一种防龋釉基质蛋白功能多肽及其制备方法和用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103421091 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421091 A *CN103421091A* (21)申请号 201310354537.3 (22)申请日 2013.08.15 C07K 7/08(2006.01) C07K 14/00(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61K 38/16(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 1/08(2006.01) (71)申请人 四川大学 地址 610064 四川省成都市武侯区一环路南 一段 24 号 (72)发明人 张凌琳 律雪苹 杨阳 周。

2、学东 李继遥 (74)专利代理机构 成都九鼎天元知识产权代理 有限公司 51214 代理人 李强 吴彦峰 (54) 发明名称 一种防龋釉基质蛋白功能多肽及其制备方法 和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种防龋釉基质蛋白功能多 肽及其制备方法和应用。该防龋多肽包含如 SEQIDNO.1 或 SEQIDNO.2 所示的氨基酸序列及 其盐或酯。本发明的多肽主要包含有 “QPX”的 诱导早期龋再矿化的氨基酸序列， 还可包含能 够与钙离子作用并引发 HA 成核的氨基酸序列 “TKREEVD” ， 该多肽分子量较小， 可提高在牙釉质 表面的吸附， 进而更好地发挥其作用， 促进早期脱 矿牙釉质 （早期龋）。

3、的再矿化， 合成方便， 经济实 惠， 效果较好且安全可靠。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103421091 A CN 103421091 A *CN103421091A* 1/1 页 2 1. 一种防龋釉基质蛋白功能多肽、 其药学上可接受盐或酯， 其特征在于 ： 所述多肽包 含如 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列。 2. 一种防龋釉基质蛋白功能多肽、 其药学上可接受盐或酯， 其特征在于 ： 所述多肽包 含如 SEQ I。

4、D NO.2 所示的氨基酸序列。 3. 一种防龋药物组合物， 其特征在于 ： 所述药物组合物包括如权利要求 1 或 2 所述的 防龋釉基质蛋白功能多肽、 其药学上可接受盐或酯以及药学上可接受的载体和 / 或辅料。 4. 如权利要求 3 所述的药物组合物， 其特征在于 ： 所述药物组合物为凝胶剂。 5. 权利要求 1 或 2 所述防龋釉基质蛋白功能多肽的制备方法， 其特征在于包括以下步 骤 ： 按照 SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列， 将第一个氨基被 Fmoc 保护的氨 基酸链接到固相载体Wang树脂上， 然后脱掉氨基保护基 ； 然后将氨基被Fmoc保护的第二。

5、个 氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键 ； 重复上述肽键形成反应， 使肽链从 C 端向 N 端生长， 直至最后一个氨基酸接入 ； 切割得到目 标多肽。 6. 权利要求 1 或 2 所述的防龋釉基质蛋白功能多肽、 其药学上可接受盐或酯在制备用 于防龋的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103421091 A 2 1/7 页 3 一种防龋釉基质蛋白功能多肽及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种防龋技术， 特别涉及一种防龋釉基质蛋白功能多肽及其制备方法 和用途。 背景技术 0002 龋病是人类最常见的口腔疾病。 由于龋病发病率高， 流。

6、行区广， 严重影响口腔及全 身健康， 世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一， 仅次于心血管 疾病和肿瘤。 0003 氟化物作为一种经典的防龋制剂， 在过去的四十多年里， 以各种不同的形式被利 用， 如饮水加氟、 含氟牛奶或含氟食盐、 局部涂氟(含氟牙膏、 含氟凝胶、 含氟漱口水)等， 从 而能不同程度地降低人群中的患龋率， 被公认为当前世界上最有效的防龋措施。然而随着 多种氟化物制剂使用的推广， 使用浓度及频率的增加， 耐氟菌株、 氟斑牙、 氟骨症的出现使 氟化物防龋局限性日益突显。 0004 抗微生物制剂如洗必泰、 四环素等， 可直接作用于细菌而预防龋病， 但长期使用易 。

7、引起口腔菌群失调， 使细菌产生耐药性， 具有明显的毒副作用。 0005 免疫防龋具有一定效果， 但存在增强免疫原性及人体应用安全性问题， 此外影响 口腔菌群生态的问题也函待解决。 0006 中药如儿茶、 大黄、 黄芩、 蜂房、 槟榔、 三七、 茶多酚等已被证实具有干扰细菌代谢、 抑制牙菌斑生物膜形成等作用， 但存在药液牙体染色、 耐药性等问题。 0007 不定形磷酸钙、 糖的替代品木糖醇及山梨醇、 中药五倍子及隔消山、 纳米羟磷灰 石、 酪蛋白磷酸肽、 微量元素、 橄榄油、 树脂等的再矿化作用被先后报道， 但由于效果不明显 或实验结果不一， 目前结论尚未统一。 0008 针对上述问题， 本领域。

