一种无引物的基因合成方法.pdf

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1、10申请公布号CN104109683A43申请公布日20141022CN104109683A21申请号201410211672722申请日20140519C12N15/63200601C12N15/10200601C40B40/0620060171申请人武汉金开瑞生物工程有限公司地址430206湖北省武汉市东湖开发区高新大道858号生物医药园A7展示中心申请人湖北大学72发明人马立新沈鹤霄陈晚苹华权高张桂敏杨明波陈羽西74专利代理机构北京华沛德权律师事务所11302代理人刘杰54发明名称一种无引物的基因合成方法57摘要本发明公开了一种无引物的基因合成方法，属于基因的人工合成领域。本发明首先公开。

2、了一个PNEW载体质粒，其核苷酸序列为SEQIDNO33所示。本发明还公开了用PNEW载体质粒构建的包含有1638447个质粒的载体库。本发明进一步公开了一种无引物的基因合成方法，包括以下步骤1将待合成的目标基因DNA序列按照每个片段82BP进行分组；2将分组的片段分别在构建的质粒库中找到对应的质粒；3将对应的质粒酶切，用抗生素筛选，重构得到含82BP目的基因序列的质粒；4通过金门克隆反应将基因片段拼接成完整的目的基因。本发明基因合成方法不需要利用引物，合成成本低，突变率极其低，准确率高，可以合成诸如高度重复序列、POLYA等特殊的基因序列，操作简单，能实现自动化操作。51INTCL权利要求书。

3、1页说明书9页序列表17页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表17页附图2页10申请公布号CN104109683ACN104109683A1/1页21合成基因用的PNEW载体质粒，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO33所示。2一种构建权利要求1所述PNEW载体质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤构建核苷酸序列为SEQIDNO21所示的线性载体骨架PNEW；扩增核苷酸序列为SEQIDNO27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列为SEQIDNO32所示的3KCGS；将线性载体骨架PNEW、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆。

4、到一个完整的载体上，即得。3用权利要求1所述的PNEW载体质粒构建得到的载体库。4按照权利要求3所述的载体库，其特征在于包含有16384个质粒。5按照权利要求4所述的载体库，其特征在于载体库中的每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。6一种无引物的基因合成方法，其特征在于，包括以下步骤1将预合成的目标基因DNA序列进行分组；2将依次命名的小片段分别在权利要求3所述的质粒库中找到对应的质粒；其中，每个82BP的片段需要16个带有7BP碱基的质粒；3将查找得到的对应的质粒分别用AGEI、BSGI和XMAI、BSERI酶切，用KANA卡纳霉素抗生素进行遗传筛选，得到含12BP目的基因序列的质。

5、粒；将对应的质粒分别用BSGI、SALI和BSERI、XHOI酶切，用相应的CAM氯霉素抗生素进行遗传筛选，得到含22BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、BAMHI和BSERI、BGLII酶切，用相应的GEM庆大霉素抗生素进行遗传筛选，得到含42BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、SPEI和BSERI、XBAI酶切，用相应的SPC壮观霉素抗生素进行遗传筛选，得到含82BP目的基因序列的质粒；4要合成大于82BP以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒PUCKANA，做金门克隆反应，通过金门克隆反应能够将。

6、基因片段拼接成完整基因。7按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于预合成的目的基因按每个片段82BP进行分组。8按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于目的基因分组后的每个片段之间有3个碱基的重复。9按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于金门克隆受体载体PUCKANA有GFP表达盒式结构和KANA抗性基因。10按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于如果目的基因比较大，则进行第二轮金门克隆以合成较大片段的目的基因直至合成所需要的目的基因。权利要求书CN104109683A1/9页3一种无引物的基因合成方法技术领域0001本发明涉及一种基因合成方法，尤其涉及一种基于库的无引物基。

7、因合成方法，属于基因合成技术领域。背景技术0002近年来合成生物学，特别是基因合成技术的研究进展非常迅速。目前，全基因合成是依照某一蛋白质的核苷酸序列，首先设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长的基因序列，在此基因合成过程中无需模板，是目前获取基因的有效手段之一。0003迄今为止，已经报道的基因合成方法都是依赖于化学合成的寡核苷酸引物，主要包括以下几种方法1化学合成法，由于化学合成法的原理本身存在着一定程度的缺陷，这些缺陷决定了化学法合成的DNA片段不可能太长，化学合成法主要用于寡核苷酸的合成；2PCR介导的合成方法，这种方法可以合成大的DNA片段，而且周期也比较短，。

