《一种开关型三价铁离子荧光探针及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种开关型三价铁离子荧光探针及其制备方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103421015 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421015 A *CN103421015A* (21)申请号 201310299357.X (22)申请日 2013.07.16 C07D 491/107(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 安徽大学 地址 230601 安徽省合肥市经济技术开发区 九龙路 111 号 (72)发明人 孟祥明 叶维鹏 蔡玉磊 汪恕欣 朱满洲 冯燕 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 吴启。
2、运 (54) 发明名称 一种开关型三价铁离子荧光探针及其制备方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种开关型三价铁离子荧 光探针及其制备方法， 其中开关型三价铁离子 荧光探针是以罗丹明 B 为母体， 其结构式为 ： 本发明荧光 探针分子在三价铁离子与其他阳离子共存体系 中， 表现出较高的选择性和灵敏性。 荧光显像实验 表明了本发明荧光探针分子对细胞渗透性好， 并 且对细胞无毒性作用， 可用于细胞内检测三价铁 离子的浓度以及分布。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图4。
3、页 (10)申请公布号 CN 103421015 A CN 103421015 A *CN103421015A* 1/1 页 2 1. 一种开关型三价铁离子荧光探针， 以罗丹明 B 为母体， 其特征在于其结构式为 ： 2. 一种权利要求 1 所述的开关型三价铁离子荧光探针的制备方法， 其特征在于按以下 步骤操作 ： （1） 将罗丹明 B5g 和水合肼 0.67g 置于圆底烧瓶中， 加入溶剂乙醇， 加热至 75-85回 流反应， 用 TLC 跟踪至原料反应完全， 旋蒸后得到粗产物， 重结晶后得到 4.88g 白色固体中 间体 1 ； （2） 将中间体 11.36g 置于圆底烧瓶中， 加入溶剂二氯。
4、甲烷， 冰浴条件下搅拌滴加三乙 胺0.76g和氯乙酰氯0.5g， 加完后继续保持冰浴反应30分钟， 溶液颜色由粉红色变为紫色， 升至室温继续反应， 用TLC跟踪至原料反应完毕， 旋蒸后得到粗产物， 重结晶后得到1.2g的 中间体 2 ； （3） 将中间体 20.53g、 2- 胺甲基吡啶 0.324g、 碘化钾 0.5mg 和乙腈加入圆底烧瓶中， 加 热至 75-85回流反应， 用 TLC 跟踪至原料反应完毕， 冷却至室温， 反应液倒入水中， 乙酸乙 酯萃取， 合并有机相， 有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸后得到粗产物， 通过柱层析提纯得到 目标产物。 权 利 要 求 书 CN 103421015。
5、 A 2 1/5 页 3 一种开关型三价铁离子荧光探针及其制备方法 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种荧光探针分子及其制备方法， 具体地说是一种开关型三价铁离子 荧光探针及其制备方法， 属于阳离子检测的技术领域。 二、 背景技术 0002 过渡金属离子铁离子在生命成长和进化中起到至关重要作用， 然而， 人体内的三 价铁离子浓度达到一定时， 与癌症的发病率和人体器官的功能障碍有着密切相关， 比如心 脏病、 胰腺病和肝脏病。因而在环境中实时检测三价铁离子浓度有着重要意义。 0003 荧光探针是在一定体系内， 当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时， 荧光 信号能发生相应改变的分子， 荧光光。
6、谱在于其检测方便， 灵敏等优点在痕量检测中展现了 优越的性能。 0004 罗丹明 B 作为重要的荧光报告基团， 具有高的荧光量子产率， 较大的刚性平面结 构， 发射波长可达到红色可见光区 （500-700nm） ， 水溶性好， 毒性小， 受样品背景干扰小等优 点。虽然以罗丹明 B 作为荧光报告集团的荧光探针已报道的文献很多， 但是在纯水中检测 三价铁离子还未见过， 因此这个探针具有很好的应用价值。 三、 发明内容 0005 本发明旨在提供一种开关型三价铁离子荧光探针及其制备方法， 所要解决的技术 问题是遴选并合成合适的荧光探针分子结构， 实现对三价铁离子浓度的实时检测， 并具有 选择性专一， 。
