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1、(10)申请公布号 CN 103333829 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103333829 A *CN103333829A* (21)申请号 201310266049.7 (22)申请日 2013.06.28 CGMCC NO. 7469 2013.04.12 CGMCC NO. 7470 2013.04.12 C12N 1/20(2006.01) A23K 3/03(2006.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 99 号 申请人 河北省农林科。
2、学院农业资源环境研 究所 (72)发明人 刘全兰 王尚龙 智健飞 杨艳 严学兵 刘忠宽 张蕊 刘杰 (54) 发明名称 一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种高水分苜蓿青贮菌剂活 性成分的制备方法， 其活性成分为植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)WN5 和 干 酪 乳 杆 菌 SN3(Lactobacilluscasei)， 其 制 备 步 骤 包 括 ： 一、 菌株的分离和纯化， 二、 抑酵母试验， 三、 菌株 的药敏试验， 四、 菌株的共同培养试验， 五、 菌株的 鉴定。通过上述五步制造的活性成分制造的菌剂 对高水分苜蓿青贮时。
3、， 高水分苜蓿水分含量高达 81.7%， 青贮时间达到 240 天， 青贮后的苜蓿的茎 叶完整保存于植株上、 含水量与青贮前相差很少， 蛋白质含量还有所提高 ； 同时提高青贮剂的抑菌 效果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传 播的隐患。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 (10)申请公布号 CN 103333829 A CN 103333829 A *CN103333829A* 1/3 页 2 1. 一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ：。
4、 活性成分为植物乳杆 菌 (Lactobacillus plantarum)WN5 和干酪乳杆菌 SN3(Lactobacillus casei)。 2. 根据权利要求 1 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 所 述活性成分的制备方法是 ： 一、 菌株的分离和纯化 ： 收集淤泥的浸出液， 按体积比 1:10 的比例加入到无菌水中混 匀， 连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37厌氧培养 48h ； 挑取透明圈较大的单菌落， 在 MRS 固体培养基上连续划线 3 次得到纯的单菌落 ； 挑取 单菌落于没有添加碳酸钙的 MRS 液体培养基中 。
5、, 观察是否产气 , 产气菌株为异型发酵乳酸 菌 , 不产气菌株为同型发酵乳酸菌 ； 共分离出 175 个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株 ； 这 些菌株接入 MRS 液体培养基中 , 37厌氧培养 20h, 取其中的 700 微升菌液并加入 300 微 升灭菌甘油 , 然后混匀 ,-20冻存 ； 二、 抑酵母试验 ： 取出 -20条件下保存的乳酸菌 , 取 5 微升注入 MRS 固体培养基上涂 布, 在温度37的条件下培养1214h ； 用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种 于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h， 得到活化的乳 酸菌。
6、 ； 按 1% 的接种量 , 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙 MRS 液体培养基的 250ml 三角瓶 中 , 装液量为 100ml， 37培养 16 18h, 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 0.993 1010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获得抑菌物一 ； 按 1% 的接种量 , 将 活化的乳酸菌接入装有 MRS 液体培养基的 250 ml 三角瓶中 , 装液量为 100 ml ； 37培养 16 18h, 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 1.01010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获。
