利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103451115 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451115 A *CN103451115A* (21)申请号 201310356776.2 (22)申请日 2013.08.15 C12N 1/19(2006.01) A23L 1/015(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人 唐语谦 陈艺 钟凤 吴晖 肖俊梅 赖富饶 余以刚 肖性龙 李晓凤 刘冬梅 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代。

2、理人 裘晖 (54) 发明名称 利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯 酮的方法 (57) 摘要 本发明属于食品处理领域， 公开了一种利用 重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方 法。该方法包含如下具体步骤 ：（1） 制备得到重组 毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx ； 将重组菌接 种于 BMGY 培养基中， 振荡培养至 OD600 为 2 6， 离心收集菌体 ；（2） 用无菌 BMMY 液体培养基将菌 体重悬， 控制菌悬液 OD600 值为 0.9 1.1 ； 28 30， 200 250r/min 下每 24h 添加甲醇， 连续诱 导培养 3d 后， 室温离心收取上清液，。

3、 即得到重组 过氧化物 A4-Prx 粗酶液 ；（3） 将步骤 （2） 的粗酶 液与食品样品液混合， 反应后， 即得到降解玉米赤 霉烯酮后的食品样品液， 其玉米赤霉烯酮降解率 高达 70% 以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103451115 A CN 103451115 A *CN103451115A* 1/1 页 2 1. 一种利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特征在于包括如。

4、下具 体步骤 ： （1） 通过 PCR， 在 SEQ ID NO.1 的序列的 5 端添加 Avr 酶切位点， 在 3 端添加 Not I 酶切位点， 得到带有 Avr 和 Not I 酶切位点的序列 ； 接着通过 Avr 和 Not I 酶分别双 酶切pPIC9K载体和前述带有Avr和Not I酶切位点的序列 ； 然后将酶切后的载体和序列 连接， 得到 A4-Prx 基因插入 pPIC9K 载体上的重组质粒 pPIC9K-A4-Prx， 将其转化到巴斯德 毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115 中， 得到重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx ； （2） 将重。

5、组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 接种于 BMGY 培养基中， 振荡培养至 OD600 为 2 6， 离心收集菌体 ； 洗涤， 用无菌 BMMY 液体培养基将菌体重悬， 控制菌悬液 OD600值为 0.9 1.1 ； 28 30， 200 250r/min 下每 24h 添加甲醇， 连续诱导培养 3d 后， 室温离心 收取上清液， 即得到重组过氧化物 A4-Prx 粗酶液 ； （3） 将步骤 （2） 的重组过氧化物 A4-Prx 粗酶液与食品样品液混合， 反应后， 即得到降解 玉米赤霉烯酮后的食品样品液。 2. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯。

6、酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （2） 所述的 BMGY 培养基的 pH 值为 6 8 ； 所述的 BMMY 液体培养基的 pH 值为 6 8 ； 所述的 BMMY 液体培养基中含有 0.5% 体积浓度的甲醇用于诱导。 3. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （2） 所述的添加甲醇指添加至甲醇的终体积浓度为 0.5%。 4. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （2） 所述的振荡培养指在2830， 振荡频率为200250r/min下培养18h。 5. 根据权利要求 。

7、1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （2） 所述的离心收集菌体指在速率为 4000 5000r/min 下离心 5 10min。 6. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （2） 所述的离心收取上清液指在速率为800012000r/min下离心510min。 7. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （3） 所述的食品样品液由以下方法得到 ： 取 1g 粉碎的食品， 加入 4mL 体积分数 为 84% 的乙腈水溶液， 常温 。

8、200r/min 速率下振荡 1h， 静止放置， 得到食品样品液。 8. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （3） 所用重组过氧化物 A4-Prx 粗酶液的量为每 4mL 食品样品液使用 160mL 粗 酶液， 并添加 40mL0.25mol/L Tris-HCl（pH8.5） 缓冲液和 8mL0.5mol/L H2O2水溶液混合均 匀。 9. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其特 征在于 ： 步骤 （3） 所述的反应是在 40下反应 12h。 10. 根据权利要求 1 所述的利用重组毕赤。