7、灵敏度高， 检测浓度低的特点。 0006 本发明开关型三价铁离子荧光探针， 以罗丹明 B 为母体， 其结构式为 ： 0007 0008 本发明开关型三价铁离子荧光探针的制备方法， 按以下步骤操作 ： 0009 （1） 将罗丹明 B5g（11.22mmol） 和水合肼 0.67g（13.46mmol） 于圆底烧瓶中， 加入 溶剂乙醇， 加热至75-85回流反应， 用TLC跟踪至原料反应完毕， 停止反应。 旋蒸后得到粗 产物， 重结晶 （溶剂为乙醇） 后得到白色固体中间体 1。 0010 （2）将中间体 11.36g(3mmol) 于圆底烧瓶中， 加入溶剂二氯甲烷 （10mL） ， 冰浴 条件下，。
8、 在快速搅拌下， 用恒压滴液漏斗慢慢滴加三乙胺 0.76g（7.5mmol) 和氯乙酰氯 0.5g(4.5mmol)， 加入完毕后， 继续保持冰浴 30 分钟， 溶液颜色由粉红色变紫色， 升至室温 继续反应， 用 TLC 跟踪至原料反应完毕， 停止反应， 旋蒸后得到粗产物， 重结晶 （溶剂为乙酸 乙酯和石油醚按体积比 1:3 构成的混合溶剂） 后得到中间体 2。 说 明 书 CN 103421015 A 3 2/5 页 4 0011 （3）将 中 间 体 20.53g(1mmol)， 2- 胺 甲 基 吡 啶 0.324g(3mmol)，碘 化 钾 0.5mg(0.003mmol) 和乙腈于圆。
9、底烧瓶中， 加热至 75-85反应， 用 TLC 跟踪至原料反应完 毕， 停止反应。 冷却至室温， 反应液倒入水中， 乙酸乙酯萃取315mL， 合并有机相， 有机相用 无水硫酸钠干燥， 旋蒸后得到粗产物， 粗产物用柱层析法提纯 （洗脱液体积比石油醚 ： 乙酸 乙酯 =3:1） 得目标产物荧光探针分子 RD。 0012 本发明荧光探针分子 RD 的合成过程如下 ： 0013 0014 将本发明荧光探针分子溶于甲醇中制得 1mM 的母液， 取 100L 的母液于 10mL 容 量瓶中， 再用 HEPES 水溶液 （pH7.0） 定容， 配制成 10M。同样方法取 100L 的母液于 10mL 容量。
10、瓶中， 然后分别取 0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.4， 1.6， 1.8， 2.0， 2.2 当量的三价铁 离子加入各个装有 100L 的母液的 10mL 容量瓶中， 再用 HEPES 水溶液 （pH7.0） 定容。探 针分子在 530nm 激发下， 检测荧光光谱的变化， 随着三价铁离子的加入， 586nm 处有发射峰 出现， 并且随着三价铁离子的浓度增加而增加， 直至加入 2 倍当量铁离子后， 荧光强度达到 稳定。 0015 本发明利用三价铁离子与荧光探针分子络合前后， 溶液的颜色变化以及荧光变化 来检测三价铁离子。 荧光探针分子未与三价铁离子络合前，。
11、 荧光探针分子的溶液是无色的， 并且在紫外灯下是无荧光的， 加入三价铁离子后， 溶液颜色开始变为红色， 并在 586nm 有一 个强的发射峰， 随着三价铁离子的浓度增至 2 倍时， 荧光强度趋于稳定。因此可证明的是在 未加三价铁离子前， 罗丹明处于关环状态， 溶液是无色并且无荧光发射， 当加入三价铁离子 后， 罗丹明处于开环状态， 溶液颜色变红， 并且发出红色荧光， 这也正是本发明 “开关型三价 铁离子荧光探针” 的含义。 说 明 书 CN 103421015 A 4 3/5 页 5 0016 本发明荧光探针分子结构简单， 易于合成， 作用位点和荧光基团为一整体。 本发明 荧光探针分子与三价铁。
12、离子有明确的作用位点， 不属于传统探针检测三价铁离子， 本发明 通过荧光探针分子与三价铁离子络合前后的溶液颜色变化以及荧光变化， 来检测三价铁离 子， 在可见光下， 肉眼就可以看出溶液从无色变为红色， 在紫外灯下， 可以看出荧光从无荧 光发射变为红色荧光。 本发明检测方法操作简单， 快速灵敏， 本发明荧光探针分子选择性专 一， 灵敏度高， 检测浓度低 （小于 1.0M） 。 四、 附图说明 0017 图 1 是本发明荧光探针分子与三价铁离子的反应过程图。 0018 图 2 是本发明荧光探针分子 RD 的单晶结构图。 0019 图 3 是将本发明荧光探针分子在 HEPES 缓冲溶液 （pH7.0。
13、） （10M） ， 分别滴加 0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.4， 1.6， 1.8， 2.0， 2.2 倍当量的三价铁离子的荧光光谱图。从 图 3 中可以看出在加入 2.2 倍当量三价铁离子后， 荧光强度趋于稳定。 0020 图 4 是将本发明荧光探针分子加入 HEPES 缓冲溶液 （pH7.0） （10M） 中， 黑色柱 状代表的是加入 40 倍当量 （Na+,Mg2+,Ca2+） 和 2 倍当量的各种金属离子 （Ag+,Mn2+,Cu2+,Hg2+, Pb2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+,Cr3+,Fe3+） 荧光变化， 斜线柱。