8、积极探寻其他的防龋药物和方法。 0009 釉基质蛋白 （EMP） 是一组来自上皮根鞘的蛋白质， 是在牙齿发育期 Hertwig 上皮 根鞘内层的成釉细胞分泌的一种调控牙矿化的基质蛋白， 在牙本质刚刚开始矿化之前表 达， 在牙本质早期成熟阶段停止表达。釉基质蛋白含有釉原蛋白、 成釉蛋白、 釉蛋白等蛋白 质成分， 其中釉原蛋白占发育期牙釉质蛋白质提取物的 90% 以上。釉原蛋白在釉基质生物 矿化过程中起着决定性作用。 成釉细胞分泌釉原蛋白后， 在牙本质的诱导下， 釉质很快进行 生物矿化。釉原蛋白对釉质矿化的起始、 晶核的形成及排列等诸多因素起着重要作用。釉 原蛋白可为釉质生物矿化提供必要的支架， 。

9、并且还可控制晶体生长的速度， 维持晶体生长， 是釉质生物矿化的关键。 0010 近年， 基于釉基质蛋白的生物矿化功能， 体外利用釉基质蛋白合成人工羟磷灰石 已获得 成功。Chen 等模拟牙釉质矿化过程 , 利用釉基质蛋白控制合成了在化学组成上和 晶体尺寸上都和自然牙釉质非常相似的纳米棒状羟磷灰石。 Yamagish等在牙釉质表面形成 了具有釉质结构的氟磷灰石， 这些氟磷灰石排列致密， 平行排列， 垂直于釉质表面。国内学 者王志伟等将牙釉质放置在含 SD 大鼠牙釉基质蛋白的磷酸盐琼脂 - 醋酸钙溶液体系中 7 说 明 书 CN 103421091 A 3 2/7 页 4 天， 结果发现添加釉基质。

10、蛋白的牙釉质表面出现晶体带状结构。这些实验结果均提示釉基 质蛋白具有诱导牙釉质再矿化的强大潜力， 利用釉基质蛋白的这种潜力从而促进早期龋再 矿化， 极可能为龋病防治提供一条崭新的思路。 0011 但是， 目前釉基质蛋白尚未直接用于防龋。目前釉基质蛋白主要通过以下途径获 得 ： 从牙胚中提取釉基质蛋白。根据釉原蛋白、 非成釉蛋白的基因序列， 利用生物工程 技术实现了釉原蛋白的人工基因重组， 如重组大鼠的釉原蛋白 Mr179、 Mrl66。商品化的 釉基质衍生物。1999 年瑞典 Biora 开发了( 釉原蛋白的商品名 ) 产品， 经美国 FDA 批准用作牙周骨内缺损与根面平整区域的治疗， 随后在。

11、牙周病治疗和牙周缺损修复中 得到极为广泛应用。 上述釉基质蛋白来源中， 提取法需要组织材料较多， 得到的是不同分子 量的混合成分， 很难得到高纯度产物 ； 基因重组蛋白程序复杂， 且翻译后加工修饰体系不完 善， 复性和修饰很困难， 蛋白功能常不完善 ； 瑞典为猪牙胚提取的釉基质蛋白纯 化， 取典型釉原蛋白的 3 个相对分子量峰值冻干保存获得， 虽然具有明显促牙周组织再生 作用， 但可能丢失有效的防龋功能片段。 综上述， 目前釉基质蛋白的获得方法复杂且可能丢 失有效的防龋片段， 如何利用釉基质蛋白进行有效防龋成为本领域一直想解决但未能解决 的难题。 发明内容 0012 本发明的发明目的之一在于 。

12、： 针对上述存在的问题， 创新性提出利用仿生矿化防 龋的思想， 构建一种可有效防龋的多肽。 0013 本发明采用的技术方案是这样的 ： 一种防龋釉基质蛋白功能多肽， 包含如 SEQIDNO.1 所示的氨基酸序列， 以及包含 SEQIDNO.1 所示的氨基酸序列的盐或酯 ； 0014 SEQIDNO.1 ： QPYQPVQPHQPMQPQ 0015 釉原蛋白是由很多个不同的氨基酸组成的， 发明人通过分析总结发现 ： 釉原蛋白 含有很多的重复单元， 如 “QPX” 重复序列， 发明人进一步通过大量实验得出 ：“QPX” 序列能 诱导釉质的再矿化作用， 因此， 本发明选取釉原蛋白中的 “QPX” 序。