9、酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 其 特征在于 ： 步骤 （3） 所述的食品指谷物类食品。 权 利 要 求 书 CN 103451115 A 2 1/9 页 3 利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法 技术领域 0001 本发明属于食品处理领域， 具体涉及一种利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤 霉烯酮的方法。 背景技术 0002 玉米赤霉烯酮 （zearalenone， ZEA， ZEN） 是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的雌激 素类真菌毒素， 由玉米赤霉菌、 禾谷镰刀菌、 三线镰刀菌等菌产生， 主要污染小麦、 大麦、 燕 麦、 玉米等农作物。据联合国粮农组织 （FAO） 2002 。

10、年资料， 每年全世界约有 25% 的农作物粮 食被霉菌毒素污染， 而我国每年由于霉变所引起的饲料损失占总产量的 10% 以上。 0003 ZEN 性质稳定难降解， 玉米及其副产品极易受 ZEN 污染， 从而导致大量食品中高水 平的残留量。 ZEN会引起种猪或家禽早熟， 生殖周期紊乱， 给种猪等养殖业带来巨大的损失， 进一步对摄入被 ZEN 污染的农、 畜产品的人引发多种中毒症、 中枢神经受损， 甚至死亡。从 全国仓库和饲料厂中抽样检测， 发现玉米等农作物和饲料中 ZEN 的检出率高达 100%， 检出 浓度超标严重。谢良民等对上海市大型超市中多类食品调查结果表明， ZEN 的检出率极高， 其中。

11、调味品均超出国家标准 （食品中 ZEN 含量 60g/kg） ， 且最高达 150g/kg （谢良民 , 葛懿云 , 李俊旋 . 上海零售食品中玉米赤霉烯酮含量初步研究 J. 中国科协第五届青年 学术年会文集 ,2004,756.） 。王金荣等对酒糟蛋白饲料 （DDGS） 多个样品调查结果显示， ZEN 的阳性检出率均为 100%， ZEN 含量达 1219.90g/kg 以上， 超出国家标准 （我国 2006 年饲料 卫生标准规定玉米类饲料中 ZEN 含量 500g/kg） 2 倍以上， 其对以 DDGS 为饲料的禽畜危 害深远 （王金荣 , 马鹏 , 黄亚宽 , 等 .2010 年上半年 。

12、DDGS 常规养分含量差异及霉菌毒素污 染状况调查J.饲料工业,2011,32(17):61-64.） 。 此外， 有研究表明十余种市售谷物相关 食品中 ZEN 检出率也高达 76.90%。 0004 生物转化脱毒 ZEN 技术能避免物理和化学方法的去毒效果有限、 营养物质损失 大、 成本高和有害物质残留等缺点， 已成为研究热点和主要趋势。日本 Takahashi-Ando 等人对粉红粘帚霉 （Clonostachys rosea） 的研究较为全面， 分离出的内酯水解酶 zhd101 可破坏 ZEN 结构， 使其转化为雌激素毒性较弱的化合物， 且 ZEN 的降解率在 80 90% 之 间 （K。

13、imara M,Naoko T,Nishiu-chi T.Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination.Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,86(3):117-123.） 。大肠杆菌和酿酒酵母表达的重组 zhd101 表现出了内 酯水解酶的能力， 对 ZEN 的降解率可达 75%， 具有 zhd101 的转基因玉米也具备降解 ZEN 的 能力 （Tomoko I,Naoko T,Noriyuki O,et al.Redu。

14、ced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(5):1622-162 9.） 。 0005 此外， 奥地利 Molnar 从白蚁后肠中分离出了一种新酵母菌毛孢子菌 属 Trichosporon mycotoxinivorans， 它 的 培 养 物 能 将 ZEN 降 解 为 二 氧 化 碳 。