8、但PCR介导的合成方法错误率比较高，对于合成大于2KB以上的DNA其错误率更高，因此为了得到大的DNA片段的正确克隆，可能需要多次克隆和测序的重复工作，这样会额外的增加基因合成的成本，而且由于是PCR介导的方法，需要DNA高温聚合酶和DNTP等试剂，这样也会增加基因合成的成本；3非PCR介导的方法，到目前为止报道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技术。这种固相合成技术，其合成的错误率大大降低，但是由于在合成过程中需要使用经过特殊修饰的引物，这样就会导致引物的成本增加，从而导致后续基因合成的成本增加。同时，固相合成技术依赖特殊的仪器设备，无法满足普通实验室和科研单位的需求。00。

9、04随着合成生物学的研究进展，特别是基因合成技术方法研究的不断深入，目前急需开发一种新的基因合成方法，建立一种能够以相对低廉的价格，在短时间内准确和高效的合成长片段基因的方法，以解决现有基因合成技术中存在的错误率高，合成成本高等问题。发明内容0005本发明的主要目的是提供一种无引物的基因合成方法；0006为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于基因合成用的PNEW载体质粒；其核苷酸序列为SEQIDNO33所示；0007本发明进一步提供了一种构建所述PNEW载体质粒的方法，该方法包括00081构建获得核苷酸序列为SEQIDNO21所示的线性载体骨架PNEW；00092扩增核苷酸序列为SEQIDN。

10、O27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列为SEQIDNO32所示的3KCGS；00103将线性载体骨架PNEW、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一个完整的载体上，即得所述PNEW载体质粒。说明书CN104109683A2/9页40011本发明以PET23A质粒为模版，以ORIPF/ORIPR为引物，通过PCR扩增得到线性载体骨架PNEW19KB，其核苷酸序列为SEQIDNO21所示；在PCR过程中通过引物ORIPR引进限制性内切酶BSERI的识别位点。0012本发明分别以质粒RNALIC、PDEST32、PET28B和PET23A为模板，设计引物，通过PCR扩增5S。

11、PC片段656BP、5GEM片段535BP、5CAM片段371BP、5KANA片段556BP和AMP盒式结构969BP，扩增的上述片段5或3端分别引入了适宜的限制性酶切位点；每个片段之间都引入了1820BP的同源序列，再把这几个片段逐次做重叠延伸PCR，即通过引物5SPCPF和5GEMPR扩增将5SPC片段和5GEM片段连接；通过引物5SPCPF和5CAMPR扩增将5SPC5GEM片段与5CAM片段连接；通过引物5SPCPF和5KANAPR扩增将5SPC5GEM5CAM片段与5KANA片段连接；通过引物5SPCPF和AMPPR扩增将5SPC5GEM5CAM5KANA片段与AMP盒式结构连接得到。

12、一个大片段5SGCK3KB，其核苷酸序列为SEQIDNO27所示。0013本发明分别以质粒PET28B、PDEST32和RNALIC为模板，设计引物，通过PCR扩增3KANA片段531BP、3CAM片段566BP、3GEM片段279BP和3SPC片段387BP，扩增的上述片段5或3端分别引入了适宜的限制性酶切位点；每个片段之间都引入了1820BP的同源序列，再把这几个片段逐次做重叠延伸PCR，即通过引物3KANAPF和3CAMPR扩增将3KANA片段和3CAM片段连接；通过引物3KANAPF和3GEMPR扩增将3KANA3CAM片段与3GEM片段连接；通过引物3KANAPF和3SPCPR扩增将。

13、3KANA3CAM3GEM片段与3SPC片段连接得到一个大片段3KCGS17KB，其核苷酸序列为SEQIDNO32所示。0014通过无酶克隆的方式ZHUD,ZHONGX,TANR,CHENL,HUANGG,LIJ,ETALHIGHTHROUGHPUTCLONINGOFHUMANLIVERCOMPLETEOPENREADINGFRAMESUSINGHOMOLOGOUSRECOMBINATIONINESCHERICHIACOLIJANALBIOCHEM2010；3972162167把3个片段线性载体骨架PNEW、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的。

14、PNEW载体质粒，其核苷酸序列为SEQIDNO33所示，命名为PNEW载体质粒。0015本发明进一步用获得的PNEW载体质粒构建一个包含有1638447个质粒的载体库，该载体库中的每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。0016因此，本发明进一步提供一个载体库，该载体库用PNEW载体质粒构建得到，该载体库中包含有1638447个质粒，每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。0017本发明进一步提供了一种应用所述的载体库合成目的基因的方法，该方法包括以下步骤00181将预合成的目标基因DNA序列按照每个片段82BP进行划分，各个片段从头至尾依次进行命名为G1、G2、G3、G4、G。