7、得抑菌物二 ； 将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于 YPD 液体培养 基中 28静止培养 48h 得到酵母菌培养液 ； 双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌 能力， 双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力 ； 三、 菌株的药敏试验 ： 制备不同浓度的抗生素滤纸片， 培养乳酸菌， 采用滤纸片扩散法 测定乳酸菌的药敏性， 得到 16 株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株 ； 四、 菌株的共同培养试验 ： 取出 -20条件下保存的 6 株乳酸菌进行活化， 将活化的 6 株乳菌液按 cfu 比 1:1 的比例混合， 得到进行菌株共同培养的种子液 , 按 1% 的接。
8、种量 , 将 混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的 MRS 液体培养基， 37静止培养 , 间隔 1 天测菌 液浓度和培养基 pH 值 , 连续测定 7 天， 菌株 WN5 和 SN3 的组合表现出最好的增殖优势和存 活优势 ； 五、 菌株的鉴定 ： 将上述步骤筛选得到的菌株 WN5 和 SN3 分别进行生物学特性和 16S-23S rDNA 间隔区序列鉴定。 3. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤二中双层琼脂平板打孔法测定是指， 将 20ml 的 MRS 固体培养基注入直径 25cm 的培养皿 中 , 冷却 1h ； 取 6mL 酵母菌培。
9、养液加到 100ml 冷却至 45的 YPD 半固体培养基中， 摇匀， 并 迅速倒在底层MRS培养基上 ； 在底层MRS培养基的上面、 间隔相等距离处放置3个被剪短的 lml移液器Tip头 ； 该被剪短Tip头的高为1cm,直径为0.9cm ； 冷却注入的YPD半固体培养 基,时间为1h,此时, 制成双层培养基 ； 取出Tip头,制成用于放置抑菌物的洞口 ； 取相同 浓度的上述乳酸菌抑菌物一 , 体积数为 150 微升 , 加入其中两孔中 ； 剩余一个作为对照 , 加入 150 微升的灭菌俄水 ； 37培养 48h, 测定和记录乳酸菌对酵母菌的抑菌圈直径 ； 所述 权 利 要 求 书 CN 1。
10、03333829 A 2 2/3 页 3 YPD 液体培养基每升的组分及含量为 : 酵母粉 10 克， 蛋白胨 20 克， 葡萄糖 20 克 ； 所述 YPD 半固体培养基每升的组分及含量为 : 酵母粉 10 克， 蛋白胨 20 克， 葡萄糖 20 克 ,0.7% 的琼 脂粉。 4. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤三中制备不同浓度的抗生素滤纸片是指， 将链霉素、 环丙沙星和庆大霉素均配置成 80 g/ml、 320g/ml 和 1280g/ml 的三个浓度梯度， 阿莫西林、 红霉素和头孢拉定均配置成 0.625 g/ml、 20g/ml 。
11、和 80g/ml 的三个浓度梯度， 以滤纸制备直径为 0.6cm 的圆形滤纸 片 , 将它们放入上述抗生素溶液中 , 得到不同浓度的抗生素滤纸片。 5. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 所 述步骤三中培养乳酸菌是指， 取出 -20条件下保存的乳酸菌 , 取 5 微升注入 MRS 固体培 养基上,涂布, 在温度37的条件下培养1214h， 用接种环挑取MRS固体培养基上的单 菌落 , 接种于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h 得 到活化的乳酸菌， 将活化的乳酸菌按 1% 的接种量接入装有 MR。
12、S 液体培养基的 250ml 三角瓶 中 , 装液量为 100ml, 37培养 16 18h, 得到乳酸菌液 , 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基 中至少含有 0.993 1010 cfu 乳酸菌， 用无菌水稀释每毫升乳酸菌的菌液浓度为 1.5 108 cfu。 6. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤四中乳酸菌的活化是指， 将 20ml 的不添加碳酸钙的 MRS 固体培养基注入直径 25cm 的培 养皿中 , 冷却 1h， 吸取 100 微升的每毫升浓度为 1.5 108 cfu 的乳酸菌液于培养基中央 涂板， 取 4 张滤纸片 , 这。
