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1、(10)申请公布号 CN 103436497 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436497 A *CN103436497A* (21)申请号 201310235390.6 (22)申请日 2013.06.14 CCTCC NO ： V201313 2013.05.28 C12N 7/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市文化路 95 号 (72)发明人 崔保安 陈红英 吴宇阳 陈龙彪 魏战勇 李新生 (74)专利代理机构 郑州中原专利事务所有限公 司 41109 代理人 范之敏 (5。
2、4) 发明名称 一种猪细小病毒毒株 (57) 摘要 本发明公开了一种猪细小病毒毒株， 猪细小 病毒 （Parvoviridae） ， CCTCCNO ： V201313。本发 明采用 PCR 方法对河南地区采集的疑似 PPV 病 料进行 PCR 检测， 通过接种猪睾丸 （ST） 细胞分离 到 1 株病毒， 命名为 HP104。通过观察细胞病变、 生物学特性研究、 电镜观察病毒的形态等途径证 实分离的病毒为猪细小病毒。本发明将猪细小病 毒 HP104 株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂， 然 后接种健康豚鼠， 28天后检测到HI抗体水平达到 128， 而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明 河南分离。
3、株 PPVHP104 具有良好的免疫原性。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 19 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书19页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103436497 A CN 103436497 A *CN103436497A* 1/1 页 2 1. 一种猪细小病毒毒株， 其特征在于， 猪细小病毒 （Parvoviridae） ， CCTCC NO ： V201313。 权 利 要 求 书 CN 103436497 A 2 1/19 页 3 一种猪细小病毒毒株 技术领域 0。
4、001 本发明涉及一种猪细小病毒毒株的制备方法。 背景技术 0002 猪细小病毒 (Porcine parvovirus， PPV) 是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之 一。能够导致受感染母猪产出死胎、 畸形胎、 木乃伊胎及病弱仔猪， 同时还会引起仔猪皮炎 症状、 非化脓性心肌炎和消瘦性综合征。猪细小病毒又常同猪伪狂犬病毒、 猪圆环病毒、 猪 瘟、 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。 0003 一些科研工作者曾经做过河南地区猪细小病毒的流行病学调查， 发现很多猪场都 有 PPV 抗体阳性猪存在， 说明河南地区 PPV 的感染情况比较严重， 给河南地区养猪业造成 了重大的经济损失。
5、。在当前情况下， 对河南地区存在的猪细小病毒进行研究也就显得尤为 重要。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种猪细小病毒毒株， 分类命名 ： 猪细小病毒， 拉丁文学名 ： Parvoviridae， 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心， 保藏单位简称 ： CCTCC， 保藏单位地 址 ： 湖北省武汉市武昌区珞珈山路 16 号武汉大学， 保藏日期 ： 2013 年 5 月 28 日 , 保藏编号 CCTCC NO ： V201313。 0005 本发明的技术方案是 ： 一种猪细小病毒毒株， 猪细小病毒 （Parvoviridae） ， CCTCC NO ： V201313。 0006 本。
6、发明的有益效果是 ： 本发明采用 PCR 方法对河南地区采集的疑似 PPV 病料进行 PCR 检测， 通过接种猪睾丸 （ST） 细胞分离到 1 株病毒， 命名为 HP104。通过观察细胞病变、 生物学特性研究、 电镜观察病毒的形态等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。 0007 本发明将猪细小病毒 HP104 株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂， 然后接种健康豚 鼠， 28 天后检测到 HI 抗体水平达到 128， 而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明河南 分离株 PPV HP104 具有良好的免疫原性。 附图说明 0008 图 1 为组织病料中 PPV 的 PCR 扩增结果， 其中 M. DNA 。