15、5，每个片段之间有3个碱基的重复。00192根据依次命名的G1、G2等小片段的序列分别在所构建的7BP质粒库中找到对应的质粒，每个82BP的片段需要16个带有7BP碱基的质粒；00203将查找得到的对应的质粒分别用AGEI、BSGI和XMAI、BSERI酶切，用KANA卡纳霉素抗生素进行遗传筛选，得到含12BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、SALI和BSERI、XHOI酶切，用相应的CAM氯霉素抗生素进行遗传筛选，得到含22BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、BAMHI和BSERI、BGLII酶切，用相应的GEM庆大霉素抗生素进行遗传筛选，得到含42BP目的基。

16、因序列的质粒；将对应的质粒分说明书CN104109683A3/9页5别用BSGI、SPEI和BSERI、XBAI酶切，用相应的SPC壮观霉素抗生素进行遗传筛选，得到含82BP目的基因序列的质粒；00214要合成大于82BP以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒PUCKANA，做金门克隆反应，通过金门克隆反应能够将基因片段拼接成完整基因；如果目的基因比较大，则进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段的目的基因。0022本发明方法中合成的含82BP目的基因序列的质粒XG1、XG2、XG3、XG4、XG5为壮观霉素抗性，同时所构建的金门克隆受。

17、体载体PUCKANA有GFP表达盒式结构，受体质粒转化大肠杆菌菌落是发光的，而且PUCKANA受体载体是KANA抗性，与供体质粒的抗性不一样，所以最后转化所得重组子可以通过KANA抗性的正筛选作用和GFP的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列。由于在后期的金门克隆反应中只涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就不会突变，这样拼接准确率很高。0023本发明合成方法主要利用抗性基因重构的遗传筛选机制，从已构建好的含有7BP目的基因序列的质粒出发，质粒分别用AGEI、BSGI和XMAI、B。

18、SERI酶切，然后再用T4连接酶16连接处理，重构KANA抗性基因，转化后得到含12BP目的基因片段质粒。再依次重构CAM、GEM、SPC抗性基因，即将对应的质粒分别用BSGI、SALI和BSERI、XHOI酶切，用相应的CAM抗生素进行遗传筛选；将对应的质粒分别用BSGI、BAMHI和BSERI、BGLII酶切，用相应的GEM抗生素进行遗传筛选；将对应的质粒分别用BSGI、SPEI和BSERI、XBAI酶切，用相应的SPC抗生素进行遗传筛选。四轮重构后得到若干含82BP目的基因序列的质粒，最后以82BP供体质粒和PUCKANA受体载体做金门克隆反应ENGLER,C,RKANDZIA,ANDS。

19、MARILLONNET,AONEPOT,ONESTEP,PRECISIONCLONINGMETHODWITHHIGHTHROUGHPUTCAPABILITYPLOSONE,20083113647，通过金门克隆反应将基因片段拼接成完整的目的基因。如果目的基因比较大，可以进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段的目的基因。0024本发明的基因合成方法与现有的基因合成方法相比具有以下优点00251本发明方法不需要利用引物进行基因合成，只要构建好了包含任意7BP的载体库16384种就可以达到一劳永逸的效果，以后合成基因都可以不用合成引物，合成成本低。00262突变率极其低。由于整个合成过程是从质粒出发，只。

20、是经过酶切酶连等操作，没有常规DNA合成方法中引物引进的突变，而且没有经过PCR过程，所以突变率极低，甚至为零。00273本发明合成方法在整个过程都是进行的酶切酶连操作，没有引进PCR等操作，而且利用抗性重构的原理，用重构的相应抗生素进行遗传筛选，准确率高，无需测序，进一步降低成本。00284本发明合成方法可以合成特殊的基因序列，如高度重复序列，POLYA等POLY序列，可以用于研究一些复杂结构或一些调控序列的机理，由于该方法是从质粒出发，酶切酶连，不需要PCR，可以合成PCR方法不能合成的高度重复序列。00295本发明合成方法操作简单，酶切产物可以直接连接转化，无需纯化。由于是通说明书CN1。

