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1、(10)申请公布号 CN 103451262 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451262 A *CN103451262A* (21)申请号 201310358527.7 (22)申请日 2013.08.15 C12Q 1/06(2006.01) (71)申请人 河海大学 地址 211100 江苏省南京市江宁开发区佛城 西路 8 号 (72)发明人 林涛 陈卫 蔡博 吴寿可 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 曹翠珍 (54) 发明名称 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种剑水蚤类浮游动。
2、物体内细 菌的检测方法。利用紫外线对水样中自由细菌和 剑水蚤体表附着细菌进行灭活。该方法在有效 灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌的前提 下， 由于剑水蚤对其体内细菌的庇护作用， 避免了 现有检测方法采用液氯灭活剑水蚤体表附着细菌 的过程中， 由于氯分子的渗透作用会对体内微生 物产生影响的问题。采用冻融法与超声法破碎剑 水蚤身体结构， 附加解吸剂洗脱其肠道等器官附 着的体内细菌。最后根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中细菌总数的测定方法进行 细菌的培养和计数， 检测其体内细菌数量。本发 明具有准确度高、 可靠等优点， 具有广阔的应用前 景。 (51)Int.Cl。
3、. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103451262 A CN 103451262 A *CN103451262A* 1/1 页 2 1. 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 从水样中取成体剑水蚤， 放入盛有无菌水的无菌容器中 ； （2） 对容器中的剑水蚤进行紫外照射， 灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌 ； （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至无菌离心管中， 加入无菌水， 置于冰箱中恒温冷冻， 冷 冻完毕后取出进行恒温融化， 再用。
4、超声波清洗仪进行超声作用， 破碎剑水蚤身体结构 ； （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有无菌水的无菌离心管中， 加入解吸 剂 ； （5） 对加入解吸剂后的混合液进行离心， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细菌 ； （6） 取离心后的上清液， 进行细菌培养和菌落计数， 计算每个剑水蚤体内的细菌数量。 2. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 所 用解吸剂的各成分的质量浓度分别为氯化钠 0.7-1.2%， 吐温 80 0.08-0.12%， 磷酸氢二钠 0.2-0.3%， 磷酸二氢钾 0.1-0.3%， 其余成分为无菌超纯水。 3. 根据权利要求 。
5、1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 对培 养皿中剑水蚤进行紫外照射的紫外波长为 200-275nm， 液面处紫外强度为 2500-4000W/ cm2， 紫外照射时间 20-30min。 4. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 置于冰箱中恒温冷冻温度为 -20 至 -10， 冷冻时间为 1-2h。 5. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 冷冻完毕后取出进行恒温融化的时间为 10-20min， 温度为 20-30。 6. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动。
6、物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 冷冻完毕取出进行恒温融化后再用超声波清洗仪进行超声 1-5min。 7. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 加入 解吸剂量为离心管中无菌水体积的 5%-20%。 8. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 对 加入解吸剂后的混合液进行离心的离心机转速 2000-3000rpm、 温度 20-25、 离心时间 5-10min。 9. 根据权利要求 1 所述的剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 其特征在于， 所述 步骤 （6） 是通过 GB/T5750.12-200。
7、6 对细菌量进行检测的。 权 利 要 求 书 CN 103451262 A 2 1/8 页 3 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种在饮用水处理工艺中针对剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方 法。 技术背景 0002 近年来， 我国不断出现剑水蚤类浮游动物穿透饮用水处理工艺系统进入管网的事 件， 使饮用水安全受到威胁与挑战。水厂的实践证明， 水处理工艺不能彻底去除水中剑水 蚤， 剑水蚤成体肉眼可见， 其在水处理工艺系统中的出现带来用户的感官性状问题。同时， 剑水蚤可作为细菌的载体或其他致病性原生动物的中间宿主， 细菌可在剑水蚤的体表和体 内稳定赋存 ； 剑水蚤。
8、可对其携带的细菌提供庇护作用， 引起水质生物安全问题。有研究表 明， 剑水蚤的外壳较为坚硬， 对化学消毒剂具有较强的耐性， 因此灭活剑水蚤体内携带的细 菌需要有较长的接触时间 ： 采用液氯灭活， 液氯的接触时间达到 1h 时其体内细菌的灭活率 仅为 0.7log。剑水蚤体内存活的细菌可引起水质的二次污染。因此， 有效评价剑水蚤类浮 游动物体内细菌的灭活率是保证饮用水水质安全的重要依据。 0003 大量的文献表明， 目前国内外可见文献报道的无脊椎类浮游动物体内微生物的检 测主要参照 Bichai.F 提出的方法。该方法采用液氯将剑水蚤体表微生物有效灭活后， 通过 超声波细胞破碎仪将浮游动物体表破。
