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1、(10)申请公布号 CN 103451296 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451296 A *CN103451296A* (21)申请号 201310403350.8 (22)申请日 2013.09.06 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 红云红河烟草 （集团） 有限责任公司 地址 650202 云南省昆明市北郊上庄 (72)发明人 杨莹 张天栋 周博 付磊 王欣林 赵英良 汤丹瑜 张玲 雷声 陈绍田 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 53108 代理人 马晓青 (54) 发明名称 一种应用 SSR 分子标记。
2、技术鉴定商品卷烟的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种应用 SSR 分子标记技术鉴 定商品卷烟的方法， 属于分子生物学领域。 本发明 运用 SSR 技术对单品种烟草进行遗传图谱分析， 从中筛选出变异率适中、 具有品种特异性的 SSR 位点。提取商品卷烟烟丝的总 DNA， 用筛选出的特 异性引物进行扩增， 将获得的遗传变异式样与单 品种的式样进行对比， 根据品种特异性位点的有 无可分辨出商品卷烟烟丝中所含烟叶品种， 对照 相应的卷烟配方中烟叶品种的使用情况， 便能鉴 定卷烟的真伪。 同时该方法也适用于单品种烟叶、 叶组丝及混合品种烟丝样品的鉴定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 。
3、说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103451296 A CN 103451296 A *CN103451296A* 1/1 页 2 1. 一种应用 SSR 分子标记技术鉴定商品卷烟的方法， 其特征在于将 SSR 分子标记技术 应用于商品卷烟的鉴定中， 通过识别单品种或混合品种的特征条带， 掌握所鉴定样品的原 料品种组成， 达到辨别真伪的目的， 方法如下 ： （1） 从烟草基因组序列中随机选择具有 SSR 序列的区间设计引物， 目标片段长度在 110 250bp ； （2） 。
4、提取单品种烟草 DNA ； （3） 品种特异性引物的筛选， 将所设计的全部 SSR 引物在所收集的烟草单品种样品中 进行扩增， 筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的 SSR 标记 ； （4） 鉴定， 提取需要鉴定样品的总 DNA， 用筛选出的品种特异性引物进行扩增， 根据电泳 图谱显示的品种特异性条带， 判断样品中品种组成， 通过与正品配方进行对比， 鉴定卷烟真 伪。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在所鉴定的烟叶为单品种烟叶、 叶组丝或商品卷 烟中的烟丝。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的品种特异性 SSR 多态性引物设计是从 烟草基因组序列中随机选择具有。
5、 SSR 序列的区间设计引物， 从 GENBANK 数据库中下载烟草 全基因组序列， 通过 SSR Hunter 软件搜索包含 SSR 位点的序列， 通过 Oligo6.0 在其两侧设 计引物， 目标片段长度在 110 250bp。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的单品种烟草为红花大金元、 NC102、 K326， 或其他烟草品种。