15、和 其 说 明 书 CN 103451115 A 3 2/9 页 4 它 弱 紫 外 吸 收 的 代 谢 物， 从 而 降 低 其 毒 性 （Molnar O,Schatzmayr G,Fuchs E,et al.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov.,a new yeast species useful in biological detoxification of various mycotoxins.Systematic and Applied Microbiology,2004,27:661-671.） 。 0006 Abdullah 从玉米地里分离。

16、的假单胞菌 ZEA-1 可利用 ZEN 为唯一碳源， 并且在 12h 内可将 ZEN 减少一半， 编码此 ZEN 降解酶的基因在大肠杆菌中也获得了活性表达 （Abdulla D.Altalhi,Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxification gene(s)in pZEA-1plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1and expressed in Escherichia coli.J Hazard Mater,2009,161:1166-1172.） 。 0007 唐语谦等从玉米耕种的土壤中分离获得了。

17、一株可高效降解 ZEN 的不动杆 菌 Acinetobacter sp.SM04（Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui Wu,Yuqian Tang,et al.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobacter sp.SM04liquid cultures.Biodegradation,2011,22:613622.） ， 并从中分离到一个过 氧 化 物 酶 Prx（Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui Wu,Yuqian Tang， et al.Oxidation。

18、 of zearalenone by extracellular enzymes from Acinetobacter sp.SM04into smaller estrogenic products.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27:26 75-2681.） 。 发明内容 0008 为了克服现有技术的缺点与不足， 本发明的目的在于提供一种利用重组毕赤酵母 菌降解食品中玉米赤霉烯酮 （zearalenone， ZEA， ZEN） 的方法， 该方法对食品中 ZEN 毒素的 去除率可达 70% 以上。 0009 本发明的目。

19、的通过下述技术方案实现 ： 0010 一种利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法， 包含如下具体步骤 ： 0011 （1） 通过 PCR， 在 SEQ ID NO.1 的序列的 5 端添加 Avr 酶切位点， 在 3 端添加 Not I 酶切位点， 得到带有 Avr 和 Not I 酶切位点的序列 ； 接着通过 Avr 和 Not I 酶分 别双酶切pPIC9K载体和前述带有Avr和Not I酶切位点的序列 ； 然后将酶切后的载体和 序列连接， 得到 A4-Prx 基因插入 pPIC9K 载体上的重组质粒 pPIC9K-A4-Prx， 将其转化到巴 斯德毕赤酵母 (Pichia pas。

20、toris)GS115 中， 得到重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx。 0012 （2） 将重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 接种于 BMGY 培养基中， 振荡培养至 OD600为 2 6， 离心收集菌体 ； 洗涤， 用无菌 BMMY 液体培养基将菌体重悬， 控制菌悬液 OD600 值为 0.9 1.1 ； 28 30， 200 250r/min 下每 24h 添加甲醇， 连续诱导培养 3d 后， 室温 离心收取上清液， 即得到重组过氧化物 A4-Prx 粗酶液。 0013 （3） 将步骤 （2） 的重组过氧化物 A4-Prx 粗酶液与食品样品液混合，。

21、 反应后， 即得到 降解玉米赤霉烯酮后的食品样品液。 0014 步骤 （2） 所述的 BMGY 培养基的 pH 值为 6 8 ； 所述的 BMMY 液体培养基的 pH 值为 6 8 ； 所述的 BMMY 液体培养基中含有 0.5% 体积浓度的甲醇用于诱导。 0015 步骤 （2） 所述的添加甲醇指添加至甲醇的终体积浓度为 0.5%。 0016 步骤 （2） 所述的振荡培养指在2830， 振荡频率为200250r/min下培养18h。 说 明 书 CN 103451115 A 4 3/9 页 5 0017 步骤 （2） 所述的离心收集菌体指在速率为 4000 5000r/min 下离心 5 10。