13、列进行组合， 从而构建了 本发明的防龋多肽， 这种多肽分子量较小， 可提高在牙釉质表面的吸附， 进而更好地发挥其 作用， 促进脱矿牙釉质的再矿化， 从而达到防龋目的。 0016 一种防龋釉基质蛋白功能多肽， 包含如 SEQIDNO.2 所示的氨基酸序列 ； 0017 SEQIDNO.2 ： QPYQPVQPHQPMQPQTKREEVD 0018 在釉原蛋白中的 “QPX” 序列的基础上， 再加上亲水端 “TKREEVD” ， 该亲水端可以与 钙离子作用并引发 HA( 羟基磷石灰 ) 成核， 从而产生更好的防龋效果。 0019 本发明的目的之二， 在于提供一种包括上述多肽、 其药学上可接受盐或酯。

14、的药物 组合物 / 制剂 ； 所述药物组合物 / 制剂除包括上述多肽、 其药学上可接受盐或酯外， 还可包 括合适的药学上可接受的载体和 / 或辅料。 0020 作为优选技术方案， 所述药物组合物 / 制剂优选凝胶剂。 0021 本发明的目的之三， 在于提供一种上述多肽的制备方法， 所采用的技术方案是 ： 包 括以下步骤 ： 按照 SEQIDNO.1 或 SEQIDNO.2 所示的氨基酸序列， 将第一个氨基被 Fmoc 保护 的氨基酸链接到固相载体Wang树脂上， 然后脱掉氨基保护基 ； 然后将氨基被Fmoc保护的第 二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成 。

15、说 明 书 CN 103421091 A 4 3/7 页 5 肽键 ； 重复上述肽键形成反应， 使肽链从 C 端向 N 端生长， 直至最后一个氨基酸接入 ； 切割 得到目标多肽。这种合成方法简单易行， 生产成本低。 0022 本发明的目的之四， 在于提供上述多肽在制备用于防龋的药物中的应用。 0023 本发明优选的凝胶剂直接作用于早期龋损部位， 从而达到治疗效果。现在最常用 的防龋制剂为氟化钠， 其主要实施方案为饮水加氟、 含氟牛奶或含氟食盐、 局部涂氟 ( 含氟 牙膏、 含氟凝胶、 含氟漱口水 ) 等， 其他的一些防龋制剂一般均配置成液体制剂， 局部作用 于龋损部位。本发明的凝胶剂进一步优选。

16、水性凝胶剂， 所用辅料按功能分类， 可包括 ： 增稠 剂、 保湿剂、 防腐剂、 稳定剂、 pH 调节剂等。具体而言， 常用凝胶基质有水、 甘油、 丙二醇、 纤 维素衍生物、 卡波姆、 海藻酸盐、 海藻酸酯、 西黄蓍胶、 明胶、 淀粉等。 0024 与已有防龋制剂的实施方案相比， 本发明将该多肽制备成凝胶状态， 减少其流动 性， 从而增加了局部作用时间， 可以使该多肽发挥最大的功效， 从而很好的治疗早期釉质 龋。 另外， 构建的该多肽片段来源于人釉原蛋白氨基酸序列， 因此与目前现有的化学或中药 防龋制剂比， 有更好的安全性和生物相容性。 0025 综上所述， 由于采用了上述技术方案， 本发明的有。

17、益效果是 ： 本发明的多肽主要包 含有 “QPX” 的诱导早期龋再矿化的氨基酸序列， 又包含可以与钙离子作用并引发 HA 成核的 氨基酸序列 “TKREEVD” ， 且经过重新合成该多肽分子量较小， 可提高在牙釉质表面的吸附， 进而更好地发挥其作用， 促进脱矿牙釉质的再矿化 ； 本发明能够很好地促进早期脱矿的牙 釉质 （早期龋） 再矿化， 且其合成方便， 经济实惠， 效果较好且安全可靠。 附图说明 0026 图 1 是阳性对照经典防龋化学制剂 NaF 组再矿化前后的显微放射照相图 ； 0027 图 2 是阳性对照经典防龋化学制剂 NaF 组再矿化前后的偏光图 ； 0028 图 3 是阴性对照组。

18、 HEPES 组再矿化前后的显微放射照相图 ； 0029 图 4 是阴性对照组 HEPES 组再矿化前后的偏光图 ； 0030 图 5 是实施例 1 的防龋多肽组再矿化前后的显微放射照相图 ； 0031 图 6 是实施例 1 的防龋多肽组再矿化前后的偏光图 ； 0032 图 7 是实施例 2 的防龋多肽组再矿化前后的显微放射照相图 ； 0033 图 8 是实施例 2 的防龋多肽组再矿化前后的偏光图。 具体实施方式 0034 下面对本发明作详细的说明。 0035 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施。

