一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法.pdf

《一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103446628 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103446628 A *CN103446628A* (21)申请号 201310364793.0 (22)申请日 2013.08.20 A61L 27/38(2006.01) A61L 27/36(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 西安交通大学 地址 710049 陕西省西安市咸宁西路 28 号 (72)发明人 樊立宏 王坤正 党晓谦 余泽锋 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 汪人和 (54) 发明名称 一种复合种。

2、子细胞的组织工程神经的制备方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种复合神经诱导的骨髓 间充质干细胞的组织工程神经的制备方法， 在 Sondell 制备法的基础上， 采用改良的酶 - 低 渗 - 化学除垢剂三联萃取神经， 在体外构建具有 生物活性的组织工程周围神经， 然后复合在体 外培养、 扩增和神经分化诱导骨髓间充质干细 胞。本发明克服了目前较为认可的化学制备方 法 Sondell 法在一定程度上对神经基膜管和细胞 外基质结构的破坏作用， 减少其了对轴突再生的 影响。本发明所制备的复合神经诱导的骨髓间充 质干细胞的组织工程神经可应用于制备神经移植 物， 对周围神经缺损修复效果良好。 (51)I。

3、nt.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103446628 A CN 103446628 A *CN103446628A* 1/2 页 2 1. 一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法， 其特征在于， 包括以下操作 ： 1） 取离体的异种动物的外周神经组织， 剔除其中的神经外血管、 脂肪及结缔组织之后， 用胰蛋白酶处理 ； 胰蛋白酶处理完成后终止消化， 使用低渗处理液对神经组织进行低渗处 理 ； 2）将低渗处理后的神经组织在 S。

4、B-10 溶液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后转入含有 Triton X200 和 SB-16 的混合液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后得到脱细胞神经基质 ； 3） 用含体积分数 10 20% 的胎牛血清和 1 5mol L- 巯基乙醇的 DMEM-F12 培 养基预诱导传代后的骨髓间充质干细胞 12 24h， 无菌冲洗， 然后培养基更换为含质量分 数12%二甲基亚砜和体积分数1020%的胎牛血清的DMEM-F12培养基， 诱导培养12 24h ； 4） 将脱细胞神经基质用 DMEM-F12 培养基充分浸润， 吸干培养基后 37孵育， 然后接种 诱导培养后的神经诱导骨髓间充质干细胞， 添加。

5、 DMEM-F12 培养， 并补充胎牛血清至体积分 数为 10 20%， 于 37、 5%CO2、 95% 湿度的条件下培养 48 小时， 得到复合神经诱导的骨髓间 充质干细胞的组织工程神经。 2. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的外周神经组织是在显微镜下仔细剔除神经外血管、 脂肪及结缔组 织 ； 然后加入质量分数 0.25% 的胰蛋白酶， 37下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 20 30 分钟 ； 倾去胰蛋白酶， PBS清洗终止胰蛋白酶消化， 然后去离子水， 25下、 以80100次/分 钟的频率震荡水浴。

6、 3 4 小时 ； 再将低渗处理后的神经组织转入灭菌的 PBS 溶液中润洗。 3. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的低渗处理后的神经组织是在SB-10溶液、 含有Triton X200和SB-16 的混合液交替多次循环处理之后， 获得脱细胞神经基质。 4. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的低渗处理后的神经组织是在浓度为 100 150mmol/L SB-10 溶液 中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 12 15 小时， 然后转。

7、入灭菌 PBS 溶液 中清洗 ； 清洗后次转入含有质量浓度 0.14 0.20% 的 Triton X200 和 0.6 0.8mmol/L 的 SB-16 的混合液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 12 24 小时， 然后转 入灭菌 PBS 溶液中清洗 ； 清洗后第二次转入浓度为 100 150mmol/L SB-10 溶液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 5 10 小时， 然后转入灭菌 PBS 溶液中清洗 ； 清洗后第二次转入含有质量浓度 0.14 0.20% 的 Triton X200 和 0.6 0.8mmol/L 的 S。