14、状代表的是加入2倍当量的各种金 属离子后再加入 2 倍当量三价铁离子离子荧光变化。从图 4 中可以看出加入其他各种金属 离子， 并不会引起探针的荧光变化， 只有三价铁离子能够影响探针的荧光变化， 铬离子有微 弱的影响， 同时也可以说明了在其他金属共同存在条件下， 探针分子对三价铁离子高度专 一选择性。 0021 图 5 是本发明荧光探针分子 （RD） 在 HEPES 缓冲溶液 （10M） 中不同 pH 值的变化， 从图 5 中可以看出在 pH=6-9， 荧光趋于稳定， 因此可用于生物监测中。 0022 图 6 是本发明荧光探针分子在细胞培养 24 小时后的细胞存活率。从图 6 中可以 看出， 。
15、浓度为 10M 时， 细胞存活率还有 98% 左右， 说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒 性作用， 因此可以用来做细胞检测及跟踪铁离子。 0023 图 7 是本发明荧光探针分子的荧光共聚焦成像照片， 其中图 a 为荧光探针分子 （10M） 在细胞培养 30 分钟后， 用 PBS 缓冲液 （pH7.4） 冲洗， 在荧光共聚焦显微成像， 在 530nm 激发下， 荧光发射收集范围 570-600nm ； 图 b 为是荧光探针分子 （10M） 在细胞培养 30 分钟后， 用 PBS 缓冲液 （7.4） 冲洗， 继续加入 （30M） 三氯化铁于细胞中培养 30 分钟， 用 PBS 缓冲液 （7.4） 。
16、冲洗， 在荧光共聚焦显微成像， 在 530nm 激发下， 荧光收集范围 570-600nm 的成像照片 ； 图 c 为 7402 细胞的明场 ； 图 d 为图 a， 图 b 以及图 c 的重叠图。 五、 具体实施方式 0024 下面通过实施例对本发明做进一步说明。 0025 实施例 1 ： 荧光探针分子 RD 的合成 0026 1、 中间体 1 的合成 0027 称取罗丹明 B5g（11.22mmol） 和水合肼 0.67g（13.46mmol） 于圆底烧瓶中， 加入 100mL 的乙醇溶剂， 装置冷凝管， 加热至 80回流， 用 TLC 跟踪至原料反应完毕， 停止反应。 旋干溶剂， 用乙醇重。
17、结晶， 得到 4.88g（10.66mmol） 白色固体中间体 1， 收率 95%。 说 明 书 CN 103421015 A 5 4/5 页 6 0028 1H NMR(CDCl 3,400MHz,ppm):1.15(12H,t,J=7.02Hz),3.34(8H,q,J=7.00Hz),3 .61(2H,s),6.45-6.29(6H,m),7.10(1H,m),7.45(2H,m),7.93(1H m).13C NMR(DMSO-d6,100M Hz,ppm),:12.41,43.64,64.71,97.35,105.4,107.73,122.12,123.47,127.68,132.3。
18、6,1 48.06,151.85,152.99,165.26. 0029 2、 中间体 2 的合成 0030 称取中间体 11.36g（3mmol）于圆底烧瓶中， 加入溶剂二氯甲烷 （10mL） ， 冰浴条 件下， 在快速搅拌下， 用恒压滴液漏斗慢慢滴加三乙胺 0.76g（7.5mmol） 和氯乙酰氯 0.5g （4.5mmol） ， 加入完毕后， 继续保持冰浴 30 分钟， 溶液颜色由粉红色变紫色。升至室温， 用 TLC跟踪至原料反应完毕， 停止反应。 旋干溶剂， 得到粗产品， 粗产品用乙酸乙酯和石油醚按 体积比 1:3 构成的混合溶剂重结晶得 1.2g（2.25mmol） 的中间体 2， 。
19、收率 75%。 0031 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6,ppm),:1.17(12H,t,J=7.03Hz),3.34(8H,q,J=7.02H z),3.61(2H,s),6.30(2H,m),6.44(4H,dd,J=16.14Hz),7.11(1H,t,J=8.26Hz),7.45(2H, m),7.94(1H,q,J=5.78Hz).13C NMR(DMSO-d6,100MHz,ppm):12.4,14.04,20.71,40.66,4 3.6,59.72,65.05,97.03,103.97,107.62,122.63,123.82,128.19,128.45,129。
20、.13,133.33 ,148.37,151.81,152.97,163.41,164.63,170.31. 0032 3、 探针分子 RD 的合成 0033 称取中间体 20.53g（1mmol） 、 2- 胺甲基吡啶 0.324g（3mmol） 、 碘化钾 0.5mg （0.003mmol） 和乙腈20mL于圆底烧瓶中， 加热至80回流反应8小时， 用TLC跟踪至原料反 应完毕， 停止反应， 冷却至室温， 反应液倒入水中， 乙酸乙酯萃取 315mL， 合并有机相， 有机 相用无水硫酸钠干燥， 旋干溶剂， 得粗产品， 粗产品用柱层析法提纯 （洗脱液体积比石油醚 ： 乙酸乙酯 =3:1） 得 。