19、例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0036 实施例 1 ： 0037 一种防龋多肽， 氨基酸序列如 SEQIDNO.1 所示 ； 0038 SEQIDNO.1 ： QPYQPVQPHQPMQPQ 0039 实施例 2 0040 一种防龋多肽， 氨基酸序列如 SEQIDNO.2 所示 ； 说 明 书 CN 103421091 A 5 4/7 页 6 0041 SEQIDNO.2 ： QPYQPVQPHQPMQPQTKREEVD 0042 实施例 3 ： SEQIDNO.1 多肽的制备 0043 1、 选用 Fmoc-Gly（Trt） -WangResin 作为树脂 （载体） ； 0。

20、044 2、 用 DCM 将树脂充分溶胀 ； 0045 3、 用适当浓度的 DBLK（六氢吡啶 +DMF） ， 将 Fmoc- 保护基团脱出 ； 0046 4、 用 DMF 清洗数遍， 洗去 DBLK ； 0047 5、 称取适合的缩合剂和活化剂 （HBTU， NMM）以及 C 端第二个 Fmoc- 保护氨基酸 （Fomc-Val-OH） 进行偶联 ； 0048 6、 茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全 ； 0049 7、 用 DMF 清洗几遍， 洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂 ； 0050 8、 依 SEQIDNO.1 氨基酸序列进行偶联， 方法参照步骤 3-7 ； 0051 9. 将所。

21、有的氨基酸连接结束后采用步骤 3， 4 方法脱去最后的 Fmoc- 保护基团 ； 0052 10. 用 TFA 切割液裂解， 去除树脂和氨基酸保护基团， 得到粗品 ； 0053 11. 送质谱确认产品正确 （分子量 1803.031 符合理论值） ； 0054 12. 粗品送纯化分离， 提高纯度。 0055 实施例 4 ： SEQIDNO.2 多肽的制备 ： 0056 1. 选用 Fmoc-Asp(OtBu)-WangResin 作为树脂 （载体） ； 0057 2. 用 DCM 将树脂充分溶胀， 用 DMF 清洗几遍。 0058 3. 用适当浓度的 DBLK（六氢吡啶 +DMF） ， 将 F。

22、moc- 保护基团脱出。 0059 4. 用 DMF 清洗数遍， 洗去 DBLK。 0060 5. 称取适合的缩合剂和活化剂 （HBTU， NMM） 以及 C 端第二个 Fmoc- 保护氨基酸 （Fomc-Val-OH） 进行偶联。 0061 6. 茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全。 0062 7. 用 DMF 清洗几遍， 洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂。 0063 8. 依 SEQIDNO.2 氨基酸序列进行偶联， 方法同 3-7。 0064 9. 将所有的氨基酸连接结束后采用 3， 4 方法脱去最后的 Fmoc- 保护基团。 0065 10. 用 TFA 切割液裂解， 去除树脂和氨基。

23、酸保护基团， 得到粗品。 0066 11. 送质谱确认产品正确 （分子量 2660.951 符合理论值） 。 0067 12. 粗品送纯化分离， 提高纯度。 0068 实施例 5 ： 凝胶剂的制备 0069 将海藻酸丙二醇酯配制为 6%（w/w） ， pH=4， 粘度为 400mPas 的无菌水溶液。将 0.25um/ml 的釉基质蛋白功能多肽溶液 0.1ml 加入到 0.9ml 的海藻酸丙二醇酯 6%w/w， 混匀 后分别形成含釉基质蛋白功能多肽浓度为 0.025um/ml 的高粘度 (1000mPas) 酸性溶胶。 0070 实施例 6 ： 再矿化实验 0071 本实验选择新鲜拔除的牛切牙。

24、， 分离冠根， 冠部超声清洗， 干燥， 体视显微镜 ( 放大 10 倍 ) 下观察无龋损、 氟斑、 裂痕的牙冠进一步用高速硬组织切割机将牙冠切成 552mm 大小 的釉质块， 唇面釉质用抛光机及 800#-1200#-2400# 碳化硅砂纸在流水下 纸依次磨平、 抛光， 去除表层约 150m， 自然干燥， 用自凝塑胶将牙齿包埋， 釉质块唇面中央 保留 4mm4mm 的开窗区， 其余部位涂布两层抗酸指甲油 ； 说 明 书 CN 103421091 A 6 5/7 页 7 0072 牛牙釉质标本由显微硬度计测量表面显微硬度值于每个釉质标本开窗区的 中央垂直测 5 个点， 每个点相距 100m， 计。