8、B-16 的混合液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 10 15 小时， 然后 转入灭菌 PBS 溶液中清洗， 获得脱细胞神经基质， 4保存。 5. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的骨髓间充质干细胞的制备及传代培养为 ： 取骨髓组织， 使用含青霉素、 链霉素各100U/ml的DMEM-F12培养基， 冲洗吹打制成单细 权 利 要 求 书 CN 103446628 A 2 2/2 页 3 胞悬液， 将细胞悬液和 Percoll 分离液混合后离心， 收集离心液界面上乳白色云雾状的细 胞层， 先后以 。

9、PBS 和 DMEM-F12 漂洗， 用含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养基重悬细 胞， 计数 5105个 /ml 后即接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中进行原 代培养， 分别于 1、 3 天半量换液， 以后每 3 天全量换液 1 次 ； 待细胞长满瓶底 80% 时进行传代培养， 以 1104个 /ml 传代。 6. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的步骤 3） 对骨髓间充质干细胞的诱导培养为 ： 用含体积分数 20% 的胎牛血清和 3mol L- 巯基乙醇的 DMEM-F。

10、12 培养基预诱导 传代后的骨髓间充质干细胞24h， 以无菌PBS冲洗， 然后培养基更换为含质量分数2%二甲基 亚砜和体积分数 20% 的胎牛血清的 DMEM-F12 培养基， 诱导培养 24h。 7. 如权利要求 1 所述的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方 法， 其特征在于， 所述的步骤 4） 对骨髓间充质干细胞的培养为 ： 将脱细胞神经基质用 DMEM-F12 培养基浸润 12 小时， 然后将培养基吸干， 37下孵育 5 小时 ； 再将生长良好的神经诱导骨髓间充质干细胞， 使用胰蛋白酶消化成细胞悬液， 离心后 用 DMEM-F12 培养液重悬， 以 104/cm2的密度。

11、接种在孵育后脱细胞神经基质上， 以 DMEM-F12 为培养基， 并补充胎牛血清的体积浓度至 20%， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中培养 48 小时， 并在倒置显微镜下连续观察细胞生长及污染情况。 8. 权利要求 1 所制备的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经在制备神 经移植物中的应用。 9. 权利要求 1 所制备的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经在制备周 围神经缺损修复的药物中的应用。 10. 权利要求 1 所制备的神经诱导的骨髓间充质干细胞在制备雪旺细胞替代品中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 103446628 A 3 1/8 页 4 一种。

12、复合种子细胞的组织工程神经的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域， 涉及一种复合神经诱导的骨髓间 充质干细胞的组织工程神经的制备方法。 背景技术 0002 临床上经常遇到因肿瘤切除， 创伤等原因造成的周围神经缺损问题， 使患者肢体 肌肉萎缩， 运动感觉功能受到损害。治疗的方法是如果缺损距离较短时， 可以通过解剖游 离， 做到无张力缝合， 当缺损距离过大时， 通常需要进行自体神经移植。自体神经移植虽然 有肯定的疗效并且作为其他治疗方法比较的金标准， 但存在很多难以克服的缺点， 最致命 的缺点是可供选择的神经供体实在有限 1。 至今尚没有一种合适的替代物能有效的取。

13、代自 体神经移植。 0003 材料科学、 工程学和生命科学等相关学科的发展和交叉融合产生了再生医学领域 内一门新兴学科组织工程， 即应用生命科学和工程学的原理和方法， 在正确认识机体 生理和病理两种状态下的组织结构及功能的关系的基础上研究开发用于修复， 维护， 促进 人体各组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物， 它是人类治疗组织， 器官功能衰退， 缺失的一项新技术， 与传统的治疗技术相比有无与伦比的优点。这项技术的基础是要有合 适的细胞支架， 一种材料作为支架必须具有一下要求 ： 生物相容性， 表面相容性， 结构相容 性， 生物降解性， 可灭菌性。 过去所用的支架一般为合成支架， 虽具有支。

