检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103421906 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421906 A *CN103421906A* (21)申请号 201310373614.X (22)申请日 2013.08.23 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国检验检疫科学研究院 地址 100123 北京市朝阳区高碑店北路甲 3 号 (72)发明人 王娉 陈颖 胡玥 田雪 杨海荣 赵勇胜 赵贵明 刘洋 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权代理有限 公司 72003 代理人 王芝艳 吴。

2、小瑛 (54) 发明名称 检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法 (57) 摘要 本发明涉及用于检测金黄色葡萄球菌耐药性 的组合物和方法。特别地， 本发明还涉及在多重 PCR 扩增后， 利用 DHPLC 对多重 PCR 扩增产物进行 检测的方法。 使用本发明， 能够简便、 快速、 灵敏度 高且特异性强地测定金黄色葡萄球菌耐药性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103421906 A CN 103421。

3、906 A *CN103421906A* 1/1 页 2 1. 利用多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物， 所述组合物包含 ： nuc 特异性引物对 ： SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 ； 以及 以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对 ： aacA-aphD 特异性引物对 ： SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 ； ermA 特异性引物对 ： SEQ ID No.5 和 SEQ ID No.6 ； ermC 特异性引物对 ： SEQ ID No.7 和 SEQ ID No.8 ； tetK 特异性引物对 ： SEQ ID No.9 和 SEQ 。

4、ID No.10 ； tetM 特异性引物对 ： SEQ ID No.11 和 SEQ ID No.12 ； 和 mecA 特异性引物对 ： SEQ ID No.13 和 SEQ ID No.14。 2. 用于通过多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的试剂盒， 所述试剂盒包括权利 要求 1 所述的组合物。 3. 检测金黄色葡萄球菌耐药性的方法， 所述方法包括使用权利要求 1 的组合物或权利 要求 2 所述的试剂盒进行多重 PCR 扩增的步骤。 4.根据权利要求3所述的方法， 其包括在多重PCR扩增步骤之后， 通过DHPLC对扩增产 物进行检测的步骤。 5.权利要求1所述的组合物或权利要求。

5、2所述的试剂盒在检测金黄色葡萄球菌耐药性 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103421906 A 2 1/8 页 3 检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物、 使用 该组合物进行的检测方法及该组合物在实际样品检测中的应用。 背景技术 0002 葡萄球菌属 (Staphylococcus) 至少包括有 20 个种， 其中金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 是人类的一种重要病原菌， 引起许多严重感染。典型的金黄色 葡萄球菌为球形， 直径 0.8m 左右， 显微镜下排列成葡萄串状。

6、。金黄色葡萄球菌无芽孢、 鞭 毛， 大多数无荚膜， 革兰氏染色阳性。 0003 金黄色葡萄球菌营养要求不高， 在普通培养基上生长良好， 需氧或兼性厌氧， 最适 生长温度 37， 最适生长 pH7.4。平板上菌落厚、 有光泽、 圆形凸起， 直径 1-2mm。血平板菌 落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性， 可在 10%-15%NaCl 肉汤中生 长。可分解葡萄糖、 麦芽糖、 乳糖、 蔗糖， 产酸不产气。甲基红反应阳性， VP 反应弱阳性。许 多菌株可分解精氨酸， 水解尿素， 还原硝酸盐， 液化明胶。 在干燥环境中存活数月 ； 空气中存 在， 但不繁殖。耐热性强， 70加热 1h，。

7、 80加热 30min 不被杀死 ； 耐低温， 在冷冻食品中不 易死亡 ； 耐高渗， 在含有 50%-66% 蔗糖或 15% 以上食盐食品中才可被抑制， 能在 15%NaCl 和 40% 胆汁中生长。 0004 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在， 空气、 水、 灰尘及人和动物的排泄物中都可 找到。因此， 食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点 ： 季节 分布， 多见于春夏季 ； 中毒食品种类多， 如奶、 肉、 蛋、 鱼及其制品。此外， 剩饭、 油煎蛋、 糯米 糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。 0005 金黄色葡萄球菌是院内感染的常见病原菌之一， 在自然界中分布广泛， 。