22、min。 0018 步骤 （2）所述的离心收取上清液指在速率为 8000 12000r/min 下离心 5 10min。 0019 步骤 （3） 所述的食品样品液由以下方法得到 ： 取 1g 粉碎的食品， 加入 4mL 体积分 数为 84% 的乙腈水溶液， 常温 200r/min 速率下振荡 1h， 静止放置， 得到食品样品液。 0020 步骤 （3） 所用重组过氧化物A4-Prx粗酶液的量为每4mL食品样品液使用160mL粗 酶液， 并添加 40mL0.25mol/L Tris-HCl（pH8.5） 缓冲液和 8mL0.5mol/LH2O2水溶液混合均 匀。 0021 步骤 （3） 所述的反。

23、应是在 40下反应 12h。 0022 步骤 （3） 所述的食品指谷物类食品， 尤其是玉米相关的所有食品， 包括玉米粉、 食 用醋、 燕麦和黄豆酱油等。 0023 测定食品样品中的玉米赤霉烯酮含量时， 取定性滤纸过滤该食品样品液， 滤液再 用玉米赤霉烯酮净化柱M260 纯化处理， 得到样品提取液上 HPLC 进行检测。 0024 上述重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 用甲醇诱导培养， 表达产物直接分泌 到胞外， 离心所得到的上清液中即含有表达的蛋白产物ZEN 降解酶 A4-Prx。 0025 本发明相对于现有技术， 具有如下的优点及有益效果 ： 0026 采用本发明的方法。

24、， 对食品中ZEN毒素的降解率可达70%以上， 提升各类食品的质 量以达到国家安全标准， 实现食品的安全使用。 附图说明 0027 图 1 是毕赤酵母表达系统中重组质粒 PCR 及双酶切鉴定图。其中 ： M 为 150bp marker ； 2 为 pPIC9K 质粒 ； 3 为 pPIC9K-A4-Prx 双酶切产物。 0028 图 2 是重组毕赤酵母 GS115/pPIC9K-A4-Prx 的菌落 PCR 鉴定图。其中 ： M 为 150bp marker ； 1 6 为 GS115/pPIC9K-A4-Prx ； 7 为 GS115。 0029 图3是表达产物SDS-PAGE电泳图。 其。

25、中 ： M为蛋白marker ； 1为GS115 ； 2为GS115/ pPIC9K ； 3 4 为 GS115/pPIC9K-A4-Prx。 0030 图 4 是利用重组过氧化物酶 A4-Prx 处理玉米粉中 ZEN 的液相检测图。其中， A 为 玉米粉中 ZEN 的液相检测图 ； B 为过氧化物酶 A4-Prx 酶液处理玉米粉样品 12h 后 ZEN 的液 相检测图。 0031 图 5 是利用重组过氧化物酶 A4-Prx 处理食用醋中 ZEN 的液相检测图。其中， A 为 食用醋中 ZEN 的液相检测图 ； B 为过氧化物酶 A4-Prx 酶液处理食用醋样品 12h 后 ZEN 的液 相检。

26、测图。 0032 图 6 是利用重组过氧化物酶 A4-Prx 处理燕麦中 ZEN 的液相检测图。其中， A 为燕 麦中 ZEN 的液相检测图 ； B 为过氧化物酶 A4-Prx 酶液处理燕麦样品 12h 后 ZEN 的液相检测 图。 0033 图 7 是利用重组过氧化物酶 A4-Prx 处理黄豆酱油中 ZEN 的液相检测图。其中， A 为黄豆酱油中ZEN的液相检测图 ； B为过氧化物酶A4-Prx酶液处理黄豆酱油样品12h后ZEN 的液相检测图。 说 明 书 CN 103451115 A 5 4/9 页 6 具体实施方式 0034 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实。

27、施方式不限 于此。 0035 实施例 1 0036 一、 重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 的构建 ： 0037 （一） 目的基因 A4-Prx 的扩增 ； 0038 （1） 质粒 pPIC9K-A4-Prx 的获得及其验证 0039 目的序列设计与合成 ： 按 Genbank 上不动杆菌 Acinetobacter sp.SM04 的 JF964958.1序列， 依照表达载体pPIC9K的多克隆位点， 选择Avr和Not I酶切位点， 设计 引物 （P1， P2） 用于从 Acinetobacter sp.SM04 的总 DNA 中扩增目的序列。具体序列如下 ： 004。