14、架形态， 结构， 强度， 降解的可控性， 也可批量生产， 但也带来了生物相容性差、 感染等问题。 0004 细胞外基质 （extracellularmatrixc,ECM） 是组织中除细胞外的所有成分， 包括均 质状态的基质 （蛋白多糖和糖蛋白） 和细丝状的胶原纤维。近年来随着组织工程学的发展， 经大量研究表明， ECM 是细胞附着的基本框架和代谢场所， 其形态和功能直接影响所构成的 组织形态和功能。完整的 ECM 内可能存在着某些复合生长因子， 可诱导调节细胞的生长、 繁 殖和分化等。细胞外基质在哺乳动物的发育和生理活动中起重要的作用， 基质中的很多成 分， 如胶原的氨基酸序列在种属间高度保。

15、守， 这种同源性也为异种细胞外基质作为生物活 性支架奠定了基础。 研究表明 2， 神经ECM成分有重要的生物学功能， 不仅对神经再生有明 显的引导和促进作用， 并且为神经再生构成了良好的微环境条件。 0005 天然神经细胞外基质成分如层粘连蛋白 （LN） 、 纤维粘连蛋白 （FN） 、 硫酸肝素蛋白 多糖 （HSPG） 、 I 型胶原、 IV 型胶原 （Type IV collagen） 等大分子物质具有促进轴突再生的 作用。其中对层粘连蛋白的研究认为 LN 是有 A 链和 B1 链与 B2 链共同构成十字架型结构 的多机能蛋白， 是轴突生长方向的信息产物和刺激轴突生长作用最强的物质， 并且对。

16、干细 胞的分化迁移起重要作用。LN 的作用机制可能与其激活转录因子从而引起基因表达有关， 存在构象改变， 突触识别及转录功能。LN 促进轴突再生的机制， 除加速神经突起的生长外， 非常重要的是加速了干细胞的迁移和 Buugner 带的形成。人硫酸肝素糖蛋白促成轴突生长 的作用与层粘连蛋白和 IV 胶原形成一种复合物结构， 改变空间构想从而产生相应的功能 有关。目前认为 LN 和 IV 型胶原之所以能够促进突起的生长是因为神经细胞表面存在着能 说 明 书 CN 103446628 A 4 2/8 页 5 与它们功能基团相结合的受体， 当受体与这些功能基团结合后受体调节神经细胞内的肌动 蛋白丝 ,。

17、 使其在细胞的边缘聚合 , 受体与收缩的肌动蛋白丝相互作用产生张力 , 调节生长 锥的型态和细胞骨架的动力使得突起得以生长 .Carbonetto 等 3 认为型胶原对神经突 起的生长存在着一定的促进作用 ECM 中还含有多种神经营养因子如 ： 神经生长因子 （NGF） 、 睫状源性神经营养因子 （CNTF） 、 脑源性神经营养因子 （BDNF） 、 胶原细胞源性神经营养因子 （GDNF） 等都对运动神经元表达有不同程度的营养活性， 其中 GDNF 的营养活性最强。 0006 由此可以看出 ： 生物体细胞外基质是由不同含量的胶原， 纤维粘连蛋白， 层粘连 蛋白， 糖蛋白及糖胺聚糖按一定比例和结。

18、构建成的复杂的有机的统一整体， 含有调节细胞 分化迁移的各种生长因子和信号分子。就目前的技术水平看， 人们还没有能力制造出完全 模拟细胞外基质结构和功能的支架， 所以脱细胞的细胞外基质就成为组织工程支架最佳选 择。Kim BS4等用异体的脱细胞神经复合 NGF（神经生长因子） 和 VEGF（血管内皮生长因 子） 后修复大鼠坐骨神经， 发现其运动， 伤害感受及本体感受均有显著改善， 进一步证实脱 细胞异体神经移植可以功能性的促进周围神经再生。 国内卢世壁等 5用三硝基甲苯和脱氧 胆酸纳萃取异体神经， 可将细胞及抗原脱去， 并且很好的保留了基底膜和层粘连蛋白等促 进轴突再生的成分和结构， 成功得到。