9、坏释放其体内微生物。这个方法主要有两个弊端 ： 首 先， 由于采用液氯消毒会造成消毒剂分子渗透入浮游动物体内， 对其体内细菌有一定的灭 活作用， 会造成检测结果失真 ； 其次， 超声波细胞破碎仪有着大功率、 高频率的特点， 能够破 碎组织、 细菌、 病毒、 孢子及其它细胞结构， 因而在超声破碎过程中能够杀死部分体内细菌， 也会造成检测结果偏低。 此外， 由于大部分体内细菌都集中在浮游动物的肠道部位， 若不将 细菌从肠道中释放， 会使浮游动物经超声破碎后向水中释放的体内细菌浓度偏低， 也会造 成检测结果偏低。 发明内容 0004 为了克服上述现有技术的不足， 本发明提供了一种剑水蚤类浮游动物体内。
10、细菌的 检测方法， 利用紫外辐照进行剑水蚤类浮游动物体表细菌的灭活 （可同时灭活取样中来自 水中的自由细菌） ， 采用冻融法结合超声波清洗仪振荡来破碎剑水蚤的蚤体， 使用解吸剂脱 附其体内细菌， 最后进行细菌培养和计数进而计算出剑水蚤类浮游动物体内的细菌数量。 0005 本发明是由以下技术手段实现的 ： 0006 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0007 （1） 从水样中取成体剑水蚤， 放入盛有无菌水的无菌容器中 ； 0008 （2） 对容器的中剑水蚤进行紫外照射， 灭活水中自由细菌和剑水蚤体表附着细 菌 ； 0009 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至无菌离心管中，。
11、 加入无菌水， 置于冰箱中恒温冷 冻， 冷冻完毕后取出进行恒温融化， 再用超声波清洗仪进行超声作用， 破碎剑水蚤身体结 说 明 书 CN 103451262 A 3 2/8 页 4 构 ； 0010 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有无菌水的无菌离心管中， 加入解 吸剂 ； 0011 （5） 对加入解吸剂后的混合液进行离心， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附着的体内细 菌 ； 0012 （6） 取离心后的上清液， 进行细菌培养和菌落计数， 计算每个剑水蚤体内的细菌数 量。 0013 上述试验方法中各试验步骤可以优选为如下指标 ： 0014 所用解吸剂的各成分的质量浓度分别为氯化钠 0.7-。
12、1.2%， 吐温 800.08-0.12%， 磷 酸氢二钠 0.2-0.3%， 磷酸二氢钾 0.1-0.3%， 其余成分为无菌超纯水。 0015 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射的紫外波长为 200-275nm， 液面处紫外强度为 2500-4000W/cm2， 紫外照射时间 20-30min。 0016 置于冰箱中恒温冷冻温度为 -20 至 -10， 冷冻时间为 1-2h。 0017 冷冻完毕后取出进行恒温融化的时间为 10-20min， 温度为 20-30。 0018 冷冻完毕取出进行恒温融化后再用超声波清洗仪进行超声 1-5min。 0019 加入解吸剂量为离心管中无菌水体积的 5%-20%。
13、。 0020 对加入解吸剂后的混合液进行离心的离心机转速 2000-3000rpm、 温度 20-25、 离心时间 5-10min。 0021 所述步骤 （6） 是通过 GB/T5750.12-2006 对细菌量进行检测的。 0022 本发明与现有技术相比具有以下优点 ： 0023 1. 体表细菌灭活稳定， 对体内细菌影响较小。 0024 本发明采用紫外线照射消毒技术尤其是使用 200-275nm 的紫外线进行照射， 这种 波段的紫外线又称为短波灭菌紫外线。它的穿透能力很弱， 无法穿透大部分的透明玻璃及 塑料， 更不会穿透剑水蚤坚硬的体表外壳。 当这种紫外线照射剑水蚤体表时， 由于受到剑水 蚤。
14、体表外壳的保护， 紫外线无法穿透体表， 保护了其体内细菌免受紫外线照射。 0025 2. 剑水蚤破碎方法可靠， 对体内细菌影响较小。 0026 本发明采用冻融法结合超声波清洗仪振荡。冻融时将样本置于冰箱中恒温冷冻， 再经恒温融化， 冷冻温度优选为 -20 至 -10， 融化温度优选为 20-30。这种低温冷冻， 恒 温融化对于细菌活性的影响较小。经过 1 次冻融之后， 剑水蚤体表已经开裂， 若再经过多次 冻融， 只需轻微手摇振荡几次， 剑水蚤的蚤体即可完全破碎。 为最大限度减少对体内细菌的 伤害， 提出采用超声波清洗仪振荡破碎剑水蚤体表。超声波清洗仪不同于超声波细胞破碎 仪， 由于其频率低、 。
15、功率小， 对细菌影响很小。 0027 3. 体内细菌解吸附效率高， 检测结果更加准确 0028 Bichai.F 提出的检测方法没有考虑到浮游动物体内细菌附着在肠道等器官上， 浮 游动物体表破碎后其体内细菌没有完全释放到水中， 所以这时水中的细菌浓度偏低， 直接 吸取上清液进行培养和计数会造成检测结果偏低。本发明通过加入解吸剂， 彻底洗脱肠道 等器官附着的细菌， 使体内细菌完全释放入水中， 增加了检测结果的准确性。试验表明， 同 等条件下进行检测， Bichai.F 提出的方法测定剑水蚤类浮游动物体内菌落形成为 457CFU/ 只， 而本发明检测结果为 739CFU/ 只以上， 其检测的准确度。
16、为 Bichai.F 提出的方法的 1.62 说 明 书 CN 103451262 A 4 3/8 页 5 倍以上， 大大优于了现有技术。 0029 本发明操作步骤简单， 灵敏度高， 稳定性好， 对于剑水蚤类浮游动物体内细菌检测 效果显著。经过适当改进也可用去检测其它浮游动物体内细菌， 适用范围较广， 实用性较 强， 具有较高的可操作性， 适合广泛推广与应用。 具体实施方式 0030 以下实施例用用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0031 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0032 以下实施例中为了保证实验样本的一致性， 所用的剑水蚤类浮游动。