7、Marker DL 2000; 1. 病料 中的 PPV 的 PCR 扩增产物 ; 2. 阴性对照 ； 图 2 为 HP104 株电镜照片 ； 图 3 为猪细小病毒 HP104 全基因组各片段 PCR 扩增结果， M. DNA Marker DL2000; 1. P1/P2扩增结果; 2. P3/P4扩增结果; 3. P5/P6扩增结果; 4. P7/P8扩增结果;5.阴性 对照 ； 图 4 为重组质粒 PCR 鉴定结果， M. DNA Marker DL2000; 1. P1/P2 扩增片段 ; 2. P3/ P4 扩增片段 ; 3. P5/P6 扩增片段 ; 4.P7/P8 扩增片段 ;5。
8、. 阴性对照 ； 说 明 书 CN 103436497 A 3 2/19 页 4 图 5 为 PPV 不同分离株基因的核苷酸序列同源性分析 图 6 为 PPV 全基因序列系统发育进化树。 具体实施方式 0009 一种猪细小病毒毒株， 猪细小病毒 （Parvoviridae） ， CCTCC NO ： V201313。 0010 一 猪细小病毒毒株 HP104 的分离鉴定和生物学特性的研究 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料组织和细胞株 病料组织采自河南省新乡市某猪场病死仔猪的胎衣、 肝脏、 脾脏、 肺脏和淋巴结。河南 省新乡市某猪场1000头母猪， 2012年9月有10头初产母猪流。
9、产、 死产， 母猪无明显症状， 而 断奶仔猪被毛粗糙、 精神沉郁。根据发病情况， 怀疑是 PPV 感染） 猪睾丸 （ST） 细胞购自中国 兽药监察所 （冻存） 。 0011 1.1.2 HA 试剂的配制 0.01 M PBS 液的配制 ： 取氯化钠 8 g， 氯化钾 0.2 g， 磷酸二氢钠 1.15 g， 磷酸氢二钾 0.2 g， 溶于800 mL三蒸水中充分溶解后定容至1000 mL， 调pH值到7.4， 高压灭菌后4保 存备用。 0012 抗凝剂 （3.8% 柠檬酸钠） 的配制 ： 称取柠檬酸钠 3.8g， 加灭菌蒸馏水至 100 mL， 装 瓶备用。 0013 0.6% 豚鼠红细胞悬液。
10、制备 ： 按常规方法心脏采集健康豚鼠血液 （每毫升血液加入 抗凝剂 0.2 mL） ， 将血液注入离心管中， 经 2000 rpm 离心 10min， 用移液器吸去上清液和红 细胞上层的白细胞薄膜， 将沉淀的红细胞用 PBS 液洗涤， 如此反复洗涤三次， 第三次离心 10 min 后弃上清液， 加 PBS 配制成 0.6% 的红细胞悬液。 0014 1.2 引物设计 从 GenBank 中下载多条具有代表性的猪细小病毒基因组序列， 利用 DNAStar 软件寻找 非结构蛋白NS1基因中的序列。 应用Primer premier 5.0 软件设计出扩增195 bp的引物 P1 和 P2， 用于检。
11、测 PPV。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 0015 P1 5- CCA AAA ATG CAA ACC CCA ATA-3 P2 5- ATCT GGC GGT GTT GGA GTT AAG-3 1.3 病料的 PCR 检测和处理 1.3.1 病料的 PCR 检测 采用蛋白酶 K 法提取病料组织 ( 死胎胎衣、 肝脏、 脾脏、 肺脏和淋巴结 )DNA。以病料组 织 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增反应， 扩增体系为 2PCR Taq Mix 聚合酶 12 L， 模板 DNA 3 L， 引物 P1 和 P2 各 0.5 L， 补超纯水至 25 L。混匀后于 PCR 仪上进行扩增， 。
12、同时设无 模板的阴性对照。反应条件为 95预变性 5 min ； 94 1 min， 53 50 s， 72 50 s， 共 30 个循环 ； 最后 72延伸 10 min。反应结束后， 取 5 L PCR 产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶 （含 0.5 g/mL EB） 进行电泳检测 PCR 结果。 0016 如果 PCR 检测结果为阳性， 则将 PCR 产物回收纯化并连接到 T 载体上， 经连接产物 的转化、 重组质粒的提取、 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定等过程， 对鉴定的阳性克隆进行序列 说 明 书 CN 103436497 A 4 3/19 页 5 测定， 由上海生物工程有限公司完成。
