH2);5.12(s,2H,CH2);5.89(s,1H,NH);5.97(s,
1H,NH);7.24-7.48(m,5H,C6H5);7.66-7.68(d,1H,CH);8.01(s,1H,
CH);8.16-8.17(d,2H,CH);9.12(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z583(M+H)+。
6)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)丙基-N-亚硝基脲的合成
将所得固体N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄
基-9-鸟嘌呤基)丙基脲(0.87g,1.5mmol)溶于12mL丙酮,加入冰乙酸
(132μL,2.3mmol),在冰浴条件下,加入亚硝鎓四氟硼酸盐(0.27g,
2.3mmol),冰浴条件下搅拌反应5h,反应完毕后加入40mL乙酸乙
酯和40mL冰水组成的混合液进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶
液洗涤,无水硫酸钠干燥,减压蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析法分
离纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸
乙酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4,28℃真空干燥得N-(2-氯乙
基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)丙基-N-亚
硝基脲(0.73g,1.2mmol),产率52%。
UVλ:235,283nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3389.6(N-H);3042.5(C-H);
1797.3(C=O);1674.5(C=C);1589.3(N=O);1391.4(N-O);
1281.8(C-O-C);1145.9(C-N);1078.6(N-N);762.2(C-Cl)。1H
NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.42-2.54(m,2H,CH2);3.36-3.44(m,2H,
CH2);3.61-3.69(t,2H,CH2);4.02-4.07(t,2H,CH2);4.61(s,2H,CH2);
4.72(s,2H,CH2);5.23(s,2H,CH2);5.98(s,1H,NH);7.40-7.62(m,5H,
C6H5);7.82-7.85(d,1H,CH);8.09(s,1H,CH);8.26-8.28(d,1H,CH);
9.22(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z612(M+H)+。
实施例3:N-(2-氯乙基)-N’-3-(O6-苄基-N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)9-
鸟嘌呤基)丁基-N-亚硝基脲(化合物3)的合成
1)N9-溴丁基-O6-苄基鸟嘌呤的合成
称取O6-苄基鸟嘌呤(0.72g,3mmol),无水碳酸钾(1.66g,12mmol)
加入到三口烧瓶中,加入80mL丙酮,缓慢升温至55℃,滴加1,4
二溴丁烷(1.8mL,15mmol),滴毕后继续反应70h,过滤反应液,收
集滤液,40℃减压蒸馏除去溶剂后,用硅胶柱层析法分离纯化,洗
脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积
比从1:2逐渐增加到1:4,40℃真空干燥得到白色固体N9-溴丁基-O6-
苄基鸟嘌呤(0.79g,2.1mmol),产率70%。
UVλ:250,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3436.8(N-(CH2)4-);
3309.5(N-H);2942.0(-CH2-);1638.2(C=C);1256.2(C-O-C);
1063.2(C-N);729.3(C-Br)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
2.26-2.30(m,2H,CH2);2.53-2.58(m,2H,CH2);3.46-3.48(t,2H,CH2);
4.15-4.18(t,2H,CH2);4.47(s,2H,NH2);5.32(s,2H,CH2);
7.18-7.27(m,5H,C6H5);7.72(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z376(M+H)+。
2)N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤
将所得固体N9-溴丁基-O6-苄基鸟嘌呤(0.79g,2.1mmol),加入
15mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入邻苯二甲酰亚胺钾固体