17、物取自太湖原 水， 蚤属为中华窄腹剑水蚤 （Limnoithona sinensis） 。 0033 实施例 1 0034 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0035 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0036 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 190nm、 培养皿液面处紫外强度 为 2000W/cm2、 照射时间 20min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0037 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离。
18、心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -8的冰箱中恒温冷冻 1h， 取出后于 15下恒温融化 10min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 1min， 破碎剑水蚤身体结构。 0038 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入2mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%， 吐温800.08%， 磷酸氢二 钠 0.2%， 磷酸二氢钾 0.1%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0039 （5） 离心机转速 1500rpm、 温度 20、 离心时间 10min。
19、， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0040 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量， 结果见表 2。 0041 实施例 2 0042 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0043 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0044 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 350nm、 培养皿。
20、液面处紫外强度 为 4200W/cm2、 照射时间 20min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0045 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -10的冰箱中恒温冷冻 1h， 取出后于 25下恒温融化 10min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 2min， 破碎剑水蚤身体结构。 0046 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入1mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%， 吐温800.08%， 磷酸氢二。
21、 钠 0.2%， 磷酸二氢钾 0.1%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 说 明 书 CN 103451262 A 5 4/8 页 6 0047 （5） 离心机转速 1500rpm、 温度 30、 离心时间 5min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0048 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0049 实施例 3 0050 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0051 。
22、（1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0052 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 200nm、 培养皿液面处紫外强度 为 2500W/cm2、 照射时间 30min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0053 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -10的冰箱中恒温冷冻 1h， 取出后于 20下恒温融化 20min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 3min，。
23、 破碎剑水蚤身体结构。 0054 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入5mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.7%， 吐温800.08%， 磷酸氢二 钠 0.2%， 磷酸二氢钾 0.1%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0055 （5） 离心机转速 2000rpm、 温度 20、 离心时间 10min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0056 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养。
24、和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0057 实施例 4 0058 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0059 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0060 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 225nm、 培养皿液面处紫外强度 为 2800W/cm2、 照射时间 22min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0061 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌。