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的品种特异性引物筛选是全部 SSR 引物 在所收集的烟草单品种样品中进行 PCR 扩增， 筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异 性的SSR标记， 引物筛选中PCR产物均用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6、分离， 银染显色 ； 用品种特 异性的标记引物扩增全部样品， PCR 产物通过 QIAxcel 进行毛细管电泳， 读取片段长度 ； 保 留所筛选出的具有品种特异性的引物。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的混合品种烟丝和商品卷烟的鉴定是按 所述步骤提取需要鉴定的样品总 DNA， 应用筛选出的品种特异性引物对其进行 PCR 扩增， 并 与相应引物扩增的单品种烟草样品 PCR 产物同时电泳， 对比电泳图谱， 便可知样品中所含 烟草品种， 对比商品卷烟的配方， 样品中所含品种是否与配方一致， 若不一致便能判断其是 伪品。 权 利 要 求 书 CN 103451296 A 2 1/6。
7、 页 3 一种应用 SSR 分子标记技术鉴定商品卷烟的方法 技术领域 ： 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 具体地说， 本发明涉及应用一种分子生物学技 术方法进行商品卷烟的鉴定。同时， 本发明还涉及所述方法对单品种烟叶和混合烟丝样品 的鉴定。 背景技术 ： 0002 烟草作为人类最重要的经济作物之一， 其遗传学特征一直都是研究的热点， 目前， 烟草的基因组全序列图谱已完成， 这使人们能够从基因组的层面上更深入地对烟草进行研 究。 其中， 关于烟草品种的遗传多样性研究不在少数， 但从叶组配方和商品烟的角度研究还 未见报道。原料品质的稳定和杜绝假冒伪劣产品是卷烟品牌生命力的重要保障。分子生。
8、物 学技术在目前来说是最精确的品种鉴定手段， 将其应用到商品卷烟真伪和原料品种的鉴定 中， 可更精确地了解原料组成， 达到防伪的目的。 0003 DNA 简单重复序列 （SSR） 也称为微卫星 DNA， 是真核生物基因组中广泛分布的短串 联 DNA 序列， 由串联重复的核心序列和两侧较保守的侧翼序列构成。通常每个重复单位仅 1 8 个碱基， 重复数为 10 20 次。在特定位点上按孟得尔方式分离的微卫星 DNA 提供 了变异丰富、 选择中性、 共显性的分子标记， 可用于植物种间、 种内居群间以及个体间的多 态性分析， 在遗传作图、 群体遗传研究、 个体间亲缘关系以及品种鉴定等方面得到了广泛应 。
9、用。成品烟丝由于生产和加工过程中 DNA 降解较为严重， 通常可提取的 DNA 长度较短， 因此 限制了对于 DNA 质量要求较高的遗传标记技术 （如 AFLP 等） 的应用。而 SSR 标记目标 DNA 片段长度通常在 100-400bp， 因此， SSR 技术为 DNA 质量较差的植物产品的分子鉴定提供了 可能。对不同烟草品种进行遗传图谱分析， 建立烟草品种 DNA 指纹， 筛选品种特异性 SSR 多 态性变异式样， 通过比对成品烟丝 SSR 多态性特征， 可能对成品烟原料品种及其来源进行 鉴定。并且， SSR 技术识别灵敏度高， 可鉴别出混合样品中含量较少的目标样品。以往商品 卷烟真伪判。
10、定依据产品商标、 包装和抽吸感官， 而采用分子生物学的方法根据卷烟原料品 种进行鉴定目前还未有报道。 发明内容 ： 0004 本发明根据烟草全基因组序列设计烟草 SSR 引物， 用所设计的引物对单品种的烟 草 DNA 进行扩增， 筛选有品种特异性的位点。提取需要检测的商品卷烟烟丝或混合品种烟 丝的总 DNA， 用筛选出的具有品种特异性的引物对其进行扩增， 根据扩增所得的片段判断样 品中品种的组成， 从而鉴定商品卷烟或混合烟丝的真伪。此方法可直观从电泳图谱上进行 烟草品种的鉴定， 鉴别结果准确可靠， 灵敏度高， 具有较好的应用前景， 丰富了卷烟鉴定的 手段。 0005 基于上述认识， 本发明的目。