13、， 1.3.2 病料的处理 将 PCR 检测为阳性的病料组织按 1 ： 5(w/V) 加入含青霉素 l 000 U/mL 和链霉素 1 000 U/mL 的灭菌 PBS 液， 经研钵研磨后， 放入 -20冰箱中， 反复冻融 3 次， 再用 0.22 m 的细菌 滤器过滤除菌。 0017 1.4 病毒的培养与增殖 将处理后的病料按培养液量的 1/10 同步接种到 ST 细胞中， 置于 5%CO2 37恒温培养 箱中培养 72 h。收获接毒细胞， 反复冻融 3 次收集病毒， 8000 rpm 离心 30min 去除细胞碎 片， 此为第 1 代毒， 命名为 PPV HP104。按 10% 接毒量盲传。
14、至细胞出现了较稳定的细胞病变 （CPE） ， 此后按培养液体积的 2% 接毒， 用同样的方法将该毒株连续传代到第 25 代。 0018 1.5 细胞病变观察 将状态良好长成单层的 ST 细胞用 0.25% 胰酶按常规方法消化后， 同步接种 PPV HP104 第 10 代细胞培养物， 置于 5%CO2 37恒温培养箱中培养。逐日观察细胞病变直至收获病 毒。 0019 1.6 病毒滴度 TCID50的测定 将消化吹散的 ST 细胞悬液加入 EP 管中， 取 PPV HP104 第 10、 15、 20、 25 代细胞培养物 分别连续倍比稀释 10-1 10-10， 在细胞培养箱中孵育 1h 后接。
15、种到 96 孔板中， 每孔 200 L， 每个稀释度各作 6 个重复， 逐日观察细胞病变情况， 并按照 Reed-Muench 法计算病毒滴度 TCID50。 0020 1.7 病毒血凝效价的测定 在 96 孔 “V” 型微量反应板上， 加入 50 L PBS 液于反应板的第 1 孔至第 12 孔， 再加 50L PPV HP104 第 10、 15、 20、 25 代细胞培养物于每排第 1 孔， 按倍比稀释至第 11 孔， 弃去 50 L， 第 12 孔为阴性对照孔， 加 50 L 0.6% 的豚鼠红细胞悬液于每孔。在微量震荡器 上摇匀 10 s， 放置 37温箱静置 1 h， 以 50% 。
16、红细胞凝集为终点， 样品出现凝集终点的最高 稀释度为该病毒液 HA 效价。 0021 1.8 理化特性研究 取 5 只灭菌的离心管， 在超净台内分别加入 3 mL PPV HP104 第 20 代细胞液。第 1 管 加入终浓度为 4.8% 的分析纯氯仿混合振荡， 置于 4 作用 10 min， 随后用 500 rpm 的速度 离心 5 min， 然后吸取上层液体 ； 第 2 管用 0.1 mol/L 的盐酸调 pH 至 3.0， 于 37水浴作用 2 h， 再用 5.6% 的 NaHCO3 溶液将 pH 值调回至 7.2 ； 第 3 管置于 56水浴中作用 30 min ； 第 4 管加入 1。
17、% 的胰蛋白酶置 37水浴作用 1 h 后， 用灭活胎牛血清终止其作用 ； 第 5 管不处 理作为正常对照。然后分别 ST 传代细胞按常规方法测定其 TCID50。 0022 1.9 形态学观察 取PPV HP104第25代细胞培养物在-20反复冻融3次， 用超声波将其处理3次， 每次 5 min， 在 4 条件下 12 000 rpm 离心 1 h， 取上清液用 1N NaOH 把 pH 调至 8.0 ； 缓缓加入 PEG-6000 至 10%， 0.5M NaCL， 搅拌 1 h 后放置在 4过夜， 过夜后 20 000 rpm 离心 1 h， 沉淀物用少量 TEI 液溶解， 20 000。
18、 rpm 离心 30 min， 取上清后以 50 000 rpm 离心 2.5 h， 然后将上清弃去， 用少量 TEI 把沉淀物溶解， 12 000 rpm 离心 15 min， 上清液就是浓缩的 PPV 病毒液， 取 2 L 涂在柱上， 用电镜进行观察照相。 说 明 书 CN 103436497 A 5 4/19 页 6 0023 2 结果 2.1 病料的 PPV 检测结果和测序结果 从疑似 PPV 感染的病料组织中提取 DNA， 进行 PCR 扩增， 扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳 检测表明， 获得了 1 条约 200 bp 的的特异性带 ( 图 1)， 与预期片段大小相符。 0024 阳性克。
19、隆测序结果表明PCR扩增片段长度为195bp， 与预期结果相符合。 将阳性片 段序列与 Genbank 中已发表的多株猪细小病毒序列进行核苷酸同源性比较后， 发现同源性 可达到 100。测序结果如下 ： ccaaaaatgc aaaccccaat aaatacacca acagactctc agatttccac atcagtgaaa 60 acttcgccag cggacaacaa ctacgcagca actccaatac aggaggacct ggatttagct 120 ttagccttgg agccgtggag cgagccaaca acaccaactt tcaccaacct gcac。