8、可引起全 身性感染及食物中毒。 随着抗菌药物的广泛使用， 耐药菌株的检出率逐年增高， 尤其是耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 的出现， 其多重耐药性增加了抗感染治疗的难度， 在世界范 围内引起广泛关注。有研究报道， 金黄色葡萄球菌产生的耐药性主要是由细菌的耐药基因 导致的。耐药基因的传播是耐药菌株产生的重要原因。对金黄色葡萄球菌的耐药基因进行 检测， 对控制感染性疾病的发生， 指导临床合理使用抗菌药物具有重要意义。 0006 面对日趋严重的细菌耐药问题， 为了维护人们的正常生活及控制金黄色葡萄球菌 引起的疾病， 国内外许多学者采用了多种手段对金黄色葡萄球菌耐药基因进行研究， 常用 的方。

9、法有药敏试验、 PCR、 荧光 PCR、 K-B 法等。由于金黄色葡萄球菌中含有的耐药基因易受 种及来源等因素的影响， 成分相对复杂 ； 尤其是近年来随着抗菌药物的广泛应用， 使许多单 一检测耐药基因的传统方法不再快速、 有效。 0007 现代生物技术以其方便、 准确、 迅速、 简洁的特点， 从基因水平分析菌株的耐药性 和耐药机制， 灵敏度更高、 特异性更强， 其结果为证明菌株的耐药性提供了真实、 可靠的依 据， 给菌种鉴别、 菌种耐药性研究等菌株相关研究注入了新鲜血液， 已成为近年来世界各国 的许多机构和学者致力的研究方向。 说 明 书 CN 103421906 A 3 2/8 页 4 00。

10、08 聚合酶链式反应 (PCR) 是通过扩增待测样品的 DNA， 使其能够从最初的微小数量 增至足以达到检测限量的巨大数量。 PCR方法已用于多种多样的基因检测中。 近几年， 在分 子生物学研究中， 利用定量 PCR 对基因表达结果进行检测， 获得了应用。由于其大大提高了 检测的灵敏度、 特异性和精确性、 并能有效地减少实验过程中产生污染的危险， 目前已广泛 应用于各个领域。 0009 多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物， 同时扩增 出多个核酸片段的 PCR 反应， 其反应原理、 反应试剂和操作过程与一般 PCR 反应相同。其特 点有 ： 高效性，。

11、 在同一 PCR 反应管内同时检测多种病原微生物， 或对有多个型别的目的基 因进行分型， 特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性， 多重 PCR 很适宜于成组病原 体的检测。经济简便性， 多种病原体在同一反应管内同时检出， 将大大的节省时间， 节省 试剂， 节约经费开支。 0010 变性高效液相色谱分析 (denaturing high performance liquid chromatography， DHPLC) 具有高通量检测、 自动化程度高、 灵敏度和特异性较高、 检测 DNA 片段和长度变动范 围广、 相对价廉等优点。 与传统的SSCP(单链构象多态性)分析、 DGGE(变性梯度。

12、凝胶电泳) 等方法相比， DHPLC 有较多的优点。SSCP 的结果受血样质量、 提取方法等因素的影响， 并且 需要跑胶、 电泳 ； DGGE 则需要标记引物， 存在放射性污染， 这两种方法都比较费时费力。而 DHPLC 则高度自动化， 可以自动取样， 检测每个样品只需要 8 分钟左右。 0011 目前， 国内外少见报道能快速、 简单、 特异且灵敏地检测金黄色葡萄球菌对抗生素 耐药性的方法。 0012 因此， 本领域需要一种快速、 特异性好、 灵敏度高的金黄色葡萄球菌耐药性检测方 法， 进行金黄色葡萄球菌耐药性的检测。 发明内容 0013 本发明的一个目的在于， 提供检测金黄色葡萄球菌耐药性的。