28、0 JF964958.1 序列 ： 0041 ATGAGCTTGATTAATACTGAAGTTAAACCATTCCAAGCAACTGCTTACC 0042 ACAACGGCCAATTTGTTGAAGTTAACGAAACTAACCTTAAAGGTAAATGGT 0043 CTGTTGTATTCTTCTATCCAGCTGACTTCACTTTCGTTTGCCCAACTGAACT 0044 TGGTGACTTAGCTGACAACTACGCTGAATTCCAAAAACTTGGTGTTGAAAT 0045 TTATGCTGTATCTACTGATACACACTTCACTCACAAAGCTTGGCACGACA。

29、CT 0046 TCTGAAGAAATCAAAAAAATCCAATATCCATTAGTTGGTGACCCAACTTGG 0047 ACTCTTTCTAAAAACTTCGACGTTCTTATCGAATCTGAAGGTTTAGCTGAC 0048 CGTGGTACTTTCGTTATCGATCCAGAAGGTAAAATCCAAATCGTTGAACTC 0049 AACGCTGGTGGTATCGGCCGTGACGCATCTGAACTTCTTCGTAAAGTAAAA 0050 GCTGCTCAATACGTACACGCTCACCCAGGTGAAGTTTGTCCAGCTAAATGG 0051 AAAGAAG。

30、GCGAAGCTACTCTTGCTCCATCTATCGACTTAGTTGGTAAAATC 0052 TAA 0053 上游引物 P1 ： 5 -TTACCTAGGATGAGCTTGATTAATACTG-3 0054 下游引物 P2 ： 5 -TATATTGCGGCCGCTTAGATTTTACCA-3 0055 引物的终浓度为 20mol/L， -20储存备用。 0056 PCR 反应体系原料配比如下 ： 0057 0058 以 Acinetobacter sp.SM04 的总 DNA 为模板， PCR 扩增出末端带有 Avr 和 Not I 酶切位点的目的基因， A4-Prx 的基因序列 PC。

31、R 扩增条件 ： 94预变性 2min， 94变性 30s， 63退火 50s， 72延伸 60s， 32 个循环后于 72继续延伸 10min， 4保存。 说 明 书 CN 103451115 A 6 5/9 页 7 0059 所述双酶切所用限制性内切酶为 Avr （购于 Takara 公司） 和 Not I （购于 Takara 公司） 。用电泳并用酚氯仿法或 PCR 纯化试剂盒回收目的片段 （见图 1） 。 0060 质粒构建 ： 0061 a. 酶切 0062 用酚氯仿或PCR纯化试剂盒准备目的片段A4-Prx序列和质粒pPIC9K， 并用内切酶 Avr 和 Not I 双酶切 ； 0。

32、063 . 原料配比如下 ： 0064 0065 选取目的片段 A4-Prx 序列、 10Buffer、 内切酶 Avr 、 内切酶 Not I 和无菌水， 在 37水浴酶切 12h ； 电泳并用酚氯仿法或 PCR 纯化试剂盒回收 A4-Prx 过氧化物酶序列。 0066 . 原料配比如下 ： 0067 0068 选取质粒 pPIC9K （购于 Invitrogen 公司） 、 10Buffer、 内切酶 Avr 、 内切酶 Not I 和无菌水， 在 37水浴酶切 12h ； 电泳并用酚氯仿法或 PCR 纯化试剂盒回收酶切后质粒 pPIC9K 序列。 0069 b. 连接 0070 将目的片。