13、 4 张滤纸片分别为 3 张同种抗生素但浓度不同的抗生素滤纸片 , 第 4 张滤纸片为不含抗生素的对照， 待琼脂表面吸收乳酸菌后 , 贴间隔均匀适中的上述 4 张滤纸片于每个培养皿的琼脂表面， 静置 5 分钟后 , 翻转平皿， 37静止培养 24h, 测定和 记录抗生素对乳酸菌的抑菌圈直径。 7. 根据权利要求 2 或 3 或 4 或 5 或 6 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方 法， 其特征在于 ： MRS 液体培养基每升的组分及含量为 : 蛋白胨 10 g/L、 酵母粉 5 g/L、 葡 萄糖 10 g/L、 蔗糖 15 g/L、 牛肉膏 10 g/L、 柠檬酸氢二铵 2 g/L、。
14、 乙酸钠 5 g/L、 丙酮酸 钠 0.18 g/L、 L- 光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、 血红素 0.5 g/L、 维生素 K2 2 g/L、 碳酸钙 10 g/L、 K2HPO4 2 g/L、 MgSO47H2O 0.58 g/L、 MnSO4H2O 0.25 g/L、 Tween-80 1ml/L, pH 值 为6.4, 121灭菌15分钟 ； MRS固体培养基每升的组分及含量为: MRS液体培养基中加入 质量百分比 1.5% 琼脂粉 , pH 值为 6.4, 121灭菌 15 分钟。 8. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤五中。
15、 16S-23S rDNA 间隔区的序列鉴定是指， 菌株 WN5 的 16S-23S rDNA 间隔区的核苷酸 序列与植物乳杆菌 WCFS1（AL935263） 的同源性最高， 其同源性为 98% ； 菌株 SN3 的 16S-23S rDNA 间隔区的核苷酸序列与干酪乳杆菌 W56（HE970764） 的同源性最高， 其同源性为 97%。 9. 根据权利要求 2 所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤五中菌株的生物学特性鉴定是指， 菌株 WN5 为革兰氏阳性菌， 菌落乳白色、 菌落表面光 滑、 细胞呈杆状、 生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶。
16、阴性、 过氧化氢酶阴性、 最适碳源葡萄糖、 最适无机磷盐 K2HPO4； 菌株 SN3 为革兰氏阳性菌， 菌落乳白色、 菌落表面 光滑、 细胞呈短杆状、 生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶阴性、 过氧化氢酶阴 权 利 要 求 书 CN 103333829 A 3 3/3 页 4 性、 最适碳源葡萄糖、 最适无机磷盐 Na2HPO4。 权 利 要 求 书 CN 103333829 A 4 1/9 页 5 一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物添加剂的制备方法， 尤其涉及一种高水分苜蓿青贮菌剂活 性成分的制备方法。 背景技术 0002。
17、 随着养殖业的不断发展以及粮食价格的攀升 , 开发品质优良、 安全价廉的牧草饲 料已成为转变养殖业经济增长方式的内在需求。苜蓿是草食动物优质的饲草 , 其主要产品 是干草 , 但这种产品制作时常受到淋雨、 落叶、 价格昂贵的烘干设备以及消耗大量能源等 问题的困扰， 苜蓿青贮不仅可以免受以上困扰 , 还可减少养分损失以保持青绿饲料的营养 特性。 0003 因此， 很多技术公开了苜蓿青贮的方法， 但由于苜蓿自身的营养特征和菌落特征 导致现有公开的技术或方法中苜蓿青贮的效果不理想， 主要问题在于 ： 一、 一部分技术要求 青贮时， , 需要苜蓿萎蔫或晾晒至 65% 以下的含水量 , 这种含水量的要求。
18、将导致面临收获 的雨季苜蓿无法进行青贮 ； 二、 苜蓿自身附有大量的酵母菌和少量的乳酸菌， , 苜蓿在青贮 过程中需要使用繁殖快、 抑菌强的乳酸菌添加剂， 但添加乳酸菌剂的苜蓿青贮品在饲喂动 物时将进入食物链， 降低抗生素抗性的风险 , 需评价乳酸菌剂的抗生素抗性 , 即乳酸菌剂 对抗生素的敏感性试验。 鉴于上述苜蓿青贮用乳酸菌添加剂存在的问题以及苜蓿青贮时的特征 , 现有技术不 能同时完成对高水分含量苜蓿进行青贮 , 同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助 青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患的问题。 发明内容 0004 为解决现有技术中的不足， 本发明目的在于提供一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成 。