13、组合物。 0014 本发明的另一个目的在于， 提供检测金黄色葡萄球菌耐药性的检测方法。 0015 针对上述目的， 本发明提供了以下技术方案。 0016 一方面， 本发明提供了用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物， 所述组合物包 含金黄色葡萄球菌热稳定核酶基因nuc(heat stable nuelease)的特异性引物对以及针对 以下六种耐药基因中一种或多种的特异性引物对 ： 甲氧西林耐药基因 mecA、 氨基糖苷类耐 药基因 aacA-aphD、 红霉素耐药基因 ermA 和 ermC、 四环素耐药基因 tetK 和 tetM。 0017 在一个实施方式中， 金黄色葡萄球菌特异性 nuc 基。

14、因的特异性引物对为 ： 0018 nuc-F ： GGT CCT ACT TTT TCC CTA CTA GTT G(SEQ ID No.1)、 0019 nuc-R ： AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2)， 0020 扩增产物为 122bp ； 0021 氨基糖苷类耐药基因 aacA-aphD 的特异性引物对为 ： 0022 aacA-aphD-F ： TAT TGC ATG AGC AAT AAG GGC(SEQ ID No.3)、 0023 aacA-aphD-R ： CGG ACA CTA TCA TAA CCA CTA(SEQ。

15、 ID No.4)， 0024 扩增产物为 227bp ； 0025 红霉素耐药基因 ermA 的特异性引物对为 ： 说 明 书 CN 103421906 A 4 3/8 页 5 0026 ermA-F ： ACG CGG TAA ACC GCT CTG A(SEQ ID No.5)、 0027 ermA-R ： TCC GCA AAT CCC ATC TCA AC(SEQ ID No.6)， 0028 扩增产物为 190bp ； 0029 红霉素耐药基因 ermC 的特异性引物对为 ： 0030 ermC-F ： GGT CGT CTA TTC CTG CAT GT(SEQ ID No.7)。

16、、 0031 ermC-R ： TCC TCG TCG AAT ACG GGT TTG(SEQ ID No.8)， 0032 扩增产物为 299bp ； 0033 四环素耐药基因 tetK 的特异性引物对为 ： 0034 tetK-F ： TA GGCG ACA ATA GGTGCT AGT(SEQ ID No.9)、 0035 tetK-R ： GCTGTG ACA ATA AAC CTC CTA(SEQ ID No.10)， 0036 扩增产物为 360bp ； 0037 四环素耐药基因 tetM 的特异性引物对为 ： 0038 tetM-F ： GAT AGA GCG ATT ACA G。

17、AC(SEQ ID No.11)、 0039 tetM-R ： GTA ATC TCC TGG CGT GTC TG(SEQ ID No.12)， 0040 扩增产物为 158bp ； 0041 甲氧西林耐药基因 mecA 的特异性引物对为 ： 0042 mecA-F ： GGACCCTCAAACAGGTGAAT(SEQ ID No.13)、 0043 mecA-R ： TTGCTTGTAACCACCCCAAG(SEQ ID No.14)， 0044 扩增产物为 280bp。 0045 一方面， 本发明提供了通过多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的试剂盒， 所述试剂盒包括本发明用于检测。

18、金黄色葡萄球菌耐药性的组合物。 0046 再一方面， 本发明提供了检测金黄色葡萄球菌耐药性的方法， 所述方法包括使用 本发明用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物或试剂盒进行多重 PCR 扩增的步骤。 0047 在 一 个 实 施 方 式 中， 多 重 PCR 反 应 25L 体 系 包 含 ： 10PCR 缓 冲 液 ( 含 Mg2+)10L ； dNTPs 终 浓 度 为 400mol/L ； Taq DNA 聚 合 酶 1U ； DNA 模 板 2L ； SEQ ID No.1-14 引物终浓度均为 20pmol/L， 余量以去离子水补足。 0048 在一个实施方式中， 多重 PCR 扩增。