11、的在于提供一种直观、 准确的鉴定商品卷烟或混合烟 丝样品的方法。 0006 本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的 ： 说 明 书 CN 103451296 A 3 2/6 页 4 0007 一种应用 SSR 分子标记技术鉴定商品卷烟的方法， 将 SSR 分子标记技术应用于商 品卷烟的鉴定中， 通过识别单品种或混合品种的特征条带， 掌握所鉴定样品的原料品种组 成， 达到辨别真伪的目的， 方法如下 ： 0008 （1） 从烟草基因组序列中随机选择具有 SSR 序列的区间设计引物， 目标片段长度 在 110 250bp ； 0009 （2） 提取单品种烟草 DNA ； 0010 （3） 品种特异。
12、性引物的筛选， 将所设计的全部 SSR 引物在所收集的烟草单品种样 品中进行扩增， 筛选多态性仅存在于品种间的具有品种特异性的 SSR 标记 ； 0011 （4） 鉴定， 提取需要鉴定样品的总 DNA， 用筛选出的品种特异性引物进行扩增， 根据 电泳图谱显示的品种特异性条带， 判断样品中品种组成， 通过与正品配方进行对比， 鉴定卷 烟真伪。 0012 所述的方法适用的鉴定范围为单品种烟叶、 叶组丝及混合品种烟丝。 0013 品种特异性引物的设计和筛选采用 ： 0014 （1） SSR 多态性引物设计 0015 从烟草基因组序列中随机选择具有 SSR 序列的区间设计引物。从 GENBANK 数据。
13、库 中下载烟草全基因组序列， 通过 SSR Hunter 软件搜索包含 SSR 位点的序列， 通过 Oligo6.0 在其两侧设计引物， 目标片段长度在 110 250bp。 0016 （2） 单品种烟草 DNA 提取 0017 取新鲜或干燥不同年份、 产地红花大金元、 NC102、 K326 等单品种烟草叶片， 分别将 其组织研磨成细粉末， 放入 2mL 离心管中， 加入 0.4 1mL65预热的 CTAB 提取缓冲液和 1 2L0.2 V/V 的巯基乙醇， 震荡混匀 ； 65水浴 40min， 每隔 8min 混匀一次， 水浴结束 后每管样品加入等体积的24:1氯仿/异戊醇混合液， 混匀，。
14、 12000r/min离心10min后， 将上 清液转入新的 2mL 离心管中 , 重复此步骤一次 ； 离心管中加入 70% 体积已在 4冰箱中放 置预冷的异丙醇， 混匀液体， 放置 -20冰箱 1h ； 再用 12000r/min 离心 10min， 弃上清， 沉淀 用 20 40mL70% 乙醇和无水乙醇各洗两次， 倒出管中乙醇后， 将管子敞口放置 40恒温箱 中干燥 ； 待管子完全干燥后， 置于 -20冰箱中储存。 0018 （3） 品种特异性引物筛选 0019 全部 SSR 引物在所收集的烟草单品种样品中进行 PCR 扩增， 筛选多态性仅存在于 品种间的具有品种特异性的 SSR 标记，。
15、 引物筛选中 PCR 产物均用 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离， 银染显色。用品种特异性的标记引物扩增全部样品， PCR 产物通过 QIAxcel 进行毛细管 电泳， 读取片段长度。保留所筛选出的具有品种特异性的引物。 0020 PCR 反应在 PTC-200PCR 仪上按以下程序进行 ： 93预热 3min， 40-44 个循环 （93 30s， 52-56 30s， 72 15s） ， 72 7min。由于成品烟丝中 DNA 质量较差， 反应中退火 温度比引物理论退火温度相应降低 5-10。反应体系 25L （包括 10PCR 缓冲液 2.5L， dNTP(2.5mol each)0.5L。