21、04109683A4/9页6过抗性基因这个遗传因素来筛选，在加入相应抗生素后，只有重构出相应抗性的转化子才能生长起来，而那些没有酶切的质粒或者连接错误的产物由于不能得到完整的抗性基因，不能在加有抗生素的培养基中生长。00306本发明合成方法可以实现自动化操作。由于筛选是用抗性基因筛选，不需要涂平板等操作，故可以进行溶液操作，从而实现自动化。00317本发明合成方法有利于构建突变体文库，对于做定点诱变和定向进化效率非常高，筛选工作量比现有的构建突变体库的方法可以降低23个数量级。0032本发明所涉及到的术语定义0033除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术。

22、人员通常所了解相同的含义。0034术语“载体”意指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。0035术语“质粒”意指一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子。0036术语“基因”意指遗传的基本单元，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。0037术语“抗性基因”意指抗性的遗传因子，如KANA抗性基因。0038术语“重叠延伸PCR”意指由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。0039术语“基因序列”意指使用一串字母。

23、表示的真实的或者假设的携带基因信息的DNA分子的一级结构。0040术语“酶切”意指用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶具有专一性，一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向切割的目的。0041术语“DNA测序”意指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C与鸟嘌呤的G排列方式。附图说明0042图1为载体PNEW的构建过程。0043图2为利用重构抗性基因合成82BP片段的过程。0044图3为以82BP供体质粒和PUCKANA受体载体做金门克隆反应的原理和流程图。具体实施方式0045下面结合具体实施例来进一步描述本发。

24、明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0046实验材料0047商品化的PET23A、PET28B和PDEST32均购于INVITROGEN公司。说明书CN104109683A5/9页70048实施例1构建PNEW载体质粒00491、构建线性载体骨架PNEW0050以商品化载体PET23A质粒为模板，以ORIPF/ORIPR为引物序列见表1，通过PCR扩增得到线性载体骨架PNEW19KB。

25、其核苷酸序列为SEQIDNO21所示，在PCR过程中通过引物ORIPR引进限制性内切酶BSERI的识别位点。00512、构建大片段5SGCK0052设计引物5SPCPF/5SPCPR序列见表1，以RNALIC质粒为模板，通过PCR扩增得到5SPC片段656BP其核苷酸序列为SEQIDNO22所示，扩增好的5SPC片段5和3端分别带上了限制性酶切位点BSGI和XBAI；设计引物5GEMPF/5GEMPR序列见表1，以PDEST32质粒为模板，通过PCR扩增得到5GEM片段535BP其核苷酸序列为SEQIDNO23所示，扩增好的5GEM片段3端带上了限制性酶切位点BGLII；设计引物5CAMPF/。

26、5CAMPR序列见表1，以PDEST32质粒为模板，通过PCR扩增得到5CAM片段371BP其核苷酸序列为SEQIDNO24所示，扩增好的5CAM片段3端带上了限制性酶切位点XHOI；设计引物5KANAPF/5KANAPR序列见表1，以PET28B质粒为模板，通过PCR扩增得到5KANA片段556BP其核苷酸序列为SEQIDNO25所示，扩增好的5KANA片段3端带上了限制性酶切位点XMAI；设计引物AMPPF/AMPPR序列见表1，以PET23A质粒为模板，通过PCR扩增得到AMP盒式结构969BP其核苷酸序列为SEQIDNO26所示；每个扩增的片段之间都引入了1820BP的同源序列，再把这。

27、几个片段通过5SPCPF和AMPPR引物逐次做重叠延伸PCROVERLAPEXTENSIONPCR，即通过引物5SPCPF和5GEMPR扩增将5SPC片段和5GEM片段连接；通过引物5SPCPF和5CAMPR扩增将5SPC5GEM片段与5CAM片段连接；通过引物5SPCPF和5KANAPR扩增将5SPC5GEM5CAM片段与5KANA片段连接；通过引物5SPCPF和AMPPR扩增将5SPC5GEM5CAM5KANA片段与AMP盒式结构连接得到一个大片段5SGCK3KB，其核苷酸序列为SEQIDNO27所示。00533、构建大片段3KCGS0054设计引物3KANAPF/3KANAPR序列见表1。

28、，以PET28B为模板，通过PCR扩增得到3KANA片段531BP其核苷酸序列为SEQIDNO28所示，扩增好的3KANA片段5端带上了限制性酶切位点AGEI；设计引物3CAMPF/3CAMPR序列见表1，以PDEST32为模板，通过PCR扩增得到3CAM片段566BP其核苷酸序列为SEQIDNO29所示，扩增好的3CAM片段5端带上了限制性酶切位点SALI；设计引物3GEMPF/3GEMPR序列见表1，以PDEST32为模板，通过PCR扩增得到3GEM片段279BP其核苷酸序列为SEQIDNO30所示，扩增好的3GEM片段5端带上了限制性酶切位点BAMHI；设计引物3SPCPF/3SPCPR。