19、条件为 ： 95预变性 10min ； 95变性 30s， 55 退火 30s， 72延伸 45s， 30 个循环 ； 循环完成后 72充分延伸 10min。扩增产物可以于 4 保存。 0049 在本发明的一个实施方式中， 所述检测方法包括在多重 PCR 扩增步骤之后， 通过 DHPLC 对扩增产物进行检测的步骤。 0050 在本发明的一个实施方式中， 所述多重 PCR 扩增产物通过 DHPLC 检测。所使用的 仪器可以为， 例如 Transgenomic 公司的 DNA-99-3510 色谱柱， 检测器为紫外检测器。 0051 将多重 PCR 产物放进 DHPLC 进样室， 检测条件为 ： 。

20、设置双链 DNA 多片段分析模 式， 检测范围为 100-700bp， 检测起始时间为 0.5min， 检测结束时间为 15min， 流动相 ： A 液 (0.1mol/L TEAA， 即三乙基胺醋酸盐 ) 为 60， B 液 ( 含 25乙腈的 0.0mol/L TEAA) 为 40， 柱温为 60， 上样量为 5L， 流速为 0.9ml/min。 0052 通过 DHPLC 检测方法对 PCR 扩增产物进行检测是一种新型的基因检测技术， 利用 样品分子通过固定相亲和力的差异， 在用流动相进行洗脱时， 不同大小或不同序列的核酸 说 明 书 CN 103421906 A 5 4/8 页 6 片。

21、段在固定相上的移动速率不同达到分离的目的。可以代替传统的凝胶电泳分析， 检测结 果直观可以根据峰图直接判定检测结果而不需要使用溴化乙锭， 并且比凝胶电泳检测的灵 敏度高， 一次可以同时自动化分析几百个样品， 实现金黄色葡萄球耐药性的高通量检测。 0053 再一方面， 本发明提供了本发明用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物或试剂 盒在检测金黄色葡萄球菌耐药性中的应用。 0054 本发明的多重 PCR 检测方法采用一管同时检测， 无需多步 PCR 处理， 节省了时间。 本发明的方法巧妙地运用了多重 PCR 技术的 DNA 高效扩增、 核酸杂交的特异性强的特点及 DHPLC 检测技术的快速、 简便、。

22、 高通量的特点。具有操作简单、 省时省力和结果可靠等优点。 使用本发明的多重PCR和DHPLC检测方法， 其简单、 快速且高通量的特点适合用于金黄色葡 萄球菌耐药性的检测。 附图说明 0055 图 1 是 金 黄 色 葡 萄 球 菌 特 异 基 因 nuc 的 PCR 扩 增 产 物 凝 胶 电 泳 检 测 结 果， 其 中， 1 和 2 均 为 金 黄 色 葡 萄 球 22011 和 22015 的 PCR 产 物， 3-10 依 次 为 表 皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis)22036、腐 生 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus sap。

23、arophytics)22007，伤 寒 沙 门 菌 (Salmonella typhi)10593、单 增 李 斯 特 菌 (Listeria monocytogenes)22203、 大肠杆菌 O157(E.coli)10102、 副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)12310、 志贺菌 (Shigella)11307、 小肠结肠炎耶尔森菌 (Yersinia enterocolitica)10908 的 PCR 产物， C 为空白对照， M 为 50bp 标记。 0056 图 2 是金黄色葡萄球菌特异基因和耐药基因的多重 PCR 产物凝胶电泳检测结果， 其中， 。

24、1 和 2 均为 tetK、 ermC、 mecA、 aac-aphD、 ermA、 tetM、 nuc 基因 7 重 PCR 产物， C 为空 白对照， M 为 50bp 标记。 0057 图 3 是金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因的多重 PCR 产物用 DHPLC 方法的检测 结果， 其中 1 ： nuc， 2 ： tetM， 3 ： ermA， 4 ： acca-aphD， 5 ： mecA， 6 ： ermC， 7 ： tetK。 0058 图4是金黄色葡萄球菌耐药基因的7重PCR-DHPLC灵敏度检测结果， a是DNA浓度 为 2 101g/L， b ： 2g/L， c ： 2 10。