25、算其平均值。选择 120 个硬度值范围为 320-400KHN(Knoophardnessnumber， KHN) 的釉质块进入进一步实验 ； 0073 将釉质标本固定在自制的环形玻棒上， 放入盛有人工脱矿液的玻璃器皿内， 按每 个标本 8ml 溶液加入脱矿液， 磁力搅拌仪搅拌 （100 转 / 分） ， 37下脱矿 72 小时， 在釉质开 窗区形成人工龋 ； 0074 脱矿后再次测量其表面显微硬度， 在基线测量点一侧平行测 5 个点， 选择 40 个硬 度值范围为 160-220KHN 的釉质块进入下一步的再矿化实验。每个样本所开窗口的一半用 抗酸指甲油覆盖作为再矿化实验前后形态学对照 ； 。

26、0075 随机分为 4 组 ( 每组 10 个标本 )， 按处理药物不同分别为 ： A.1g/L 氟化钠 （NaF） 组 （阳性对照组） 、 B.4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） 组 （阴性对照组） C.25mol/L 防龋多肽 组 1（溶于 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） ， 实施例 1 的防龋多肽） D.25mol/L 防龋多肽组 2（溶于 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） ， 实施例 2 的防龋多肽） . 0076 每天pH循环包括2小时的脱矿， 4次5分钟的药物处理时间， 其余时间浸泡在再矿 化溶液中， 磁搅拌仪搅拌 （100 转 / 分） ， 37下循环 12 天。

27、。 0077 偏光显微镜观察 0078 将每组 10 个样本， 硬组织切割机垂直于釉质开窗区表面切片， 每一切片包括脱矿 釉质、 再矿化釉质两部分， 切片约厚 300m， 然后进一步在抛光机流水下磨制成约 100m 厚的薄片， 采用贴附制备法， 再经水浸渍后用偏光显微镜观察， 数码图像由系统专用软件获 取 (NikonACT-1forL-1,Nikon, 日本 )。 0079 金标准显微放射照相定量分析 0080 将切片固定于显微放射照相的特制载体上， 20KV、 20mA、 曝光 30s 显微放射 X 线照 射。计算机配套分析软件提供总矿物丢失量、 龋损深度及矿物分布三个指标以评价 pH 循。

28、环 后样本的再矿化状态 ； 0081 结果数据如下 ： 0082 pH 循环前后各组的总矿物丢失量及龋损深度 0083 0084 说 明 书 CN 103421091 A 7 6/7 页 8 0085 统计分析 0086 统计学分析均采用软件 SPSS17.0 处理， 循环前后各组矿物含量、 龋损深度的比较 选用配对 t 检验 （Student spairedt-test） 。循环后各组平均矿物含量、 龋损深度的比较 选用单因素方差分析 （ANOVA） 及其两两比较 （Student-Newman-Keulstest） ， =0.05。 0087 实验结果 0088 偏光显微镜示 ： 各组再矿。

29、化前制备的人工龋均表现为典型的表层下脱矿， 具有负 性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部。再矿化后， 氟化钠组及防龋 多肽组 1 和防龋多肽组 2 标本龋损表层明显增厚， 且龋损深度变浅， HEPES 组标本的表层及 龋损深度在再矿化前后无明显改变。 0089 显微放射照相示， 所得的显微放射结果如图 1-8 所示 ； 再矿化后， 防龋多肽组 1 和 防龋多肽组 2 与氟化钠组较 HEPES 组表层阻射区增厚， 表层下的透射区也较浅 ； pH 循环后 各组的矿物丢失量及龋损深度比较显示， 氟化钠组和两组防龋多肽的矿物丢失量及龋损深 度的差异无统计学意义 （p0.05） , 均显。

30、著低于 HEPES 组 （p 四川大学 0091 一种防龋釉基质蛋白功能多肽及其制备方法和用途 0092 2 0093 PatentInversion3.3 0094 1 0095 15 0096 PRT 0097 人工序列 0098 0099 (1).(15) 0100 1 0101 0102 2 0103 22 0104 PRT 0105 人工序列 0106 0107 (1).(22) 0108 2 0109 说 明 书 CN 103421091 A 8 7/7 页 9 说 明 书 CN 103421091 A 9 1/7 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 10 2/7 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 11 3/7 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 12 4/7 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 13 5/7 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 14 6/7 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 15 7/7 页 16 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103421091 A 16 。