20、ttaact 180 ccaacaccgc cagat 195 2.2 PPV HP104 株的分离培养与细胞病变观察 将处理后的病料接种于 ST 细胞， 盲传至第 5 代细胞出现轻微的 CPE， 第 10 代时细胞出 现了较稳定的 CPE。正常的 ST 细胞紧密地贴壁生长， 接毒第 10 代后细胞内颗粒增多， 随后 出现病毒蚀斑， 蚀斑周围细胞圆缩， 接着大片脱落， 细胞拉网， 很多细胞发生裂解、 破碎， 部 分细胞碎片仍贴附在细胞培养瓶壁上。 0025 2.3 病毒滴度 TCID50结果 分别对 PPV HP104 不同代次的病毒液进行 TCID50测定， 通过倒置显微镜观察， 接毒后 3。
21、 天待细胞出现脱落、 拉网等明显的 CPE 后， 统计并按 Reed-Muench 方法计算毒株的 TCID50， 结果见表 1。 0026 表 1 TCID50测定结果 (TCID50/0.1mL) 通过表1可知， 随着病毒的传代增殖， PPV HP104 株的TCID50值有所升高， 到20代时趋 于稳定。 0027 2.4 病毒血凝效价的测定结果 从表 2 可知， 随着病毒的传代增殖， PPV HP104 株病毒液的血凝效价有所升高， 到 15 代 时趋于稳定。 0028 表 2 血凝效价测定结果 2.5 PPV HP104 株理化特性的研究 从表 3 可以看出， 分离获得的病毒对分析纯。
22、氯仿有较强的抵抗力， 属于无囊膜病毒 ； 能 说 明 书 CN 103436497 A 6 5/19 页 7 够耐受 pH3.0 的盐酸处理 2 h， 对酸有较强的抵抗力 ； 能够耐受 56水浴处理 30 min， 对热 有较强抵抗力 ； 能够耐受 1% 的胰蛋白酶处理 1 h， 对胰蛋白酶也有较强的抵抗力。这些理 化特性均符合猪细小病毒的理化特性。 0029 表 3 理化特性的检测结果 处理方法发明组 TCID50/0.1mL对照组 TCID50/0.1mL对数差值 耐氯仿发明10-8.410-8.50.1 耐酸发明10-8.210-8.50.3 耐热发明10-8.210-8.50.3 耐胰。
23、酶发明10-8.410-8.50.1 2.6 病毒形态学观察结果 将 PPV HP104 株的细胞毒做适当处理后， 置电镜下观察。可在细胞核内看到大小均一、 近似球形的病毒粒子， 大小约2326nm， 与已报道的PPV形态基本吻合， 未见其它形态的病 毒粒子 （图 2） 。 0030 PPV 的培养最好以猪源细胞进行培养， 特别是猪肾原代细胞， 其次是传代细胞。本 发明选用ST细胞进行PPV的增殖， 出现较为明显的细胞病变， 并能达到较高的病毒滴度。 由 于 PPV 的增殖是在细胞周期的晚 S 期和早 G2 期， 即细胞生长的旺盛期， 因此病毒的最佳接 毒时间是在传代细胞的同时进行， 即同步接。
24、毒。 本发明采用同步接毒的方法进行接毒， 此时 病毒的增殖量比较高， 病变稳定明显， 与张超范等的研究报道相一致。 0031 本发明对分离的 PPV HP104 株传代增殖并对不同代次的病毒滴度 TCID50和病毒 血凝效价进行测定， 结果显示 HP104 株的 TCID50以及血凝效价随着病毒的传代增殖有所升 高并趋于稳定， 说明该毒株具有遗传稳定性。通过对 HP104 株理化特性研究， 结果表明该毒 株经氯仿、 56热处理、 pH3.0 的酸处理和胰酶处理过程后， 经 ST 细胞培养观察， 其对细胞 的感染力无明显改变， 引起的 CPE 与李刚明等的研究报道一致， 说明该毒株对上述理化因 。
25、素均不敏感。 经电镜观察， 可见有圆形、 2326nm大小的病毒粒子， 与已知的猪细小病毒粒 子形态基本吻合。以第 25 代细胞毒 DNA 为模版， 进行 PCR 扩增， 其产物与预期大小相一致， 与其它 PPV 毒株同源性较高。因此， 本发明成功筛选出一株病毒滴度和血凝效价高、 稳定， 且细胞病变明显的猪细小病毒毒株， 并对其生物学特性进行了研究。 0032 二 猪细小病毒毒株 HP104 的全基因组克隆与序列分析 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及载体 基因工程菌 DH5 由本实验室制备并保存 ； pGEM-T Easy Vector System 购自宝生物 工程有限公司。。