25、-1g/L， d ： 2 10-2g/L， e ： 2 10-3g/ L。 0059 图 5 为 20 株金黄色葡萄球菌食品分离菌株的检测结果， 其中 1 是 nuc 基因， 2 为 tetM 基因， 3 是 aacA-aphD 基因。 具体实施方式 0060 通过实施例的方式对本发明作进一步的说明， 但是本发明并不局限于以下实施 例。 0061 实施例 1 0062 本实施例选取金黄色葡萄球菌 22011、 22015， 表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)22036、 腐 生 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus saparophytics)22。

26、007， 伤 寒 沙 门 菌 (Salmonella typhi)10593、 单 增 李 斯 特 菌 (Listeria monocytogenes)22203、 大 肠 杆 菌 O157(E.coli)10102、 副 溶 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus)12310、 志 贺 菌 (Shigella)11307、 小肠结肠炎耶尔森菌 (Yersinia enterocolitica)10908 食品中常见的 说 明 书 CN 103421906 A 6 5/8 页 7 病原菌的基因组 DNA 扩增， 验证 nuc 引物的特异性。本实施例中使用的菌株菌来自中国检。

27、 科院食品安全微生物菌种保藏管理中心。 本实施例中所使用的用于检测金黄色葡萄球菌特 异性基因 nuc 的引物序列为 ： 0063 nuc-F ： GGTCCT A CT TTT TCC CTA CTA GTT G(SEQ ID No.1) 0064 nuc-R ： AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2) 0065 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成。 0066 所使用的主要检测仪器 ： 微量移液器 (10L、 100L、 1000L， Eppendorf)， PCR 仪 (ABI VERITI96Well Applied B。

28、iosystems， USA)， 高速台式离心机 (Pico17Thermo) 等。 0067 检测步骤为 ： 0068 1)DNA 提取 0069 按照Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega， 美国)的操作说明提取上述菌株 的基因组 DNA， 并将各 DNA 终浓度调整为 20g/L。 0070 2)PCR 扩增 0071 利用宝生物的 PCR 扩增试剂盒 (TaKaRa, 日本 ) 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 50L ： 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+)10L ； dNTPs 终浓度 400mol/L ； TaqDNA 聚合酶 1U ； 步骤 1) 。

29、获得的基因组 DNA2L 作为模板 ； 引物 SEQ ID Nos.1 和 2 的终浓度均为 20pmol/L， 余量 为去离子水。 0072 SEQ No.s1 和 2 扩增 nuc 基因。 0073 扩增条件为 ： 95预变性10min ； 95变性30s， 55退火30s， 72延伸45s， 共30 个循环 ； 循环完成后 72充分延伸 10min。扩增产物 4保存。 0074 3) 电泳检测 0075 将 PCR 扩增产物用 3凝胶电泳进行检测， 检测结果如图 1 所示。在 122bp 处只有 金黄色葡萄球菌的 DNA 模板扩增出清晰明亮的目的条带， 其余菌株未扩增出目的条带， 且 空。

30、白对照无污染， 说明引物 SEQ No.s1 和 2 对金黄色葡萄球菌具有特异性。 0076 实施例 2 0077 本实施例为通过GenBank获得金黄色葡萄球菌基因nuc、 甲氧西林耐药基因mecA、 氨基糖苷类耐药基因 aacA-aphD、 红霉素耐药基因 ermA 和 ermC、 四环素耐药基因 tetK 和 tetM 序列， 设计了针对各个基因的引物序列， 建立了金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因 的多重 PCR 检测方法。 0078 本实施例中所使用的用于检测金黄色葡萄球菌特异性及耐药基因的引物序列 为 ： 0079 nuc-F ： GGT CCT ACT TTT TCC CTA CT。