19、分的制备方法。 0005 本发明为达到上述目的， 所采用的技术手段是 ： 一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成 分的制备方法， 其活性成分为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)WN5 和干酪乳杆菌 SN3(Lactobacillus casei)。 0006 上述活性成分的制备方法是 ： 一、 菌株的分离和纯化 ： 收集淤泥的浸出液， 按体积比 1:10 的比例加入到无菌水中混 匀， 连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37厌氧培养 48h ； 挑取透明圈较大的单菌落， 在 MRS 固体培养基上连续划线 3 次得到纯的单菌落 ； 挑取 单菌落于。
20、没有添加碳酸钙的 MRS 液体培养基中 , 观察是否产气 , 产气菌株为异型发酵乳酸 菌 , 不产气菌株为同型发酵乳酸菌 ； 共分离出 175 个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株 ； 这 些菌株接入 MRS 液体培养基中 , 37厌氧培养 20h, 取其中的 700 微升菌液并加入 300 微 升灭菌甘油 , 然后混匀 ,-20冻存 ； 二、 抑酵母试验 ： 取出 -20条件下保存的乳酸菌 , 取 5 微升注入 MRS 固体培养基上涂 说 明 书 CN 103333829 A 5 2/9 页 6 布, 在温度37的条件下培养1214h ； 用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种 于装有 5m。
21、lMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h， 得到活化的乳 酸菌 ； 按 1% 的接种量 , 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙 MRS 液体培养基的 250ml 三角瓶 中 , 装液量为 100ml， 37培养 16 18h, 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 0.993 1010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获得抑菌物一 ； 按 1% 的接种量 , 将 活化的乳酸菌接入装有 MRS 液体培养基的 250 ml 三角瓶中 , 装液量为 100 ml ； 37培养 16 18h, 此时 , 每毫升 MRS 液体。
22、培养基中至少含有 1.01010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获得抑菌物二 ； 将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于 YPD 液体培养 基中 28静止培养 48h 得到酵母菌培养液 ； 双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌 能力， 双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力 ； 三、 菌株的药敏试验 ： 制备不同浓度的抗生素滤纸片， 培养乳酸菌， 采用滤纸片扩散法 测定乳酸菌的药敏性， 得到 6 株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株 ； 四、 菌株的共同培养试验 ： 取出 -20条件下保存的 6 株乳酸菌进行活化， 将活化的。
23、 6 株乳菌液按 cfu 比 1:1 的比例混合， 得到进行菌株共同培养的种子液 , 按 1% 的接种量 , 将 混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的 MRS 液体培养基， 37静止培养 , 间隔 1 天测菌 液浓度和培养基 pH 值 , 连续测定 7 天， 菌株 WN5 和 SN3 的组合表现出最好的增殖优势和存 活优势 ； 五、 菌株的鉴定 ： 将上述步骤筛选得到的菌株 WN5 和 SN3 分别进行生物学特性和 16S-23S rDNA 间隔区序列鉴定。 0007 进一步的， 步骤五中菌株的生物学特性鉴定是指， 菌株 WN5 为革兰氏阳性菌， 菌落 乳白色、 菌落表面光滑、 细胞呈杆状、 。
24、生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶阴 性、 过氧化氢酶阴性、 最适碳源葡萄糖、 最适无机磷盐 K2HPO4； 菌株 SN3 为革兰氏阳性菌， 菌 落乳白色、 菌落表面光滑、 细胞呈短杆状、 生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶 阴性、 过氧化氢酶阴性、 最适碳源葡萄糖、 最适无机磷盐 Na2HPO4。 0008 进一步的， 步骤五中 16S-23S rDNA 间隔区的序列鉴定是指， 菌株 WN5 的 16S-23S rDNA 间隔区的核苷酸序列与植物乳杆菌 WCFS1 （AL935263） 的同源性最高， 其同源性为 98% ； 菌株 SN3 的 16S-。