26、 0033 1.1.2 病毒株 猪细小病毒毒株 HP104， 保藏编号 CCTCC NO ： V201313。 0034 1.2 引物设计 根据 Genbank 公布的 PPV 序列， 同时参考顾帅等人设计的引物， 我们优化设计了 4 对相 互重叠片段的引物 （表4） ， 用于扩增包括全部编码区在内的PPV全基因序列。 引物送由上海 生工生物工程有限公司合成。 0035 表 4 PPV 扩增引物 说 明 书 CN 103436497 A 7 6/19 页 8 1.3 病毒 DNA 的提取及全基因序列的分段扩增 采用蛋白酶 K 法提取病毒 DNA。以 PPV HP104 株 DNA 为模板， 进。
27、行 PCR 扩增反应， 通过 对 PCR 扩增条件优化， 确定如下扩增方案 ： 片段P1/P2的扩增体系如下 ： Ex Taq DNA聚合酶25 L， 模板DNA 6 L， 上、 下游引 物各 1 L， 补超纯水至 50 L。混匀后于 PCR 仪上进行扩增， 同时设无模板的阴性对照。 反应条件为95预变性5 min ； 941 min， 58.950 s， 7250 s， 共30个循环 ； 最后72 延伸 10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。 0036 片段P3/P4的扩增体系如下 ： Ex Taq DNA聚合酶25 L， 模板DNA 6 L， 上、 下 游引物各 1 L， 补超。
28、纯水至 50 L。混匀后于 PCR 仪上进行扩增， 同时设无模板的阴性对 照。反应条件为 95预变性 5 min ； 94 1 min， 52.6 50 s， 72 50 s， 共 30 个循环 ； 最 后 72延伸 10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。 0037 片段P5/P6的扩增体系如下 ： Ex Taq DNA聚合酶25 L， 模板DNA 6 L， 上、 下 游引物各 1 L， 补超纯水至 50 L。混匀后于 PCR 仪上进行扩增， 同时设无模板的阴性对 照。反应条件为 95预变性 5 min ； 94 1 min， 60 50 s， 72 50 s， 共 30 个循环 。
29、； 最后 72延伸 10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。 0038 片段P7/P8的扩增体系如下 ： Ex Taq DNA聚合酶25 L， 模板DNA 6 L， 上、 下 游引物各 1 L， 补超纯水至 50 L。混匀后于 PCR 仪上进行扩增， 同时设无模板的阴性对 照。反应条件为 95预变性 5 min ； 94 1 min， 52.4 50 s， 72 50 s， 共 30 个循环 ； 最 后 72延伸 10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。 0039 1.4 PPV 全基因组序列各片段的克隆和鉴定 如果 PCR 检测结果为阳性， 则将 PCR 产物回收纯化并连。
30、接到 T 载体上， 经连接产物的转 化、 重组质粒的提取、 重组质粒的 PCR 鉴定等过程， 对鉴定的阳性克隆进行序列测定， 由上 海生物工程有限公司完成。 0040 1.5 PPV 全基因组序列的测定与分析 在上海生物工程有限公司提交测序结果后， 将四段序列进行拼接得到 HP104 全基因序 列。用 DNAStar 软件将 HP104 全序列与 Genbank 上已发表的序列进行比较和分析。所参照 说 明 书 CN 103436497 A 8 7/19 页 9 的毒株均为 Genbank 上收录的典型毒株 （如表 5） 。 0041 表 5 所用毒株登录号 2 结果 2.1 猪细小病毒 HP。
31、104 各片段的扩增结果 对猪细小病毒 HP104 各片段进行扩增， 四段重叠片段的理论长度分别为 1611bp、 1485bp、 680bp 和 1858bp， 扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测结果如下， 表明扩增产物大小 与预期相符 （如图 3） 。 0042 2.2 各克隆片段重组质粒的 PCR 鉴定 则将PCR产物回收纯化并连接到T载体上， 经过连接产物的转化后， 对重组质粒进行提 取和 PCR 鉴定， 结果如图 4 所示。 0043 2.3 PPV HP104 的测序与拼接 用 DNAStar 软件将四段序列进行拼接， 得到猪细小病毒 HP104 株全基因序列。拼接结 果表明， 猪细小。
32、病毒 HP104 全基因序列为 4679bp， 如下。 0044 aggtggagcctaacactataaatacagttgcttagttcagttagttcctttctgcttcag 60 actgcacttcgctccagagacacagctacaaactacactcagctactgcagcatggcagc 120 说 明 书 CN 103436497 A 9 8/19 页 10 gggaaacacttactcggaagaggtactaaaagctaccaactggcttcaagataatgctca 180 aaaagaagcattctcttatgtatttaaaacacaaaaagtc。