31、A GTT G(SEQ ID No.1) 0080 nuc-R ： AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2) 0081 aacA-aphD-F ： TAT TGC ATG AGC AAT AAG GGC(SEQ ID No.3) 0082 aacA-aphD-R ： CGG ACA CTA TCA TAA CCA CTA(SEQ ID No.4) 0083 ermA-F ： ACG CGG TAA ACC GCT CTG A(SEQ ID No.5) 0084 ermA-R ： TCC GCA AAT CCC ATC TCA AC(SEQ I。

32、D No.6) 0085 ermC-F ： GGT CGT CTA TTC CTG CAT GT(SEQ ID No.7) 0086 ermC-R ： TCC TCG TCG AAT ACG GGT TTG(SEQ ID No.8) 说 明 书 CN 103421906 A 7 6/8 页 8 0087 tetK-F ： TA GGCG ACA ATA GGTGCT AGT(SEQ ID No.9) 0088 tetK-R ： GCTGTG ACA ATA AAC CTC CTA(SEQ ID No.10) 0089 tetM-F ： GAT AGA GCG ATT ACA GAC(SEQ I。

33、D No.11) 0090 tetM-R ： GTA ATC TCC TGG CGT GTC TG(SEQ ID No.12) 0091 mecA-F ： GGACCCTCAAACAGGTGAAT(SEQ ID No.13) 0092 mecA-R ： TTGCTTGTAACCACCCCAAG(SEQ ID No.14)。 0093 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成。 0094 所使用的主要检测仪器 ： 微量移液器 (10L、 100L、 1000L， Eppendorf)， PCR 仪(ABI VERITI96Well Applied Biosystems， USA)， 高。

34、速台式离心机(Pico17Thermo)， 变性 高效液相色谱仪 (DHPLC-4500) 等。 0095 检测步骤为 ： 0096 1)DNA 提取 0097 实验使用的金黄色葡萄球菌菌株均来自中国检科院食品安全微生物菌种保藏管 理中心， 菌株编号为 ： 22011( 用于扩增 nuc 基因 )， 22012( 用于扩增 ermC 基因 )， 22015( 用 于扩增 accA-aphD 基因 )， 22024( 用于扩增 tetK 基因 )， 22039( 用于扩增 tetM 基因 )， 22044( 用于扩增 mecA 基因 )， 22069( 用于扩增 ermA 基因 )。按照 Wiz。

35、ard Genomic DNA 纯 化试剂盒(Promega， 美国)的操作说明提取上述金黄色葡萄球菌菌株的基因组DNA， 并将各 DNA 终浓度调整为 20g/L。 0098 2)PCR 扩增 0099 利用宝生物的 PCR 扩增试剂盒 (TaKaRa, 日本 ) 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 50L ： 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+)10L ； dNTPs 终浓度 400mol/L ； TaqDNA 聚合酶 1U ； 步骤 1) 获得的基因组 DNA2L 作为模板 ； 引物终浓度均为 20pmol/L， 余量为去离子水。 0100 其中， 用 22011 基因组 DNA、 。

36、SEQ No.s1 和 2 扩增 nuc 基因 ； 用 22012 基因组 DNA、 SEQ No.s7 和 8 扩增 ermC 基因 ； 用 22015 基因组 DNA、 SEQ No.s3 和 4 扩增 accA-aphD 基因 ； 用 22024 基因组 DNA、 SEQ No.s9 和 10 扩增 tetK 基因 ； 用 22039 基因组 DNA、 SEQ No.s11 和 12 扩增 tetM 基因 ； 用 22044 基因组 DNA、 SEQ No.s13 和 14 扩增 mecA 基因 ； 用 22069 基因 组 DNA、 SEQ No.s5 和 6 扩增 ermA 基因。 。

37、0101 扩增条件为 ： 95预变性10min ； 95变性30s， 55退火30s， 72延伸45s， 共30 个循环 ； 循环完成后 72充分延伸 10min。扩增产物 4保存。 0102 3)PCR 产物纯化及多重 PCR 扩增 0103 按照 Wizard Gel Extraction 试剂盒 (Promega， 美国 ) 的操作说明对上述 PCR 产 物进行纯化、 回收。按 TaKaRa pMD19-T Vector 试剂盒 (TaKaRa， 日本 ) 的说明书将回收的 纯化产物与 pMD19-T Vector 连接， 连接体系 10L ： pMD19-TVector1L、 PCR 。