29、序列见表1，以RNALIC为模板，通过PCR扩增得到3SPC片段387BP其核苷酸序列为SEQIDNO31所示，扩增好的3SPC片段5端带上了限制性酶切位点SPEI；每个片段之间都引入了1820BP的同源序列，再把这几个片段通过3KANAPF和3SPCPR引物逐次做重叠延伸PCROVERLAPEXTENSIONPCR，即通过引物3KANAPF和3CAMPR扩增将3KANA片段和3CAM片段连接；通过引物3KANAPF和3GEMPR扩增将3KANA3CAM片段与3GEM片段连接；通过引物3KANAPF和3SPCPR扩增将3KANA3CAM3GEM片段与3SPC片段连接得到一个大片段3KCGS17。

30、05BP，其核苷酸序列为SEQIDNO32所示。00554、构建PNEW载体质粒说明书CN104109683A6/9页80056通过无酶克隆的方式ZHUD,ZHONGX,TANR,CHENL,HUANGG,LIJ,ETALHIGHTHROUGHPUTCLONINGOFHUMANLIVERCOMPLETEOPENREADINGFRAMESUSINGHOMOLOGOUSRECOMBINATIONINESCHERICHIACOLIJANALBIOCHEM2010；3972162167把3个片段线性载体骨架PNEW、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的。

31、PNEW载体质粒其核苷酸序列为SEQIDNO33所示，命名为PNEW载体质粒构建过程见图1。0057表1载体PNEW构建中使用的引物0058说明书CN104109683A7/9页900590060实施例2目标基因的合成00611、质粒库的构建0062以实施例1构建好的PNEW载体，用PCR、反扩载体、无酶克隆常规的构建方法构建4716384种质粒库，该质粒库中的每个质粒任意包含有7个碱基对的任一排列组合序列。00632、目的基因的分析及分组0064选定待合成的目标基因X，将预合成的目标基因DNA序列按照每个片段82BP进行划分，各个片段从头至尾依次命名为G1、G2、G3、G4、G5，每个片段之。

32、间有3个碱基的重复。00653、库质粒的查找0066根据G1、G2等小片段的序列和质粒对应的编号的一一对应关系分别在建好的7BP质粒库中找到对应的质粒，每个82BP的片段需要16个带有7BP碱基的质粒。00674、若干含82BP目的基因序列质粒的获得0068将对应的质粒分别用BSGI、AGEI和BSERI、XMAI酶在37酶切3H，然后在65热处理10MIN后进行混合，然后再取5UL反应体系和T4LIAGSE，然后将反应体系在16连接30MIN后分别转化DH5大肠杆菌感受态细胞，最后在加有KANA抗生素的LB培养基中培养过夜，抽提质粒得到含12BP目的基因序列的质粒。然后再通过相应的酶切和同样。

33、的操作步骤，如此依次重构CAM、GEM和SPC抗性基因，即将对应的质粒分别用BSGI、SALI和BSERI、XHOI酶切，用相应的CAM抗生素进行遗传筛选，得到含22BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、BAMHI和BSERI、BGLII酶切，用相应的GEM抗生素进行遗传筛选，得到含42BP目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BSGI、SPEI和BSERI、XBAI酶切，用相应的SPC抗生素进行遗传筛选，最后得到含82BP目的基因序列的质粒。0069由于整个过程只有酶切酶连的操作，而起始质粒是正确的库质粒，所以通过抗性基因这种遗传因素筛选的重组子就是正确的，无需测序，分别命名为。

34、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5。00705、目的基因的拼接组装0071要合成大于82BP以上的DNA片段，需要用步骤4的XG1、XG2、XG3、XG4、XG5质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒PUCKANA，做金门克隆反应ENGLER,C,RKANDZIA,ANDSMARILLONNET,AONEPOT,ONESTEP,PRECISIONCLONINGMETHODWITHHIGHTHROUGHPUTCAPABILITYPLOSONE,20083113647，通过金门克隆反应能够将基因片段拼接成完整基因，具体过程见图4。如果目的基因比较大，可以进行第二轮金门克隆以达到合成较大片段。