25、23S rDNA 间隔区的核苷酸序列与干酪乳杆菌 W56（HE970764） 的同源性最 高， 其同源性为 97%。 0009 进一步的， 步骤二中双层琼脂平板打孔法测定是指， 将 20ml 的 MRS 固体培养基注 入直径 25cm 的培养皿中 , 冷却 1h ； 取 6mL 酵母菌培养液加到 100ml 冷却至 45的 YPD 半 固体培养基中， 摇匀， 并迅速倒在底层MRS培养基上 ； 在底层MRS培养基的上面、 间隔相等距 离处放置 3 个被剪短的 lml 移液器 Tip 头 ； 该被剪短 Tip 头的高为 1cm, 直径为 0.9cm ； 冷 却注入的 YPD 半固体培养基 , 时间。
26、为 1h, 此时 , 制成双层培养基 ； 取出 Tip 头 , 制成用于 放置抑菌物的洞口 ； 取相同浓度的上述乳酸菌抑菌物一 , 体积数为 150 微升 , 加入其中两 孔中 ； 剩余一个作为对照 , 加入 150 微升的灭菌俄水 ； 37培养 48h, 测定和记录乳酸菌对 酵母菌的抑菌圈直径 ； 所述 YPD 液体培养基每升的组分及含量为 : 酵母粉 10 克， 蛋白胨 20 克， 葡萄糖 20 克 ； 所述 YPD 半固体培养基每升的组分及含量为 : 酵母粉 10 克， 蛋白胨 20 克， 葡萄糖 20 克 ,0.7% 的琼脂粉。 0010 进一步的， 步骤三中制备不同浓度的抗生素滤纸片。
27、是指， 将链霉素、 环丙沙星和庆 说 明 书 CN 103333829 A 6 3/9 页 7 大霉素均配置成80 g/ml、 320g/ml和1280g/ml的三个浓度梯度， 阿莫西林、 红霉素和头 孢拉定均配置成 0.625 g/ml、 20g/ml 和 80g/ml 的三个浓度梯度， 以滤纸制备直径为 0.6cm 的圆形滤纸片 , 将它们放入上述抗生素溶液中 , 得到不同浓度的抗生素滤纸片 ； 进一步的， 所述步骤三中培养乳酸菌是指， 取出-20条件下保存的乳酸菌,取 5微升 注入 MRS 固体培养基上 , 涂布 , 在温度 37的条件下培养 12 14h， 用接种环挑取 MRS 固 体。
28、培养基上的单菌落,接种于装有5mlMRS培养基的10ml试管中,在温度37的条件下培 养 16 18h 得到活化的乳酸菌， 将活化的乳酸菌按 1% 的接种量接入装有 MRS 液体培养基 的 250ml 三角瓶中 , 装液量为 100ml, 37培养 16 18h, 得到乳酸菌液 , 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 0.993 1010 cfu 乳酸菌， 用无菌水稀释每毫升乳酸菌的菌液 浓度为 1.5 108 cfu。 0011 进一步的， 步骤四中乳酸菌的活化是指， 将 20ml 的不添加碳酸钙的 MRS 固体培养 基注入直径 25cm 的培养皿中 , 冷却 1h， 吸取 10。
29、0 微升的每毫升浓度为 1.5 108 cfu 的 乳酸菌液于培养基中央涂板， 取 4 张滤纸片 , 这 4 张滤纸片分别为 3 张同种抗生素但浓度 不同的抗生素滤纸片 , 第 4 张滤纸片为不含抗生素的对照， 待琼脂表面吸收乳酸菌后 , 贴 间隔均匀适中的上述4张滤纸片于每个培养皿的琼脂表面， 静置 5分钟后,翻转平皿， 37 静止培养 24h, 测定和记录抗生素对乳酸菌的抑菌圈直径。 0012 进一步的， 上述步骤中使用的 MRS 液体培养基每升的组分及含量为 : 蛋白胨 10 g/L、 酵母粉 5 g/L、 葡萄糖 10 g/L、 蔗糖 15 g/L、 牛肉膏 10 g/L、 柠檬酸氢二。
30、铵 2 g/L、 乙酸钠 5 g/L、 丙酮酸钠 0.18 g/L、 L- 光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、 血红素 0.5 g/L、 维生 素 K2 2 g/L、 碳酸钙 10 g/L、 K2HPO4 2 g/L、 MgSO47H2O 0.58 g/L、 MnSO4H2O 0.25 g/L、 Tween-80 1ml/L, pH值为6.4, 121灭菌15分钟 ； MRS固体培养基每升的组分及含量为: MRS 液体培养基中加入质量百分比 1.5% 琼脂粉 , pH 值为 6.4, 121灭菌 15 分钟。 0013 本发明有益效果在于 ： 通过上述五步制造的活性成分制造的菌剂对高水分苜蓿青。