33、aatctaaatggaaaagaaat 240 tgcttggaataactacaacaaagatacaacagatgcggaaatgatagacctacaaagagg 300 agcagaaacatcatgggaccaggcaacagacatggaatgggaatcagaaatcgacagcct 360 cacaaaacggcaagtactgatttttgactctcttgttaaaaaatgtctctttgaaggtat 420 attgcaaaagaacctaagtccaagtgactgctactggttcatacagcatgaacatggtca 480 agatactggctatca。
34、ctgccatgtactactaggtggaaaaggcttacaacaagcaatggg 540 aaaatggttcagaaaacaattaaacaatttatggagtagatggttaataatgcaatgcaa 600 agtacctctaacaccagttgaaagaataaaattaagggaattagcagaggatggtgagtg 660 ggtatcgctactaacctacactcacaaacaaactaaaaaacaatatacaaaaatgactca 720 ttttggaaatatgattgcttactacttcctaaataaaaaaagaaagacaactgaa。
35、agaga 780 gcatggatattatctcagctcagattctggcttcatgacaaatttcttaaaagaaggcga 840 gagacacttagtcagtcacctatttactgaagcaaataaacctgaaactgtggaaacaac 900 ggttactacagctcaggaagccaaaagaggcagaatacaaacaaaaaaagaagtaagcat 960 aaaatgcacaataagagacttggttaataaaagatgtactagcatagaagactggatgat 1020 gacagatccagacagttatatagaaatga。
36、tggctcaaaccggaggagaaaatttaatcaa 1080 aaatacactagaaataacaactcttactctagcaagaacaaaaacagcatatgacttaat 1140 acttgaaaaggcaaaaccaagcatgctaccaacatttaatattagcaatacaagaacatg 1200 taaaatattcagcatgcacaattggaactacattaaagtctgccatgctataacttgtgt 1260 actaaacagacaaggaggaaaaagaaatacaattctatttcatgggccagcatcaacagg 1320。
37、 aaaaagtataattgctcaacacattgcaaacttagttggtaatgttggttgctacaatgc 1380 agccaatgttgaactttccatttaatgactgtacaaataaaaacttaatatggattgaag 1440 aagcaggaaacttctctaaccaagtaaaccaattcaaagccatatgttcaggtcaaacaa 1500 ttagaattgaccaaaaaggtaaaggaagcaaacaaattgaaccaactcctgtaataatga 1560 ctacaaatgaagacataactaaagttagaatagga。
38、tgcgaggaaagaccagaacatacac 1620 aaccaataagagacagaatgttaaacatacacctaaccagaaaactgccaggtgattttg 1680 gacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggttggtaaagaaaggttacc 1740 aagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtacctgattggtcagaaaaat 1800 gggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacat 1860 cagtg。