19、了粗的长段的脱细胞异体神经。尽管脱细胞异体神经 移植在国内外已取得了一些进展， 但异体神经来源仍然有限， 供给问题还是没有完全解决。 研究表明同种异体的同一组织之间细胞外基质的成分和结构是相同的， 在某些不同种群之 间， 如猪和人的一些细胞外基质也是相似的。 0007 同时随着干细胞生物学的发展， 干细胞可塑性开始受到关注。最近关于骨髓基质 细胞的非传统可塑性在周围神经损伤中的应用引起了人们的极大关注 6-8。Dezawa 等9 报导了在体外通过一系列细胞因子的作用后， 骨髓基质细胞可表达 P75,S100, 等胶质细胞 标志， 当其移植到大鼠坐骨神经损伤远端的盲端管道后可整合入再生生长锥。C。

20、uevas10也 描述了将未诱导分化的骨髓基质细胞注射入神经损伤部位后的迁移分化和修复作用。Mel 等 11 将骨髓基质细胞诱导成雪旺氏细胞样细胞移植入大鼠坐骨神经损伤处， 发现对损伤 处的雪旺氏细胞的增殖起刺激和支持作用。故骨髓间充质干细胞作为雪旺细胞的替代品， 弥补了雪旺细胞的取材来源、 增殖纯化、 抗原特性等问题。 0008 上述的参考文献具体如下 ： 0009 1Vanderhooft E.Functional outcomes of nerve grafts for the upper and lower extremities.J Hand Clin.2000;16(1):93-1。

21、04 0010 2Zhang LX,Tong XJ,Sun XH,Tong L,Gao J,Jia H,Li ZH.Experimental study of low dose ultrashortwave promoting nerve regeneration after acellular nerve allografts repairing the sciatic nerve gap of rats.Cell Mol Neurobiol.2008Jun;28(4):501-9.Epub2007Dec6. 0011 3Carbonetto S,Gruver MM,Turner DC.Ne。

22、rve fiber growth in culture on fibronectin collagen and glycosaminoglycan substratesJ. Jneurosci,1983;3:2324-2335. 0012 4Kim BS,Yoo JJ,Atala A Peripheral nerve regeneration using acellular nerve grafts.J Biomed Mater Res A.2004Feb1;68(2):201-9. 0013 5Zhong HB,Lu SB,Hou SX Acellular nerve allograft b。

23、y chemical 说 明 书 CN 103446628 A 5 3/8 页 6 extraction in humans Zhonghua Wai Ke Za Zhi.2003Jan;41(1):60-3. 0014 6Amoh Y,Hamada Y,Aki R,Kawahara K,Hoffman RM,Katsuoka K.Direct transplantation of uncultured hair-follicle pluripotent stem(hfPS)cells promotes the recovery of peripheral nerve injury.J Cel。

24、l Biochem.2010May;110(1):272-7. 0015 7Walsh S,Biernaskie J,Kemp SW,Midha R.Supplementation of acellular nerve grafts with skin derived precursor cells promotes peripheral nerve regeneration.Neuroscience.2009Dec15;164(3):1097-107. 0016 8Santiago LY,Clavijo-Alvarez J,Brayfield C,Rubin JP,Marra KG.Deli。

25、very of adipose-derived precursor cells for peripheral nerve repair.Cell Transplant.2009;18(2):145-58. 0017 9Dezawa M,Takahashi I,Esaki M,et al.Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells.Eur J Neurosci.2001Dec;14(11):1771-6. 001。

26、8 10Cuevas P,Carceller F.Dujovny M Peripheral nerve regeneration by bone marrow stromal cells.J Neurol Res.2002Oct;24(7):634-8. 0019 11Mel Tohill,Cristina Mantovani,Mikael Wiberg.Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. J Neuroscience Letters362(。