33、段 A4-Prx 序列和酶切后的质粒 pPIC9K 的摩尔比 3:1 混合， 得到混合 DNA， 用 T4 连接酶连接 ； 0071 原料配比如下 ： 0072 T4 连接酶 1L 0073 T4 连接酶缓冲液 2L 0074 混合 DNA 7L。 0075 选取 T4 连接酶 （购于 Takara 公司） 、 T4 连接酶缓冲液 （购于 Takara 公司） 和混合 DNA， 在 4连接过夜， 得到连接产物 pPIC9K-A4-Prx ； 连接产物 pPIC9K-A4-Prx 转化大肠杆 菌 DH5 ： 将 10L 上述连接产物 pPIC9K-A4-Prx 与 50L 大肠杆菌 DH5 感受。

34、态细胞 （购 说 明 书 CN 103451115 A 7 6/9 页 8 于 Takara 公司） 混合， 冰上放置 30min， 然后在 42热击 1 2min ； 再放置在冰上冷却 1 2min后加入500L的LB培养基， 37振荡培养1h ； 取100L上述培养物涂布到含100mg/ L 氨苄青霉素的 LB 培养基平板上， 37培养过夜， 得到大肠杆菌 DH5/pPIC9K-A4-Prx。 0076 （二） 菌株的构建和筛选 ： 0077 （1） 质粒的线性化与电转导 ： 0078 质粒的线性化 ： 从大肠杆菌DH5/pPIC9K-A4-Prx中提取质粒pPIC9K-A4-Prx ； 。

35、采 用内切酶 Sac I（购于 Takara 公司） 8L、 缓冲液 10H Buffer2L、 无菌水 8L 和 8L 质粒 pPIC9K-A4-Prx， 其中内切酶 Sac I 的浓度为 2U/L， 在 37孵育 4h， 用 DNA 凝胶回收 试剂盒纯化线性化的质粒 pPIC9K-A4-Prx 备用。 0079 取 5.0 9.0mL 巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115（购于 Invitrogen 公 司） 的一级种子液， 接种到 100mL YPD 培养基 （盛于 1000mL 的三角瓶中）中， 使初始 OD600 值为 0.2 0.3。振荡培养 （28， 20。

36、0r/min） 3h 后测定培养液 OD600值， OD600值为 0.4 0.5 时停止培养 ； 离心回收细胞 （6000r/min， 5min， 室温） ， 用 50mL 无菌水洗涤菌体 3 次 ； 用 1.5mL1.1TE/LiAc（购于 Clontech 公司） （或 1.1TE/LiCl（购于 Clontech 公司） ）溶 液洗涤菌体 1 次， 离心 （12000r/min， 15s） ， 弃上清， 用 500L1.1TE/LiAc（或 1.1TE/ LiCl） 溶液悬浮细胞 ； 然后取100L氯化锂悬浮细胞与3L Sac I线性化处理的重组质粒 pPIC9K-A4-Prx， 再加。

37、入 10L 变性处理的 Herring Testes Carrier DNA（购于 Clontech 公司） 轻轻混匀 ； 加入 600L PEG/LiAc（购于 Clontech 公司） 溶液混匀 ； 30温育 30min， 每隔 10min 轻摇振荡一次， 以混匀溶液 ； 加入 70L DMSO， 轻摇混匀 ； 42热击 15min， 冰浴 15min ； 4， 14000r/min 高速离心 5min ； 弃上清， 用 500L TE 溶液悬浮细胞 ； 取 200L 涂 布于 MD 培养基上， 30培养 2 3d， 得到重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx。 0080 。

38、（2） 菌株的筛选 ： 0081 从重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 菌株中挑选单菌落， 进行诱导表达， 首 先采用菌落 PCR 来剔除假阳性菌株， 保留阳性菌株 （见图 2） ； 然后， 再对阳性菌株进行再一 次的诱导表达 （见图 3） ， 检测其上清液中蛋白的含量 （见表 1） 及对 ZEN 降解的效率， 选取降 解效率最高的菌株的最佳菌株， 得到一株重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx。 0082 表 1 重组蛋白 A4-Prx 的表达量 0083 0084 二、 制备重组过氧化物酶 A4-Prx 粗酶液 ： 说 明 书 CN 103451115 。