35、的目的基因。0072合成的含82BP目的基因序列的质粒XG1、XG2、XG3、XG4、XG5为壮观霉素抗性，同时实验室构建的金门克隆受体载体PUCKANA有GFP表达盒式结构，受体质粒转化大肠杆菌菌落是发光的，而且PUCKANA受体载体是KANA抗性，与供体质粒的抗性不一样，所以最说明书CN104109683A8/9页10后转化所得重组子可以通过KANA抗性的正筛选作用和GFP的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列。由于在后期的金门克隆反应中只涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就。

36、不会突变，这样拼接准确率很高。0073如果目标基因DNA序列按照每个片段82BP进行划分，最后一段为16个碱基，这样的话可以把最后两个或者更多片段进行调整，不一定要以82BP的形式，从7BP到82BP之间是可以按照5个碱基差距随意组合，如12BP、17BP、22BP、27BP等。0074实验例1抗生物素蛋白AVIDIN的基因合成0075利用本发明的基因合成方法合成鸡GGALLUS来源的抗生物素蛋白AVIDIN的基因片段。0076抗生物素蛋白的合成过程包括以下步骤00771采用商品化的PUC19质粒以及PGSILGLIC质粒购于INVITROGEN公司通过PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规方法构。

37、建PUCKANA质粒载体。00782将目标基因AVIDIN的碱基序列438BP分成6个小段，每个小段分别命名为AV1、AV2、AV6，前5段各为82BP，第6段为42BP。然后，在已经构建好的16384个7BP的质粒库中找出对应的质粒，每个82BP的片段需要16个质粒，42BP的片段需要8个质粒。00793每组找出的16个质粒分别两两分组，并命名为A1B1，A2B2A8B8，每组质粒ANBN有2BP的重叠供连接用，AN质粒和BN质粒分别按照以下反应体系加入各组分。008000810082AN组和BN组反应体系都在37条件下反应3H。00834将上述酶切产物分别以对应的ANBN混合，并在65热失。

38、活10MIN，然后分别取5UL混合物加入T4LIAGSE，然后将反应体系在16连接30MIN后分别转化DH5大肠杆菌感受态细胞，转化产物分别接种在加有KANA抗生素的LB培养基中培养1216H，然后用常规方法抽提质粒，质粒分别对应命名为KA1、KA2KA8，这些质粒都含有12BP片段。00845将KA1、KA2KA8质粒两两分组根据抗性基因重构的顺序进行分组，每组质粒有2BP的重叠，这个是根据BSGI、BSERI酶决定的，这两个酶切后突出2个碱基的粘性末端，分别用SALI、BSGI和XHOI、BSERI酶组合酶切，重构CAM表达盒，用CAM抗生素进行筛选。反应体系和程序与步骤3类似，再重复步骤。

39、4后，就可以得到含有22BP片段的质粒。重复上述步骤，再重构GEM抗性基因，对应质粒分别用BSGI、BAMHI和BSERI、BGLII酶切，用相应的GEM抗生素进行遗传筛选，得到含有42BP片段的质粒；重构SPC抗性说明书CN104109683A109/9页11基因，对应质粒分别用BSGI、SPEI和BSERI、XBAI酶切，用相应的SPC抗生素进行遗传筛选。如此经过四轮重构后，最后得到含有82BP目的基因的质粒，分别命名为AV1、AV2AV5；AV6只有42BP，只需要重构3轮。00856将正确的质粒AV1、AV2AV6和实验室已经改造的载体PUCKANA按照以下体系和程序反应操作0086反。

40、应体系00870088反应程序00890090反应完成后的体系可取出，并保存在4条件下。取5UL反应产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂LBKANA的平板，37培养过夜，挑取不发光的菌落进行PCR和质粒大小鉴定，再送去测序，序列测定证明本发明合成方法所合成的基因序列是正确的全长AVIDIN基因序列。说明书CN104109683A111/17页1200010002序列表CN104109683A122/17页130003序列表CN104109683A133/17页140004序列表CN104109683A144/17页150005序列表CN104109683A155/17页160006序列表CN10。

41、4109683A166/17页170007序列表CN104109683A177/17页180008序列表CN104109683A188/17页190009序列表CN104109683A199/17页200010序列表CN104109683A2010/17页210011序列表CN104109683A2111/17页220012序列表CN104109683A2212/17页230013序列表CN104109683A2313/17页240014序列表CN104109683A2414/17页250015序列表CN104109683A2515/17页260016序列表CN104109683A2616/17页270017序列表CN104109683A2717/17页28序列表CN104109683A281/2页29图1说明书附图CN104109683A292/2页30图2图3说明书附图CN104109683A30。