27、2004)200-203. 发明内容 0020 本发明解决的问题在于提供一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程 神经的制备方法， 采用组织工程的技术方法构建异种脱细胞神经基质， 再用经过神经的诱 导骨髓间充质干细胞与之复合， 用于周围神经缺损修复， 以解决周围神经损伤治疗的难点。 0021 本发明是通过以下技术方案来实现 ： 0022 一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法， 包括以下操 作 ： 0023 1） 取离体的异种动物的外周神经组织， 剔除其中的神经外血管、 脂肪及结缔组织 之后， 用胰蛋白酶处理 ； 胰蛋白酶处理完成后终止消化， 使用低渗处理液对神经组织进。

28、行低 渗处理 ； 0024 2） 将低渗处理后的神经组织在 SB-10 溶液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后转入含有 Triton X200 和 SB-16 的混合液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后得到脱细胞神经基质 ； 0025 3） 用含体积分数1020%的胎牛血清和15molL-巯基乙醇的DMEM-F12 培养基预诱导传代后的骨髓间充质干细胞 12 24h， 无菌冲洗， 然后培养基更换为含质量 分数 1 2% 二甲基亚砜和体积分数 10 20% 的胎牛血清的 DMEM-F12 培养基， 诱导培养 12 24h ； 0026 4） 将脱细胞神经基质用 DMEM-F12 培养基充分浸润，。

29、 吸干培养基后 37孵育， 然后 接种诱导培养后的神经诱导骨髓间充质干细胞， 添加 DMEM-F12 培养， 并补充胎牛血清至体 积分数为 10 20%， 于 37、 5%CO2、 95% 湿度的条件下培养 48 小时得到复合神经诱导的骨 说 明 书 CN 103446628 A 6 4/8 页 7 髓间充质干细胞的组织工程神经。 0027 所述的外周神经组织是在显微镜下仔细剔除神经外血管、 脂肪及结缔组织 ； 然后 加入质量分数 0.25% 的胰蛋白酶， 37下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 20 30 分钟 ； 0028 倾去胰蛋白酶， PBS 清洗终止胰蛋白酶消化， 然。

30、后去离子水， 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 3 4 小时 ； 再将低渗处理后的神经组织转入灭菌的 PBS 溶液中 润洗。 0029 所述的低渗处理后的神经组织是在 SB-10 溶液、 含有 Triton X200 和 SB-16 的混 合液交替多次循环处理之后， 获得脱细胞神经基质。 0030 所述的低渗处理后的神经组织是在浓度为 100 150mmol/L SB-10 溶液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 12 15 小时， 然后转入灭菌 PBS 溶液中清 洗 ； 0031 清洗后次转入含有质量浓度 0.14 0.20% 的 Trit。

31、on X200 和 0.6 0.8mmol/L 的 SB-16 的混合液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 12 24 小时， 然后 转入灭菌 PBS 溶液中清洗 ； 0032 清洗后第二次转入浓度为100150mmol/L SB-10溶液中， 在25下、 以80100 次 / 分钟的频率震荡水浴 5 10 小时， 然后转入灭菌 PBS 溶液中清洗 ； 0033 清洗后第二次转入含有质量浓度0.140.20%的Triton X200和0.60.8mmol/ L 的 SB-16 的混合液中， 在 25下、 以 80 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 10 15 小。

32、时， 然 后转入灭菌 PBS 溶液中清洗， 获得脱细胞神经基质， 4保存。 0034 所述的骨髓间充质干细胞的制备及传代培养为 ： 0035 取骨髓组织， 使用含青霉素、 链霉素各100U/ml的DMEM-F12培养基， 冲洗吹打制成 单细胞悬液， 将细胞悬液和 Percoll 分离液混合后离心， 收集离心液界面上乳白色云雾状 的细胞层， 先后以 PBS 和 DMEM-F12 漂洗， 用含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养基重 悬细胞， 计数 5105个 /ml 后即接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中进 行原代培养， 分别于 1、 3 天半量。