21、0.36g（0.59mmol） 荧光探针分子 RD， 收率 60%。 0034 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6,ppm),:1.10(12H,t,J=6.9Hz),3.13(2H,s),3.34(8H, dd,J=6.8Hz,),3.56(2H,s),6.466.31(4H,m),6.57(2H,d,J=8.6Hz),7.08(1H,d,J=7.3H z),7.317.21(2H,m),7.60(2H,p,J=7.3Hz),7.74(1H,t,J=7.7Hz),7.88(1H,d,J=7.0Hz), 8.48(1H,d,J=4.6Hz),9.61(1H,s).13C NMR(DM。
22、SO-d6,100MHz,ppm):12.38,38.80,39.01 ,39.22,39.42,39.63,39.84,40.05,43.57,49.77,53.22,65.00,96.88,104.09,107.50,12 1.79,122.58,123.85,128.59,129.27,133.20,136.30,148.27,148.70,151.73,152.98,15 9.44,163.49,169.41. 0035 实施例 2 ： 荧光探针分子 RD 对三价铁离子的选择性 0036 将荧光探针分子溶于甲醇中制得 1mM 的母液， 取 100L 的母液于 10mL 容量瓶中， 再用。
23、 HEPES 水溶液 （pH7.0） 定容。当荧光探针分子溶液中加入 40 倍当量 （Na+,Mg2+,Ca2+） 和 2 倍当量的各种金属离子 （Ag+,Mn2+,Cu2+,Hg2+,Pb2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2+,Cr3+,Fe3+） 时， 荧 光探针分子在 550nm 激发下， 检测荧光光谱的变化。从图 4 中可以看出加入其他各种金属 离子， 并不会引起荧光探针的荧光变化， 只有三价铁离子能够影响探针的荧光变化， 铬离子 有微弱的影响， 同时也可以说明了在其他金属共同存在条件下， 荧光探针分子对三价铁离 子高度专一选择性。 0037 实施例 3 ： 荧光探针分。
24、子 RD 对 pH 的不敏感性 0038 使用荧光探针分子 RD 对 pH 的响应， 在生物模拟的条件下， 对荧光探针分子 pH 进 行研究， 在 pH=6-9， 荧光探针分子 （RD） 荧光强度不会随着 pH 的变化而变化 （图 5） ， 说明了 说 明 书 CN 103421015 A 6 5/5 页 7 本发明荧光探针分子可以很好的应用在细胞成像上。 0039 实施例 4 ： 细胞毒性测试 0040 MTT（3-（4， 5- 二甲基噻唑 -2） -2， 5- 二苯基四氮唑溴盐） 实验是根据已报道的 文章， 做一些细胞毒性测试。分别在同一批细胞中加入 10， 30， 50M 的荧光探针分子。
25、， 此条 件是在37、 含5%CO2的细胞培养箱中孵育24小时， 根据细胞存活度的公式 ： 细胞存活率 =OD570（样品） /OD570（对照组） 100， 可算得细胞存活率 （图 6） 。从图 6 中我们可以看出， 浓度为 10M 时， 细胞存活率还有 98% 左右， 说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒性作 用， 因此可以用来做细胞检测及跟踪三价铁离子。 0041 实施例 6 ： 细胞成像测试 0042 7402 细胞由 DEME（invitrogen） 培养液培养， 成像前一天， 7402 细胞放于平底表 面皿中， 成像时 7402 细胞和 10M 的荧光探针 RD 的 DMSO 溶液于。
26、 37、 含 5%CO2的细胞培 养箱中孵育 0.5 小时， 用中性的 PBS 缓冲溶液或培养液充分洗涤后， 用荧光共聚焦成像， 得 图 7a。向上述含荧光探针的细胞培养液中加入 （30M） 三氯化铁水溶液， 在 37、 含 5%CO2 的细胞培养箱中孵育0.5小时， 用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后， 再进行荧光共 聚焦成像， 得图 7b。从图 7 中可以看出， 图 7a 是未加三价铁离子的细胞成像图， 无荧光发 射， 图 7b 加入三价铁离子后的细胞成像图， 有强的红色荧光发射。 说 明 书 CN 103421015 A 7 1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103421015 A 8 2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103421015 A 9 3/4 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103421015 A 10 4/4 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 103421015 A 11 。