38、产物 2L、 ddH2O2L、 Solution I5L， 同时设置阳性和阴性对照。 将连接体系置于室温(22-37)反 应30min， 反应结束后， 立即置于冰上。 加连接产物(10L)于50L TOP感受态细胞中， 轻 弹混匀， 冰浴30min， 42准确热激90s， 立即置于冰上2min， 然后加入800L已灭过菌的脑 心浸液 ( 北京陆桥技术有限责任公司 )， 37、 200r/min 振荡培养 1h。5000r/min 低速离心 1min， 弃 600L 上清， 将沉淀混匀， 取 200L 混合液涂于 Amp+、 X-Gal 和 IPTG 处理的营养 琼脂平板上， 37过夜培养后置于。

39、 4冰箱中 4h。挑取单菌落白斑， 在含有终浓度 200g/ 说 明 书 CN 103421906 A 8 7/8 页 9 mL 的 Amp 的脑心浸液中在 37、 200r/min 振荡过夜培养。 0104 阳性克隆鉴定 ： 挑取单个白色克隆， 利用宝生物的 PCR 扩增试剂盒 (TaKaRa, 日 本 ) 进行菌落 PCR 反应， 体系为 25L ： 反应 10 缓冲液 ( 含 Mg2+)2.5L、 dNTPs1L、 上 下游引物各 0.5L、 Taq 酶 0.2L， 挑取单菌落作为模板， 加去离子水补至 25L。扩增条 件为 ： 95预变性 10min ； 95变性 30s， 退火温度为。

40、 55 30s， 72延伸 45s， 30 个循环 ； 循 环完成后 72， 10min 充分延伸。扩增产物进行凝胶电泳验证对应的菌株是否为阳性。 0105 质粒 DNA 提取 ： 将鉴定为阳性的菌液用天根生化科技的质粒 DNA 提取试剂盒进行 质粒 DNA 的提取， 获得分别含有 nuc、 aacA-aphD、 ermA、 ermC、 tetK、 tetM 和 mecA 扩增片段 的阳性质粒 DNA。 0106 将将以上获得的阳性质粒 DNA 按 1:1:1:1:1:1:1 制备成混合模板备用。 0107 多重 PCR 扩增 ： 采用 25L 扩增体系 ： 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2。

41、+)10L ； dNTPs 终 浓度400mol/L ； Taq DNA聚合酶1U ； 质粒DNA混合模板2L ； SEQ ID Nos.1-14引物终浓 度均为20pmol ； 余量为去离子水。 扩增条件为 ： 95预变性10min ； 95变性30s， 55退火 30s， 72延伸 45s， 30 个循环 ； 72， 10min 充分延伸。 0108 4) 电泳检测 0109 将多重 PCR 扩增产物用 3凝胶电泳进行检测， 检测结果如图 2 所示。在 360bp， 299bp， 280bp， 227bp， 190bp， 158bp和122bp扩增出清晰明亮的目的条带， 这说明多重PCR可。

42、 以同时扩增出金黄色葡萄球菌热稳定核酶基因 nuc、 甲氧西林耐药基因 mecA、 氨基糖苷类 耐药基因 aacA-aphD、 红霉素耐药基因 ermA 和 ermC、 四环素耐药基因 tetK 和 tetM 序列， 空 白对照无污染。 0110 实施例 3 ： 利用 DHPLC 检测多重 PCR 扩增产物 0111 DHPLC检测使用Transgenomic公司的变性高效液相色谱仪(DHPLC-4500)， 色谱柱 为 DNA-99-3510， 检测器为紫外检测器。 0112 将实施例 2 的多重 PCR 产物放进 DHPLC 进样室， 检测条件为 ： 设置双链 DNA 多片 段分析模式， 。