33、换液， 以后每 3 天全量换液 1 次 ； 0036 待细胞长满瓶底 80% 时进行传代培养， 以 1104个 /ml 传代。 0037 所述的步骤 3） 对骨髓间充质干细胞的诱导培养为 ： 0038 用含体积分数 20% 的胎牛血清和 3mol L- 巯基乙醇的 DMEM-F12 培养基预 诱导传代后的骨髓间充质干细胞24h， 以无菌PBS冲洗， 然后培养基更换为含质量分数2%二 甲基亚砜和体积分数 20% 的胎牛血清的 DMEM-F12 培养基， 诱导培养 24h。 0039 所述的步骤 4） 对骨髓间充质干细胞的培养为 ： 0040 将脱细胞神经基质用 DMEM-F12 培养基浸润 12。

34、 小时， 然后将培养基吸干， 37下 孵育 5 小时 ； 再将生长良好的神经诱导骨髓间充质干细胞， 使用胰蛋白酶消化成细胞悬 液， 离心后用 DMEM-F12 培养液重悬， 以 104/cm2的密度接种在孵育后脱细胞神经基质上， 以 DMEM-F12 为培养基， 并补充胎牛血清的体积浓度至 20%， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养 箱中培养 48 小时， 并在倒置显微镜下连续观察细胞生长及污染情况。 0041 所制备的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经在制备神经移植物 中的应用。 说 明 书 CN 103446628 A 7 5/8 页 8 0042 所制备的复合神经。

35、诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经在制备周围神经缺 损修复的药物中的应用。 0043 所制备的神经诱导的骨髓间充质干细胞在制备雪旺细胞替代品中的应用。 0044 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0045 本发明提供的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法， 在 Sondell 制备法的基础上， 采用改良的酶 - 低渗 - 化学除垢剂三联萃取神经， 在体外构建具 有生物活性的组织工程周围神经， 然后复合在体外培养、 扩增和神经分化诱导骨髓间充质 干细胞， 用于周围神经缺损修复。 0046 由于本发明采用了酶 （胰蛋白酶） - 低渗 （去离子水） - 化学除垢。

36、剂三联萃取法， 其中 Triton X200、 SB-10 和 SB-16 三种相对柔和的化学萃取剂的联合使用， 克服了目前较为认 可的化学制备方法 Sondell 法在一定程度上对神经基膜管和细胞外基质结构的破坏作用， 减少其了对轴突再生的影响， 从而使得本发明制备的脱细胞神经基质具有能够更加有效地 保留神经组织天然的细胞外基质结构优势。 0047 本发明采用神经基质复合分化诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经， 具有良 好的神经修复效果 ： 经神经诱导干细胞组缝合神经处与周围组织无明显粘连， 与正常神经 连接处光滑无断裂， 表面可见微小血管网形成， 似正常神经 ； 以所制备的骨髓干细胞为雪。

37、旺 细胞的替代品， 弥补了雪旺细胞的取材来源、 增殖纯化、 抗原特性等缺陷， 构建的脱细胞组 织工程神经更加符合神经组织的生理构成， 移植物的修复效果较单纯脱细胞神经基质更加 明显。附图说明 0048 图 1 是本发明制备的脱细胞神经基质横切片的 HE 染色图片 ； 0049 图 2 是本发明制备的脱细胞神经基质的 Masson 三色染色图片 ； 0050 图 3 是本发明制备的脱细胞神经基质的扫描电镜图片 ； 0051 图 4 是本发明制备的脱细胞神经基质的透射电镜图片 ； 0052 图 5 是实例中神经诱导的骨髓间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后第 10 天 相差显微镜下观察的图片， 可。

38、见大量类雪旺细胞 ； 0053 图 6 实例中未诱导的骨髓间充质干细胞和脱细胞神经基质共培养后第 10 天相差 显微镜下观察的图片， 可见大量梭形细胞。 具体实施方式 0054 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是对本发明的解释而 不是限定。 0055 本发明提供的复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组织工程神经的制备方法， 包 括以下操作 ： 0056 1） 取离体的异种动物的外周神经组织， 剔除其中的神经外血管、 脂肪及结缔组织 之后， 用胰蛋白酶处理 ； 胰蛋白酶处理完成后终止消化， 使用低渗处理液对神经组织进行低 渗处理 ； 0057 2） 将低渗处理后的神经组织在 S。