31、 贮时， 高水分苜蓿水分含量高达 81.7%， 青贮时间达到 240 天， 青贮后的苜蓿的茎叶完整保 存于植株上、 含水量与青贮前相差很少， 蛋白质含量还有所提高 ； 同时提高青贮剂的抑菌效 果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患。 具体实施方式 0014 下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和生物材料， 如无特殊说 明， 均可从商业途径获得 ； 所述百分含量或浓度， 如无特殊说明均为质量百分数。 0015 下述实施例中所用的培养基如下 ： MRS 液体培养基每升的组分及含量为 : 蛋白胨 10 g/L、 酵母粉5 g/L、 葡萄糖 10 g/L、 蔗糖 15 。
32、g/L、 牛肉膏 10 g/L、 柠檬酸氢二铵 2 g/ L、 乙酸钠 5 g/L、 丙酮酸钠 0.18 g/L、 L- 光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、 血红素 0.5 g/L、 维生 素 K2 2 g/L、 碳酸钙 10 g/L、 K2HPO4 2 g/L、 MgSO47H2O 0.58 g/L、 MnSO4H2O 0.25 g/L、 Tween-80 1ml/L, pH值为6.4, 121灭菌15分钟 ； MRS固体培养基每升的组分及含量为: 上述的 MRS 液体培养基中加入 1.5% 琼脂粉 ( 质量百分比 ), pH 值为 6.4, 121灭菌 15 分 钟。 0016 实施例 1。
33、 1、 菌株的分离和纯化 ： 说 明 书 CN 103333829 A 7 4/9 页 8 收集青岛胜利桥附近淤泥的浸出液按体积比 1:10 的比例加入到无菌水中混匀进行连 续稀释 , 将各个稀释度的菌液 100 微升分别涂布在 MRS 固体培养基中 ,37厌氧培养 48h ； 挑取透明圈较大的单菌落在 MRS 固体培养基上连续划线 3 次得到纯的单菌落 ； 挑取单菌落 于没有添加碳酸钙的 MRS 液体培养基中 , 观察是否产气 , 产气菌株为异型发酵乳酸菌 , 不 产气菌株为同型发酵乳酸菌 ； 共分离出 175 个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株 ； 这些菌株 接入 MRS 液体培养基中 , 3。
34、7厌氧培养 20h, 取其中的 700 微升菌液并加入 300 微升灭菌 甘油 , 然后混匀 , 放入 -80冰箱中冻存 ； 2、 抑酵母试验 ： 乳酸菌的活化 : 取出 -20条件下保存的乳酸菌 , 取 5 微升注入 MRS 固体培养基上 , 涂布, 在温度37的条件下培养1214h ； 用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接 种于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h 得到活化的 乳酸菌 ； 按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶 中 , 装液量为 100ml， 37培养 16 18h, 此时。
35、 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 0.993 1010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获得抑菌物一 ； 按 1% 的接种量 , 将 活化的乳酸菌接入装有 MRS 液体培养基的 250 ml 三角瓶中 , 装液量为 100 ml ； 37培养 16 18h, 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有 1.01010 cfu 乳酸菌 ； 5000 转离心 5min, 收集上清液 , 获得抑菌物二 ； 酵母菌的液体培养 : 将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于 YPD 液体培养基中 28 静止培养 48h ； 双层琼脂平板打孔。
36、法测定上述抑菌物一的抑菌能力 : 将 20ml 的 MRS 固体培养基注入 直径 25cm 的培养皿中 , 冷却 1h ； 取 6mL 酵母菌培养液加到 100ml 冷却至 45的 YPD 半固 体培养基中， 摇匀， 并迅速倒在底层MRS培养基上 ； 在底层MRS培养基的上面、 间隔相等距离 处放置 3 个被剪短的 lml 移液器 Tip 头 ； 该被剪短 Tip 头的高为 1cm, 直径为 0.9cm ； 冷却 注入的 YPD 半固体培养基 , 时间为 1h, 此时 , 制成双层培养基 ； 取出 Tip 头 , 制成用于放 置抑菌物的洞口 ； 取相同浓度的上述乳酸菌抑菌物一 , 体积数为 1。