(1.11g,6mmol),加热至70℃,搅拌反应8h,过滤反应液,收集滤液,
加入40mL乙酸乙酯和40mL去离子水进行萃取,有机相用饱和氯
化钠水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,40℃真空干燥得到白色固
体N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤(0.84g,
1.9mmol),产率90%。
UVλ:250,286nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3469.8(N-(CH2)4-);
3325.9(N-H);2957.1(C-H);1803.4(C=O);1651.7(C=C);
1269.5(C-O-C);1092.5(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
1.46-1.52(m,2H,CH2);1.76-1.80(m,2H,CH2);3.51-3.56(t,2H,CH2);
4.01-4.06(t,2H,CH2);5.14(s,2H,CH2);6.97(s,2H,NH2);7.40-7.47(m,
5H,C6H5);7.80-7.87(m,4H,C6H4);8.06(s,1H,CH)。ESI-MS:
m/z443(M+H)+。
3)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丁基)-O6-
苄基鸟嘌呤的合成
将所得固体N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤
(0.84g,1.9mmol),加入50mL无水二氯甲烷溶解,再加入2mL无水
吡啶充分搅拌,称取三光气(0.36g,1.2mmol)加入到三口瓶中,加入
10mL甲苯溶解,在冰浴、氩气保护的条件下将N9-(4-(N-邻苯二甲
酰亚胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤溶液滴加到三光气溶液中,滴加完毕
后,将温度缓慢升到25℃,搅拌反应14h,再加入15mL含有对硝
基苯甲醇(0.92g,6mmol)的二氯甲烷溶液,25℃搅拌10h,40℃减压
蒸馏除去溶剂,用硅胶柱层析法分离纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸
乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙酯的体积比从1:2逐渐增加到
1:5,40℃真空干燥得到白色固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰
基)-N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤(0.87g,
1.4mmol),产率74%。
UVλ:241,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3473.5(N-(CH2)4-);
3381.7(N-H);3171.8(C-H);1851.4(C=O);1682.7(C=C);1346.9(N-O);
1253.7(C-O-C);1095.4(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:
1.52-1.59(m,2H,CH2);1.77-1.82(m,2H,CH2);3.54-3.59(t,2H,CH2);
4.04-4.07(t,2H,CH2);4.67(s,2H,CH2);5.17(s,2H,CH2);7.39-7.46(m,
5H,C6H5);7.62-7.67(d,1H,CH);7.87-7.94(m,4H,C6H4);8.08(s,1H,
CH);8.18-8.21(d,1H,CH);9.16(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z622(M+H)+。
4)N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(4-胺基)丁基-O6-苄基鸟嘌呤的合
成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(4-(N-邻苯二甲酰亚
胺基)丁基)-O6-苄基鸟嘌呤(0.87g,1.4mmol)溶于20mL甲醇,并加入
0.6mL水合肼,控温于40℃搅拌反应4h,使其发生肼解,加入40mL
二氯甲烷和40mL去离子水进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶液
洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,35℃真空干燥得N2-(((4-硝基苄基)氧)
羰基)-N9-(4-胺基)丁基-O6-苄基鸟嘌呤(0.54g,1.1mmol),产率78%。
UVλ:235,283nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3467.6(N-(CH2)4-);