39、aaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctgg 1920 atttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgc 1980 acttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaagtccaacttggtcggaaa 2040 tagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcacccacaacaaaccttgaat 2100 aaggtaggatggcgcctcctgcaaaaagagcaagaggtaag。
40、ggtagttttaagggggtgg 2160 tgggcatacatataaaactaactgcaaataatttttttatatattacaggactaactcta 2220 ccaggatacaaataccttggtccaggaaactcactagaccaaggagaaccaactaatcca 2280 tcagacgccgcagcaaaagaacacgacgaagcctacgacaaatacataaaatctggaaaa 2340 aatccatacttctacttctcagcagctgatgaaaaattcataaaagaaactgaacacgca 2400 aaagactacgg。
41、aggtaaaattggacattacttcttcagagcaaagcgtgcctttgctcca 2460 说 明 书 CN 103436497 A 10 9/19 页 11 aaactctcagaaacagactcaccaactacatctcaacaaccagaggtaagaagatcgccg 2520 agaaaacacccagggtctaaaccaccaggaaaaagacctgctccaagacatatttttata 2580 aacttagctaaaaaaaaagctaaagggacatctaatacaaactctaactcaatgagtgaa 2640 aatgtggaacaac。
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43、atgcacacaca 2940 caaatggtaacaccttggtcactaatagatgctaacgcatggggagtgtggttcaatcca 3000 gcggactggcagttaatatccaacaacatgacagaaataaacttagttagttttgaacaa 3060 gaaatattcaatgtagtacttaaaacaattacagaatcagcaacctcaccaccaaccaaa 3120 atatataataatgatctaactgcaagcttaatggtcgcactagacaccaataacacactt 3180 ccatacacaccagcagcac。
44、ctagaagtgaaacacttggtttttatccatggttacctaca 3240 aaaccaactcaatacagatattacctatcatgcatcagaaacctaaatccaccaacatac 3300 actggacaatcacaacaaataacagactcaatacaaacaggactacacagtgacattatg 3360 ttctacacaatagaaaatgcagtaccaattcatcttctaagaacaggagatgaattctcc 3420 acaggaatatatcactttgacacaaaaccactaaaattaactcactcatggcaaa。
45、caaac 3480 agatctctaggactgcctccaaaactactaactgaacctaccacagaaggagaccaacac 3540 ccaggaacactaccagcagctaacacaagaaaaggttatcaccaaacaattaataatagc 3600 tacacagaagcaacagcaattaggccagctcaggtaggatataatacaccatacatgaat 3660 tttgaatactccaatggtggaccatttctaactcctatagtaccaacagcagacacacaa 3720 tattatgatgatgaaccaaatggtg。
46、ctataagatttacaatgggttaccaacatggacac 3780 ttaaccacatcttcacaagagctagaaagatacacattcaatccacaaagtaaatgtgga 3840 agagctccaatgcaacaatttaatcaacaggcaccactaaacctagaaaatacaaataat 3900 ggaacacttttaccttcagatccaataggagggaaatctaacatgcatttcatgaataca 3960 ctcaatacatatggaccattaacagcactaaacaatactgcacctgtatttccaaatggt 。
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