39、B-10 溶液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后转入含有 Triton X200 和 SB-16 的混合液中震荡浸泡 12h 以上， 清洗后得到脱细胞神经基质 ； 0058 3） 用含体积分数1020%的胎牛血清和15molL-巯基乙醇的DMEM-F12 说 明 书 CN 103446628 A 8 6/8 页 9 培养基预诱导传代后的骨髓间充质干细胞 12 24h， 无菌冲洗， 然后培养基更换为含质量 分数 1 2% 二甲基亚砜和体积分数 10 20% 的胎牛血清的 DMEM-F12 培养基， 诱导培养 12 24h ； 0059 4） 将脱细胞神经基质用 DMEM-F12 培养基充分浸润，。

40、 吸干培养基后 37孵育， 然后 接种诱导培养后的神经诱导骨髓间充质干细胞， 添加 DMEM-F12 培养， 并补充胎牛血清至体 积分数为 10 20%， 于 37、 5%CO2、 95% 湿度的条件下培养 48 小时， 得到复合神经诱导的骨 髓间充质干细胞的组织工程神经。 0060 本发明首先对异种生物神经组织进行处理， 在显微镜下仔细剔除神经外血管、 脂 肪及结缔组织， 使用胰蛋白酶处理神经， 以协助破坏在细胞膜和细胞外基质之间的结合， 然后在使用低渗处理液 （去离子水） 对神经进行低渗处理， 然后使用中性去细胞化学试剂 SB-10 溶液萃取， 将萃取好的神经组织用 PBS 缓冲液清洗后接。

41、着使用阴离子处理剂 Triton X200 和中性去细胞化学试剂 SB-16 溶液萃取， 之后再循环上述化学除垢剂的处理步骤， 但 作用时间减少， 最后达到彻底清除神经细胞的目的以完成脱细胞神经基质的制备。取一定 量的骨髓组织， 吹打制成单细胞悬液， 注入含 Percoll 分离液于离心管中离心， 收集离心液 上层云雾状细胞， 先后以 PBS 和 DMEM-F12 漂洗， 用含有胎牛血清的 DMEM-F12 培养基重悬细 胞后接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中进行原代培养， 之后定期更换 细胞液。 待细胞长满瓶底80时进行传代培养。 将传代后的骨髓间充质干细胞。

42、用含胎牛血 清和 - 巯基乙醇 (BME) 的 DMEM-F12 培养基预诱导骨髓间充质干细胞， PBS 冲洗后换成含 二甲基亚砜 (DMSO) 和胎牛血清的 DMEM-F12 诱导。将诱导的骨髓间充质干细胞制成细胞悬 液后分散、 点状注入事先制备好的脱细胞神经基质中， 置入培养皿中培养。 0061 所述的 PBS 溶液的 pH 为 7.2 7.4 ； 所述的 SB-10 溶液即二甲基硫代乙酸 -10， 为中性的去细胞化学剂 ； 所述的 SB-16 溶液即二甲基硫代乙酸 -16， 亦为中性去细胞化学 剂 ； 所述的 Triton X200 溶液即三硝基甲苯 X-100， 为阴离子处理剂 ； 所。

43、述的 DMEM-F12 培 养基为一种常用细胞培养基 ； 所述的 Percoll 分离液是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone,PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液 ； 所述的胎牛血清为常见的细胞外培养液， 其浓 度可根据不同需要调整 ； 所述的 - 巯基乙醇和二甲基亚砜均为常见的化学试剂， 以上试 剂和培养基均可从生物公司购得， 0.25% 胰蛋白酶消化液可自行配制或者由生物公司购得。 0062 下面结合具体的实施例来进行说明， 其中脱细胞神经基质来源于 York 猪肋间神 经 ； 骨髓间充质干细胞来源于 SD 大鼠骨髓。 0063 一种复合神经诱导的骨髓间充质干细胞的组。