25、水， 置 于 -18的冰箱中恒温冷冻 1.5h， 取出后于 22下恒温融化 15min， 再用超声波清洗仪 （功 率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 5min， 破碎剑水蚤身体结构。 0062 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入3mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.8%， 吐温800.08%， 磷酸氢二 钠 0.23%， 磷酸二氢钾 0.2%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0063 （5） 离心机转速 2200rpm、 温度 23、 离心时间 8min， 洗脱剑水蚤的肠道。
26、等器官附 着的体内细菌。 0064 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 说 明 书 CN 103451262 A 6 5/8 页 7 0065 实施例 5 0066 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0067 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0068 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波。
27、长为 247.5nm、 培养皿液面处紫外强 度为 3000W/cm2、 照射时间 20min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0069 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -15的冰箱中恒温冷冻 2h， 取出后于 26下恒温融化 18min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 2min， 破碎剑水蚤身体结构。 0070 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入 2.5mL 解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠 1。
28、.0%， 吐温 800.1%， 磷酸氢 二钠 0.25%， 磷酸二氢钾 0.18%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0071 （5） 离心机转速 2600rpm、 温度 20、 离心时间 8min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0072 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0073 实施例 6 0074 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0075 （1） 用 3mL。
29、 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0076 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 253.7nm、 培养皿液面处紫外强 度为 3000W/cm2、 照射时间 20min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0077 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -20的冰箱中恒温冷冻 1h， 取出后于 25下恒温融化 10min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 1min， 破碎剑水蚤身。
30、体结构。 0078 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入2mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠0.9%、 吐温-800.1%、 磷酸氢二 钠 0.283%、 磷酸二氢钾 0.136%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0079 （5） 离心机转速 2500rpm、 温度 25、 离心时间 5min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0080 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计。
31、数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0081 实施例 7 0082 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0083 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0084 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 263nm、 培养皿液面处紫外强度 说 明 书 CN 103451262 A 7 6/8 页 8 为 3500W/cm2、 照射时间 27min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0085 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至。