3347.6(N-H);2997.6(C-H);1791.4(C=O);1687.3(C=C);1421.9(N-O);
1262.9(C-O-C);1083.6(C-N)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.55-1.61(m,
2H,CH2);1.75-1.81(m,2H,CH2);2.69-2.71(t,2H,CH2);4.07-4.11(t,
2H,CH2);4.69(s,2H,CH2);5.14(s,2H,NH2);5.21(s,2H,CH2);
7.41-7.59(m,5H,C6H5);7.65-7.68(d,H,CH);8.09(s,1H,CH);
8.21-8.23(d,1H,CH);9.18(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z492(M+H)+。
5)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)丁基脲的合成
将所得固体N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-N9-(4-胺基)丁基-O6-苄基
鸟嘌呤(0.54g,1.1mmol)溶于15mL二氯甲烷,滴加2-氯乙基异氰酸
酯(0.25mL,3mmol),40℃搅拌10h,反应完毕后30℃减压蒸馏得N-(2-
氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)丁基
脲粗品,向其中加入少量去离子水,搅匀、抽滤并水洗,60℃真空
干燥得N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟
嘌呤基)丁基脲(0.38g,0.64mmol),收率58%。
UVλ:234,284nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3359.6(N-H);3019.1(C-H);
1735.4(C=O);1682.7(C=C);1395.7(N-O);1276.3(C-O-C);
1142.3(C-N);739.6(C-Cl)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.54-1.59(m,
2H,CH2);1.79-1.87(m,2H,CH2);3.09-3.13(t,2H,CH2);3.47-3.51(t,
2H,CH2);3.72-3.76(t,2H,CH2);4.09-4.12(t,2H,CH2);4.71(s,2H,
CH2);5.22(s,2H,CH2);5.96(s,1H,NH);6.05(s,1H,NH);7.38-7.56(m,
5H,C6H5);7.68-7.71(d,1H,CH);8.09(s,1H,CH);8.24-8.27(d,2H,
CH);9.22(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z597(M+H)+。
6)N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤
基)丁基-N-亚硝基脲的合成
将所得固体N-(2-氯乙基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄
基-9-鸟嘌呤基)丁基脲(0.38g,0.64mmol)溶于7mL丙酮,加入冰乙酸
(58μL,1mmol),在冰浴条件下,加入亚硝鎓四氟硼酸盐(0.12g,
1mmol),冰浴条件下搅拌反应5h,反应完毕后加入30mL乙酸乙酯
和30mL冰水组成的混合液进行萃取,有机相用饱和氯化钠水溶液
洗涤,无水硫酸钠干燥,减压蒸馏旋干溶剂,用硅胶柱层析法分离
纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,采用梯度洗脱,石油醚/乙酸乙
酯的体积比从1:1逐渐增加到1:4,30℃真空干燥得N-(2-氯乙
基)-N’-2-(N2-(((4-硝基苄基)氧)羰基)-O6-苄基-9-鸟嘌呤基)丁基-N-亚
硝基脲(0.19g,0.31mmol),产率48%。
UVλ:235,283nm。IR(KBr压片)v/cm-1:3372.5(N-H);2987.4(C-H);
1731.4(C=O);1673.9(C=C);1557.8(N=O);1367.4(N-O);
1289.7(C-O-C);1141.2(C-N);1081.3(N-N);741.9(C-Cl)。1H
NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.56-1.63(m,2H,CH2);1.75-1.79(m,2H,
CH2);3.06-3.11(t,2H,CH2);3.49-3.52(t,2H,CH2);3.69-3.72(t,2H,
CH2);4.08-4.13(t,2H,CH2);4.72(s,2H,CH2);5.24(s,2H,CH2);5.92