44、织工程神经的制备方法， 包括以下操 作 ： 0064 1） 取健康 York 猪的外周神经组织 （肋间神经 60mm） ， 在显微镜下仔细剔除神经外 血管、 脂肪及结缔组织 ； 0065 2） 取上述处理后的神经， 加入 0.25% 胰蛋白酶， 37中以 100 次 / 分钟的频率震荡 水浴 30 分钟 ； 0066 3） 倾去上述容器中的胰蛋白酶， PBS 清洗 3 遍， 每次 5 分钟以终止胰酶消化， 加入 低渗溶液 （去离子水） ， 25中以 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 4 小时 ； 0067 4） 将处理后的神经组织转入含有灭菌 PBS 溶液中润洗 ； 0068 5） 转入含有。

45、浓度为 125mmol/L 的 SB-10 处理液中， 在 25中以 100 次 / 分钟的频 说 明 书 CN 103446628 A 9 7/8 页 10 率震荡水浴 15 小时 ； 0069 6） 转入灭菌 PBS 溶液中清洗 15 分钟， 期间 PBS 溶液至少更换 3 次 ； 0070 7） 转入 0.14%Triton X200 和 0.6mmol/L SB-16 混合处理液中， 在 25中以 100 次 / 分钟的频率震荡水浴 24 小时 ； 0071 8） 转入灭菌 PBS 清洗液中清洗 3 次， 每次 5 分钟 ； 0072 9） 再次转入含有浓度为 125mmol/L 的 。

46、SB-10 处理液继续以先前条件震荡萃取 7 小 时 ； 0073 10） 灭菌 PBS 溶液清洗 15 分钟， 每 5 分钟更换 1 次 PBS 溶液 ； 0074 11） 再次转入的 0.14%Triton X200 和 0.6mmol/L SB-16 混合处理液中， 同先前的 条件震荡萃取 15 小时 ； 0075 12） 转入含有灭菌 PBS 溶液中， 4保存。 0076 13）取一定量的骨髓组织， 使用无血清 DMEM-F12 培养基 （含青霉素、 链霉素各 100U/ml） 冲洗吹打制成单细胞悬液， 按细胞悬液和 Percoll 分离液以 1:1 的比例移至离心 管中， 将离心半径。

47、调至 8cm， 以 2000r/min 的速率离心 20 分钟， 收集离心液界面上乳白色云 雾状的细胞层， 先后以 PBS 和 DMEM-F12 漂洗， 用含有 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养基重悬 细胞， 计数 5105个 /ml 后即接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中进行 原代培养， 分别于 1、 3 天半量换液， 以后每 3 天全量换液 1 次。倒置相差显微镜观察细胞培 养全过程。待细胞长满瓶底 80时进行传代培养， 以 1104个 /ml 传代 ； 0077 具体的， 将 SD 大鼠断颈处死， 70% 乙醇消毒， 无菌条件下取股骨、 胫骨，。

48、 剔出周围肌 肉组织， 剪去两端骨骺， 抽取 5ml 无血清 DMEM-F12 培养基 （含青霉素、 链霉素各 100U/ml） 冲 洗骨髓腔， 吹打制成单细胞悬液， 注入含有 5ml 的 Percoll 分离液的离心管中， 将离心半径 调至 8cm， 以 2000r/min 的速率离心 20 分钟， 收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层， 先 后以 PBS 和 DMEM-F12 漂洗， 用含有 10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养基重悬细胞， 计数 5105 个 /ml 后即接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱中进行原代培养， 分别于 1、 3 天半量换液， 以后每 3 天全量换液 1 次。 0078 14） 用含 20胎牛血清和 3mol L- 巯基乙醇 (BME) 的 DMEM-F12 培养基预 诱导上述传代后的骨髓间充质干细胞24小时， 以无菌PBS冲洗3次， 然后换成含2二甲基 亚砜 (DMSO) 和 20胎牛血清的 DMEM-F12， 诱导 24 小时。 0079 15） 取制备好的脱细胞神经基质， 用 DMEM-F12 培养基浸润 12 小时， 然后将培养基 吸干， 置于37的孵。