32、一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -15的冰箱中恒温冷冻 2h， 取出后于 30下恒温融化 10min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 4min， 破碎剑水蚤身体结构。 0086 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入3.5mL解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠1.1%， 吐温800.09%， 磷酸氢 二钠 0.25%， 磷酸二氢钾 0.25%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0087 （5） 离心机转速 3000rpm、。
33、 温度 20、 离心时间 10min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0088 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0089 实施例 8 0090 一种剑水蚤类浮游动物体内细菌的检测方法， 包括以下步骤 ： 0091 （1） 用 3mL 巴氏吸管从水样中逐个吸取 15 只成体剑水蚤放入盛有 100mL 无菌水的 60mm 的无菌培养皿中， 置于无菌操作台上。 0092 （2） 对培养皿中剑水蚤进行紫外照射， 紫外波长为 。
34、275nm、 培养皿液面处紫外强度 为 4000W/cm2、 照射时间 25min， 对水中自由细菌和剑水蚤体表附着细菌进行灭活。 0093 （3） 灭活结束后将剑水蚤转移至一个 1.5mL 无菌的离心管中， 加入 1mL 无菌水， 置 于 -20的冰箱中恒温冷冻 1h， 取出后于 20下恒温融化 10min， 再用超声波清洗仪 （功率 60W， 频率 40kHz） 进行超声作用 1min， 破碎剑水蚤身体结构。 0094 （4） 将离心管中破碎的蚤体和水全部转移至装有 25mL 无菌水的 50mL 无菌离心管 中， 加入 1.25ml 解吸剂， 解吸剂各成分的质量浓度分别为氯化钠 1.2%，。
35、 吐温 800.12%， 磷酸 氢二钠 0.3%， 磷酸二氢钾 0.3%， 其余为无菌超纯水 ； 最后用无菌超纯水定容至 30mL。 0095 （5） 离心机转速 2000rpm、 温度 25、 离心时间 5min， 洗脱剑水蚤的肠道等器官附 着的体内细菌。 0096 （6） 取 1mL 离心后的上清液， 根据生活饮用水标准检验法 （GB/T5750.12-2006） 中 细菌总数的测定方法进行细菌培养和菌落计数， 细菌总数乘以 2 即为每个剑水蚤体内细菌 数量。 0097 采 用 Wolmarans.E 提 出 的 方 法 （Wolmarans,E.,et al.,Significance 。
36、of bacteria associated with invertebrates in drinking water distribution networks.4.World Water Congress:Water and Health.2005:IWA Publishing,Alliance House12Caxton Street London SW1HOQS UK.5-175.） ， 在无菌、 恒温振荡条件下将剑水 蚤在无菌水中浸泡 2-4h， 进行其体表携带细菌的释放， 取适当体积的水进行紫外灭活后 剑水蚤体表附着细菌的检测， 同时进行水样中自由细菌检测 （生活饮用水标准检验法 。
37、GB/ T5750.12-2006 中细菌总数的测定方法） 。结果如表 1 所示。 0098 表1紫外消毒时间与体表附着细菌存在的关系 （每个时间点进行6次试验， 取平均 值） 0099 说 明 书 CN 103451262 A 8 7/8 页 9 紫外消毒时间05min10min15min18min20min 体表剩余细菌452CFU/ 只302CFU/ 只88CFU/ 只10CFU/ 只- 水样中自由细菌24CFU/ml- - 0100 从表 1 中的数据可以看到， 随着紫外线照射时间的增加， 剑水蚤体表附着细菌数 量逐渐减少， 当紫外线照射时间为 18min 时， 体表附着细菌没有检出，。
38、 为保证结果的可靠 性， 本发明采用20min以上的照射时间 ； 同时培养皿水中的自由细菌在5min时就未有检出。 这说明采用紫外照射法， 对于剑水蚤体表附着细菌和水中自由细菌的灭活效果显著。 0101 分别采用本发明中实施例的方法和 Bichai.F 提出的方法 （Bichai F,Barbeau B,Dullemont Y,et al.Role of predation by zooplankton in transport and fate of protozoan(oo)cysts in granular activated Carbon filtrationJ.Water Resea。
39、rch,2010,44(4):1072-1081.） 进行剑水蚤类浮游动物体内细菌检测比较， 每种方法 平行进行 3 次试验， 进行比较。试验所用的剑水蚤样本都是从同一取水地点同一时间收集 的剑水蚤， 试验时挑选个头一样大的成年剑水蚤， 每组试验样本收集条件完全一样， 试验结 果如表 2 所示。 0102 表 2 本发明的检测方法与 Bichai.F 提出的检测方法结果对比 0103 0104 说 明 书 CN 103451262 A 9 8/8 页 10 0105 根据表 2 的数据结果， 可以发现本发明检测到的剑水蚤体内细菌数量明显多于现 行Bichai.F提出的检测方法， 且检测结果波动。
40、小， 其中RSD值都小于3 ； 而Bichai.F提出的 检测方法实验结果波动较大， RSD 值达到了 20.13， 其中实施例 1 与实施例 2 是根据本领域 技术人员的公知常识任意选取的参数进行的实验， 说明利用本发明提供的方法可以实现比 现有技术更好的检测效果， 而实施例 3-8 是本发明优选的实验参数范围， 通过对比可以发 现， 其检测效果与现有技术检测手段相比更为突出， 其检测的准确度为现有技术的 1.88 倍 以上， 大大优于了现有技术。通过上述试验数据对比说明本发明所采用的体表附着细菌紫 外线灭活、 剑水蚤体表破碎和解吸剂脱附的方法检测效率更高、 重现性更好、 稳定性更好。 0106 以上对本发明所提供的剑水蚤类浮游动物体内细菌检测方法进行了详细介绍， 并 对本发明的具体实施方式进行了阐述， 对于本领域的一般技术人员， 依据本发明的思路在 具体实施方式及应用范围上可能在实施过程中会有改变之处， 本说明书内容不应理解为对 本发明的限制。 说 明 书 CN 103451262 A 10 。