43、检测范围为 100-700bp， 检测起始时间为 0.5min， 检测结束时间为 15min， 流动 相 ： A 液 (0.1mol/L TEAA， 即三乙基胺醋酸盐为 60， B 液 ( 含 25乙腈的 0.0mol/L TEAA) 为 40， 柱温为 60， 上样量为 5L， 流速为 0.9ml/min。 0113 如图 3 所示， 7 对引物分别在特定位置出现阳性吸收峰， 而空白对照仅出现洗脱 峰。 0114 实施例 4 0115 本实施例为通过如下试验对金黄色葡萄球菌多重 PCR-DHPLC 方法进行了灵敏度 验证。 0116 检测金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因多重 PCR-DHPL。

44、C 灵敏度的反应体系为 (25L) ： 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+)10L ； dNTPs 终浓度 400mol/L ； Taq DNA 聚合酶 1U ； DNA 模板 2L， SEQ ID Nos.1-14 引物终浓度均为 20pmol ； 余量为去离子水。 0117 注 ： 每次 PCR 检测均设立相应的空白对照 ( 用配制反应体系的超纯水代替 DNA 模 板， 检测试剂是否受到污染 )。 0118 扩增条件为 ： 95预变性 10min， 95变性 30s， 退火温度为 55 30s， 72延伸 45s、 30 个循环、 循环完成后 72， 10min 充分延伸。 说 明 书 。

45、CN 103421906 A 9 8/8 页 10 0119 注 ： 不同仪器应将 PCR 各试剂及反应参数做适当调整。 0120 为更加快速且灵敏的测定金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因多重 PCR 的绝对 检测限， 将实施例 2 中步骤 3) 制备的混合 DNA 模板用无菌水分别稀释为 20ng/L、 2ng/ L、 200pg/L、 20pg/L、 2pg/L 的浓度作为模板， 分别按上述条件进行多重 PCR 扩增。 0121 然后， 将扩增产物放入进样室， 自动进样， 上样量 5L， 柱温 50， 流动相流 速 0.9mL/min ； 根据扩增产物碱基长度， 设置双链 DNA 多片段分析。

46、模式， 检测范围为 100-700bp， 清洗模式采用 active。 0122 如图 4 所示。金黄色葡萄球菌 DNA 浓度为 20ng/L、 2ng/L、 200pg/L、 20pg/ L 时有 7 个信号峰， 而浓度降至 2pg/L 以下时， 少于 7 个信号峰。实验结果表明建立的 多重 PCR-DHPLC 检测方法能够检出金黄色葡萄球菌特异性及耐药基因的含量为 2pg/L， 而空白对照仅出现洗脱峰， 说明 PCR 反应体系未污染。 0123 实施例 5 0124 本发明的发明人通过如下试验对分离菌株进行了检测验证。 0125 选取 20 株金黄色葡萄球菌分离菌株， 表皮葡萄球菌、 腐生。

47、葡萄球菌， 伤寒沙门 菌、 单增李斯特菌、 大肠杆菌 O157 各 2 株按照上述多重 PCR 体系和条件进行实时多重 PCR-DHPLC 检测， 以确定所建立的多重 PCR-DHPLC 方法是否具有可行性。 0126 结果如图 5 所示， 20 株金黄色葡萄球菌分离菌株均能检出 nuc 基因， 2 株菌检出 tetM 基因， 2 株菌检出 aacA-aphD 基因 ； 表皮葡萄球菌、 腐生葡萄球菌， 伤寒沙门菌、 单增李 斯特菌、 大肠杆菌 O157 不能检出 nuc 基因， 这些菌株中也未能检测出耐药相关基因。表明 该方法能有效检测出金黄色葡萄球菌的特异基因和耐药基因。 说 明 书 CN 103421906 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103421906 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 103421906 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 103421906 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103421906 A 14 2/3 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 103421906 A 15 3/3 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 103421906 A 16 。