39、A 8 7/9 页 9 0085 1、 用 MD 固体培养基 （葡萄糖 20g/L， 不含氨基酸的酵母氮基 YNB（购自广州健阳生 物工程有限公司） 13.4g/L， 生物素 （购自广州健阳生物工程有限公司） 410-4g/L， 琼脂 20g/ L） 活化上述得到的重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx， 放置 28培养箱培养 2 天。 0086 2、 从活化MD固体培养基上挑取重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的单菌落， 接种于 50mL BMGY 液体种子培养基 （胰蛋白胨 20g/L， 酵母提取物 （购自广州健阳生物工程 有限公司） 10g/L， 100。

40、mmol/L 磷酸钾 （pH6.0） ， YNB13.4g/L， 生物素 410-4g/L， 甘油 10g/L） 中， 28、 200r/min 振摇培养 18h 至 OD600为 2.0， 得到种液。 0087 3、 5000r/min 离心 5min 收集菌体， 并用灭菌蒸馏水洗涤两次， 将菌体用 100mL BMMY 液体培养基 （胰蛋白胨 20g/L， 酵母提取物 10g/L， 100mmol/L 磷酸钾 pH6.0， YNB13.4g/ L， 生物素 410-4g/L， 甲醇 0.5（v/v） ） 重悬， 检测 OD600值为 0.98， 在 28、 200r/min 诱 导培养 3。

41、d， 期间每隔 24h 补加甲醇至终浓度 0.5%（v/v） 。 0088 4、 将培养液在室温下 12000r/min 离心 5min 收集上清液即为粗酶液。 0089 粗酶液中过氧化物酶活性测定方法如下 ： 0090 取 940L0.1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 缓冲液、 20L 的 0.2mol/L4- 氨基安替吡 啉水溶液、 20L0.3mol/L 苯酚溶液 （用甲醇溶解） 、 1mL 步骤 4 得到的粗酶液， 混合均匀。放 置于 40的恒温水浴锅中保持 2min 后， 添加 20L1mol/L 的双氧水启动反应。反应 5min 后， 用紫外分光光度计测A500值。 用。

42、1mL毕赤酵母菌GS115/pPIC9K诱导培养的上清液作空白 对照。粗酶液中过氧化物酶酶活的计算公式为 ： I （U/mL） =60 每分钟 A500的升高值 /0.01 （1 个过氧化物酶活性单位为 ： 实验规定的酶活力条件下， 每小时吸光值 A500升高 0.01 个单 位所需的酶量） 。 0091 三、 玉米粉脱毒 ： 0092 1、 称取 100g 玉米粉样品 （散装面粉， 购自广州吉之岛超市） ， 粉碎后置于三角烧瓶 中， 加入 400mL84:16（乙腈 : 水） ， 室温 200r/min 振荡 2h。 0093 2、 静置、 定性滤纸过滤后， 用一支玉米赤霉烯酮多功能净化柱M。

43、260 （购自北京泰乐琪科技有限公司） 快速纯化样品， 收集流出液体。 0094 3、 于60下N2蒸发仪蒸干液体后， 用1mL流动相溶解， 得到溶解液 ； 取少量用高效 液相色谱 （HPLC） 分析检测 ZEN 的含量。 0095 4、 将 0.40mL 的粗酶液中添加 0.10mL 的 0.25M Tris-HCl（pH8.5） 缓冲液， 并与 20L 的 0.5M H2O2水溶液混合均匀， 再添加 10L 步骤 1 中含 ZEN 的玉米粉溶解液， 放置 于 40的恒温水浴锅中反应 12h 后， 添加 0.5mL 的甲醇中止反应。将上述混合物漩涡混合 1min后， 12000r/min离心。