(s,1H,NH);7.42-7.60(m,5H,C6H5);7.71-7.74(d,1H,CH);8.11(s,1H,
CH);8.25-8.28(d,1H,CH);9.24(s,1H,NH)。ESI-MS:m/z626(M+H)+。
实施例4成盐
向实施例3制备得到的化合物3中缓慢滴加25%浓度的盐酸溶
液,直至析出晶体为止,过滤,干燥即得上述化合物的盐酸盐。
为了进一步说明本发明的药物组合物,以下通过制剂进行说明,
以下药物组合物中的活性成分可以采用本发明所述的任意化合物或
药学上可接受的盐,优选实施例1-3所述的化合物及其药学上可接
受的盐。
实施例5注射用剂的制备
化合物3的盐酸盐100mg,须先溶于20ml无菌注射用水,充分
振摇直到完全溶解成澄清、无色或淡黄色溶液,溶解时间一般不超
过5分钟,溶解后浓度为5mg/ml。在溶解后30分钟之内,根据需
要抽取适量化合物3盐酸盐水溶液,转移至500ml生理盐水注射液
(0.lmg/mL)或葡萄糖氯化钠注射液(2.5%/0.45%)中,并确保药
物在注射液中的最终浓度在0.2~0.5mg/ml之间。配制好的注射液可
在2~8℃冷藏保存12小时,或在室温及自然光下保存2小时。
实施例6片剂的制备
化合物3的盐酸盐5g,乳糖5.0g,羟丙基环糊精3g,交联聚丙
烯吡咯烷酮0.8g,硬脂酸镁0.2g,制得100片。
制备工艺:将化合物3过80目筛,然后与羟丙基环糊精按等量
递加法混合均匀,过60目筛,再与处方量的其余辅料混合均匀,测
半成品含量,计算片重,压片,即得。
实施例7胶囊剂的制备
化合物3的盐酸盐5g,乳糖4.0g,微晶纤维素7g,微粉硅胶0.04g。
制备工艺:将处方中的主药和辅料过100目筛,称取化合物3的盐酸
盐与微晶纤维素、乳糖、微粉硅胶混合均匀后,装填胶囊,即得。
本发明制得的新型氯乙基亚硝基脲化合物的抗肿瘤活性评价如下:
实验例1:抗肿瘤活性的评价
1、实验材料与仪器
供试化合物:上述制备实施例中制得的化合物1、2和3;
细胞系:小鼠白血病细胞WEHI-3,人脑神经胶质瘤细胞SF126、
SF763、SF767,人前列腺肿瘤细胞DU145和人结肠癌细胞HT29。
2、实验方法
六种肿瘤细胞分别以1000/孔接种96孔板,在37℃,5%CO2
培养24小时后,换以系列浓度(1μM、5μM、10μM、50μM、100μM、
200μM、400μM和1000μM)的卡莫司汀(阳性对照组)、化合物1、化
合物2和化合物3,每组5个复孔,并设置对照组。将上述各组分别
在有氧和低氧条件下作用48小时。然后,向每孔中加10μLCCK-8
溶液,作用4小时。最后,测定在450nm处的吸光度值,按以下公
式计算细胞活性,并通过回归分析计算得到半数抑制率IC50。
细胞存活率(%)=(A加药组–A空白组)/(A对照组–A空白组)×100
A加药组为具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度;
A空白组为具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度;
A对照组为具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
3、实验结果:见表1
表1:肿瘤细胞的半数抑制率(IC50,μM)
表1结果显示:
在常氧环境下,化合物1、2和3对6种肿瘤细胞的IC50值与阳
性对照组(BCNU组)相近,表明在常氧条件下,化合物1、2和3的
肿瘤细胞抑制活性与BCNU差别不大;对于AGT高表达的细胞
(SF763、DU145和HT29细胞),化合物1、2和3的IC50值较高,
表现出了与BCNU相同的耐药性。
在低氧环境下,化合物1、2和3对6种肿瘤细胞的IC50值比阳
性对照组(BCNU组)显著降低;尤其是对于AGT高表达的细胞
(SF763、DU145和HT29细胞),化合物1、2和3的IC50值下降至
与AGT表达水平较低的细胞(WEHI-3、SF126和SF767细胞)相近。
这表明化合物1、2和3在低氧环境下能够释放出O6-苄基鸟嘌呤类
似物作为AGT抑制剂,从而阻断了AGT介导的肿瘤细胞耐药性,
使得化合物1、2和3的抗肿瘤活性明显提高。
对比常氧和低氧环境下化合物1、2和3的IC50值,可以看出低
氧环境比常氧环境下化合物1、2和3的肿瘤细胞抑制活性显著提高,
表明化合物1、2和3具有低氧环境选择性;尤其对于AGT含量较
高的肿瘤细胞,化合物1、2和3的低氧环境选择性更为明显。因此,
化合物1、2和3能够选择性地作用于处于低氧状态下的肿瘤细胞,
而避免对处于常氧状态下的正常细胞造成损伤,从而达到靶向作用
于肿瘤细胞的目的。
实验结果表明,本发明提供的化合物在低氧条件下比现有的氯
乙基亚硝基脲具有更高的肿瘤抑制活性;同时,该类化合物能够特
异性的作用于肿瘤细胞,可用于肿瘤靶向治疗。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发
明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,
这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神
的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。