37、50 微升 , 加入其中两孔 中 ； 剩余一个作为对照 , 加入 150 微升的灭菌俄水 ； 37培养 48h, 测定和记录乳酸菌对酵 母菌的抑菌圈直径 ； 双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力 : 将 20ml 的 MRS 固体培养基注入 直径 25cm 的培养皿中 , 冷却 1h; 取 6mL 酵母菌培养液加到 100ml 冷却至 45的 YPD 半固 体培养基中， 摇匀， 并迅速倒在底层 MRS 培养基上 ; 在底层 MRS 培养基的上面、 间隔相等距 离处放置 3 个被剪短的 lml 移液器的 Tip 头 ; 该被剪短 Tip 头的高为 1cm, 直径为 0.9cm; 冷却注入。
38、的 YPD 半固体培养基 1h, 制成双层培养基 ; 此时 , 取出 Tip 头 , 制成用于放置抑 菌物的孔洞 ; 取相同浓度的上述乳酸菌抑菌物 2, 体积数为 150 微升 , 加入其中两孔中 ; 剩余一个作为对照,加入150微升的水;37培养48h,测定和记录乳酸菌对酵母菌的抑菌 圈直径 ； 上述酵母菌的液体培养基中 , 所述 YPD 液体培养基每升的组分及含量为 : 酵母粉 10 克， 蛋白胨 20 克， 葡萄糖 20 克 ； 上述酵母菌培养液加到 100ml 冷却至 45的 YPD 半固体培养基中 , 所述 YPD 半固体 培养基每升的组分及含量为 : 母粉 10 克， 蛋白胨 20。
39、 克， 葡萄糖 20 克 ,0.7% 的琼脂粉 ； 说 明 书 CN 103333829 A 8 5/9 页 9 3、 菌株的药敏试验 ： 抗生素滤纸片浓度的制备 : 将链霉素、 环丙沙星和庆大霉素均配置成 80g/ml、 320g/ml和1280g/ml的三个浓度梯度;阿莫西林、 红霉素和头孢拉定均配置成0.625 g/ ml、 20g/ml 和 80g/ml 的三个浓度梯度 ; 以生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司的 F4-1 滤纸 制备直径为 0.6cm 的圆形滤纸片 , 将它们放入上述抗生素溶液中 , 得到不同浓度的抗生素 滤纸片 ； 乳酸菌的培养 : 取出 -20条件下保存的乳酸菌。
40、 , 取 5 微升注入 MRS 固体培养基上 , 涂布, 在温度37的条件下培养1214h;用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接 种于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h 得到活化的 乳酸菌 ; 将活化的乳酸菌按 1% 的接种量接入装有 MRS 液体培养基的 250ml 三角瓶中 , 装 液量为 100ml, 37培养 16 18h, 得到将用于下述试验的乳酸菌液 , 此时 , 每毫升 MRS 液体培养基中至少含有0.993 1010 cfu乳酸菌;用无菌水稀释每ml乳酸菌的菌液浓度 为 1.5 108 cfu。 0017 滤纸片扩散。
41、法测定上述乳酸菌的药敏性 : 将 20ml 的不添加碳酸钙的 MRS 固体培 养基注入直径25cm的培养皿中,冷却1h; 吸取100微升的每ml浓度为1.5 108 cfu的 乳酸菌液于培养基中央， 涂板 ; 取 4 张滤纸片 , 这 4 张滤纸片分别为 3 张同种抗生素但浓 度不同的抗生素滤纸片 , 第 4 张滤纸片为不含抗生素的对照 ; 待琼脂表面吸收乳酸菌后 , 贴间隔均匀适中的上述 4 张滤纸片于每个培养皿的琼脂表面 ; 静置 5 分钟后 , 翻转平皿， 37静止培养 24h, 测定和记录抗生素对乳酸菌的抑菌圈直径 . 结果得到 6 株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株 . 4、 。
42、菌株的共同培养试验 . 乳酸菌的活化 : 取出 -20条件下保存的上述 6 株乳酸菌 , 取 5 微升注入 MRS 固体培 养基上 , 涂布 , 在温度 37的条件下培养 12 14h; 用接种环挑取 MRS 固体培养基上的 单菌落 , 接种于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h 得到活化的乳酸菌 ; 此时 , 每 mlMRS 液体培养基中至少含有 0.893 1010 1.231 x 1010 cfu 乳酸菌 . 乳酸菌的共同培养: 将上述培养的6株乳菌液按cfu比为1:1的比例进行混合得到进 行菌株共同培养的种子液 , 按 1% 的接种。
43、量 , 将混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的 MRS 液体培养基， 37静止培养 , 间隔 1 天测菌液浓度和培养基 pH 值 , 连续测定 7 天 . 菌株 WN5 和 SN3 的组合表现出最好的增殖优势和存活优势 , 第 1 天时 , 每 ml 菌液浓 度至少为 0.993 1010cfu、 pH 值为 4.5; 第 2 天时 , 每 ml 菌液浓度至少为 0.907 1010cfu, pH 值为 3.5; 第 3 天时 , 每 ml 菌液浓度至少为 0.902 1010 cfu, pH 值为 4.0; 第 4 天时 , 每 ml 菌液浓度至少为 0.839 1010cfu, pH 值为。