44、5min， 取样30L用于高效液相检测玉米粉中的ZEN残留量， 结果 如图 4 所示， 其中 ZEN 降解率达到 71.49%。 0096 检测 ZEN 降解率的方法如下 ： 0097 高效液相色谱 （HPLC） 检测 ZEN 的条件 ： 色谱柱采用 Waters XTerraR MS C18 柱 （4.6150mm， 5m） 。流动相为乙腈 ： 水 ： 甲醇 =46:46:8。柱温 30， 流量为 1mL/min。结 果采用荧光检测器， 激发波长 270nm， 发射波长 450nm。设置对照组中， 使用去离子水代替酶 液。结果以 ZEN 相对降解率表示。计算公式如下 ： 0098 说 明 书。

45、 CN 103451115 A 9 8/9 页 10 0099 实施例 2 0100 （1） 构建重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 的构建、 制备重组过氧化物酶液 A4-Prx 的制备同实施例 1。 0101 （2） 食用醋脱毒 ： 0102 1、 称取 100g 食用醋样品 （购自广州吉之岛超市） 到三角烧瓶中， 加入 400mL84:16 （乙腈 : 水） ， 室温 200r/min 振荡 2h。 0103 2、 静置、 定性滤纸过滤后， 用一支玉米赤霉烯酮多功能净化柱M260 （购 自北京泰乐琪科技有限公司） 快速纯化样品， 收集流出液体。 0104 3、 于60下。

46、N2蒸发仪蒸干液体后， 用1mL流动相溶解， 得到溶解液， 并用高效液相 色谱 （HPLC） 分析检测 ZEN 的含量。 0105 4、 将 0.40mL 的粗酶液中添加 0.10mL 的 0.25M Tris-HCl（pH8.5） 缓冲液， 并与 20L 的 0.5M H2O2水溶液混合均匀， 再添加 10L 步骤 1 得到的溶解液， 放置于 40的 恒温水浴锅中反应 12h 后， 添加 0.5mL 的甲醇中止反应。将上述混合物漩涡混合 1min 后， 12000r/min 下离心 5min， 取样检测 ZEN 残留量， 结果如图 5 所示， ZEN 降解率达到 79.58%。 0106 检。

47、测 ZEN 降解率方法与实施例 1 中相同。 0107 实施例 3 0108 （1） 构建重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 的构建、 制备重组过氧化物酶液 A4-Prx 的制备同实施例 1。 0109 （2） 燕麦片脱毒 ： 0110 1、 称取 100g 燕麦片样品 （购自广州吉之岛超市） 到三角烧瓶中， 加入 400mL84:16 （乙腈 : 水） ， 室温 200r/min 振荡 2h。 0111 2、 静置、 定性滤纸过滤后， 用一支玉米赤霉烯酮多功能净化柱M260 （购自北京泰乐琪科技有限公司） 快速纯化样品， 收集流出液体。 0112 3、 于60下N2蒸发仪。

48、蒸干液体后， 用1mL流动相溶解， 得到溶解液， 并用高效液相 色谱 （HPLC） 分析检测 ZEN 的含量。 0113 4、 将 0.40mL 的粗酶液中添加 0.10mL 的 0.25M Tris-HCl（pH8.5） 缓冲液， 并与 20L 的 0.5M H2O2水溶液混合均匀， 再添加 10L 步骤 1 得到的溶解液， 放置于 40的 恒温水浴锅中反应 12h 后， 添加 0.5mL 的甲醇中止反应。将上述混合物漩涡混合 1min 后， 12000r/min 下离心 5min， 取样检测 ZEN 残留量， 结果如图 6 所示， ZEN 降解率达到 72.04%。 0114 检测 ZEN 降解率方法与实施例 1 中相同。 0115 实施例 4 0116 （1） 构建重组毕赤酵母菌 GS115/pPIC9K-A4-Prx 的构建、 制备重组过氧化物酶液 A4-Prx 的制备同实施例 1。 0117 （2） 黄豆酱油脱毒 ： 0118 1、 称取 100g 黄豆酱油样品 （购自广州吉之岛超市）到三。