44、 4.5; 第 5 天时 , 每 ml 菌液 浓度至少为 0.827 1010cfu, pH 值为 4.5; 第 6 天时 , 每 ml 菌液浓度至少为 0.832 1010cfu, pH 值为 4.5; 第 6 天时 , 每 ml 菌液浓度至少为 0.842 1010cfu, pH 值为 4.5; 这说明菌株的共同培养 , 促进了菌体生长 , 显著提高了菌体密度和菌株存活能力 . 5、 菌株的鉴定 将上述步骤筛选得到的乳酸菌 WN5 和 SN3 分别进行生物学特性和 16S-23S rDNA 间隔 区序列鉴定 . 说 明 书 CN 103333829 A 9 6/9 页 10 菌株的生物学特。
45、性 : 菌株 WN5 为革兰氏阳性菌、 菌落乳白色、 菌落表面光滑、 细胞呈杆 状、 生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶阴性、 过氧化氢酶阴性、 最适碳源 葡萄糖、 最适无机磷盐 K2HPO4; 菌株 SN3 为革兰氏阳性菌、 菌落乳白色、 菌落表面光滑、 细胞 呈短杆状、 生长温度 10 45、 最适温度 32 38、 接触酶阴性、 过氧化氢酶阴性、 最 适碳源葡萄糖、 最适无机磷盐 Na2HPO4。 0018 16S-23S rDNA 间隔区的序列 ： 菌株 WN5 的 16S-23S rDNA 间隔区的核苷酸序列与 植物乳杆菌 WCFS1（AL935263） 的同源性。
46、最高， 其同源性为 98% ； 菌株 SN3 的 16S-23S rDNA 间隔区的核苷酸序列与干酪乳杆菌 W56（HE970764） 的同源性最高， 其同源性为 97%。 0019 基 于 以 上 特 征， 将 上 述 步 骤 1 筛 选 得 到 的 菌 株 WN5 鉴 定 为 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)， 将上述步骤 1 筛选得到的菌株 SN3 鉴定为干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)。上述三株菌均已于 2013 年 04 月 12 日在北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生。
47、物中心保 藏， 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) WN5 的保藏号为 CGMCC NO. 7469, 干酪乳杆 菌 (Lactobacillus casei) SN3 的保藏号为 CGMCC NO. 7470。 0020 实施例 2 血红素和维生素 K2提高植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) WN5 CGMCC NO. 7469 和干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) SN3 CGMCC NO. 7470 的增殖密度 . 乳酸菌的活化 : 取出 -20条件下保存的上述实例 1 筛选得到的植物乳杆菌 (Lactobaci。
48、llus plantarum) WN5 CGMCC NO. 7469和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) SN3 CGMCC NO. 7470,分别取5微升注入MRS固体培养基上,涂布, 在温度37的条件下 培养 12 14h; 用接种环挑取 MRS 固体培养基上的单菌落 , 接种于装有 5mlMRS 培养基的 10ml 试管中 , 在温度 37的条件下培养 16 18h 得到活化的乳酸菌 , 此时， 每 mlMRS 液 体培养基中至少含有 0.993 1010cfu 乳酸菌 . 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum) WN5 CGMCC NO。
49、. 7469 和 干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus casei) SN3 CGMCC NO. 7470 的共同培养 : 将上述培养的两种乳杆菌液 按 cfu 比为 1:1 的比例进行混合得到进行菌株共同培养的种子液 , 按 10% 的接种量 , 将混 合后的上述种子液接种乳酸菌分别接种于不含碳酸钙的 MRS 液体培养基、 不含碳酸钙和维 生素 K2的 MRS 液体培养基以及不含碳酸钙、 血红素和维生素 K2的 MRS 液体培养基中， 37 静止培养 , 分别测定培养基在 16h 的菌体密度 . 试验设 3 次重复 ,3 次重复的平均值为最 终值 . 三种培养基的每 ml 菌体密度分别是 1.007 1010 cfu、 0.994 10。