16、， 引物各 0.5L(5mol/L) 和 Taq DNA0.3L(TaKaRa)） 。 0021 以红花大金元、 NC102和K326为例， 筛选出的具红花大金元品种特异性引物NT5在 红花大金元品种中扩增片段长度为 209bp， 在 NC102 和 K326 品种中扩增片段长度为 213bp ； 筛选出的具 NC102 品种特异性引物 NT10 在 NC102 品种中扩增片段长度为 156bp， 在红花大 金元和K326品种中扩增片段长度为159bp ； 筛选出的具K326品种特异性的引物NT1在K326 说 明 书 CN 103451296 A 4 3/6 页 5 品种中扩增片段长度为 1。
17、49bp， 在红花大金元和 NC102 品种中扩增长度为 152。 0022 混合品种烟丝和商品卷烟的鉴定按下述方法进行 ： 0023 按前述步骤提取需要鉴定的样品总 DNA， 应用筛选出的品种特异性引物对其进行 PCR 扩增， 并与相应引物扩增的单品种烟草样品 PCR 产物同时电泳， 对比电泳图谱， 便可知 样品中所含烟草品种， 对比商品卷烟的配方， 样品中所含品种是否与配方一致， 若不一致便 能判断其是伪品。 0024 于云烟 （紫） 和云烟 （软珍品） 两个牌号和混合品种的叶组丝中验证该方法， 结果表 明该方法对商品卷烟和混合品种烟丝中所含烟草品种判断准确， 可以应用于商品卷烟真伪 的鉴。
18、定。 0025 本发明针对商品卷烟的特点， 选用 SSR 分子标记技术进行对其进行鉴定。与现有 技术相比， 本发明具有如下优势 ： 0026 （1） 针对卷烟配方中烟草品种进行鉴定， 可在多个品种混合的样品中找到目标品 种的条带， 鉴定结果准确、 可靠。可用于商品卷烟、 混合烟丝、 烟草品种的鉴定， 有较好的应 用价值。 以往商品卷烟真伪判定依据产品商标、 包装和抽吸感官， 而采用分子生物学的方法 根据卷烟原料品种进行鉴定， 结果准确可靠， 丰富了卷烟鉴定的手段。 0027 （2） 根据文献报道， 我国烟草各类型间遗传一致性较高， 遗传多样性低， 因此要选 择在烟草品种间分辨率较高的分子生物学。
19、手段进行鉴定。 经过文献查阅和前期研究， SSR分 子标记在烟草品种间有较好的分辨率， 能准确定位目标品种， 适合用于烟草品种的区分。 0028 （3） 商品卷烟和烘烤、 陈化过的烟丝经过多道工序加工及较长时间的存放， 其中所 含 DNA 往往降解严重。经对比， 新鲜叶片经硅胶干燥后提取的 DNA 长度约 20kb， 而商品卷 烟烟丝中提取的总 DNA 长度在 600-800bp， 说明商品卷烟烟丝中 DNA 存在严重降解。因此， 商品卷烟的鉴定不适宜采用对 DNA 质量要求较高的遗传标记技术。而 SSR 分子标记技术分 析的目标 DNA 片段长度通常在在 100-400bp， 相对其他技术来。
20、说受 DNA 降解的影响较小， 因 此， 此方法适用性较广。 0029 （4） 卷烟配方中往往含有多个品种的烟丝， 有的品种的烟丝在配方中所占的比例 较小， 实验表明， 本发明中所采用的分析方法可识别混合品种样品中含量很低的组分， 具有 较高的灵敏度， 因此此方法在商品卷烟的鉴定中有较高的应用价值。 附图说明 ： 0030 图 1 为不同品种烟叶与云烟 （紫） 烟丝 SSR 分析毛细管电泳图， D01 09 分别为 NT1， NT5， NT10 三对引物在 NC102， K326 和红花大金元三个品种中变异式样的毛细管电泳 图 ； D10 12 依次为 NT1 在云烟 ( 印象 )， 云烟 （。
21、软珍品） 和云烟 （紫） 中的式样 ； 0031 图 2 为 NT5 在 NK1， NK2， NK3， HK1， HK2， HK3， HN1， HN2， HN3， CY1， CY2， CY3（从左至 右） 中式样的毛细管电泳图 ； 0032 图 3 为 NT10 在 NK1， NK2， NK3， HK1， HK2， HK3， HN1， HN2， HN3， CY1， CY2， CY3（从左 至右） 中式样的毛细管电泳图。 具体实施方式 ： 0033 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图， 通过实施例 说 明 书 CN 103451296 A 5 4/6 页 6 对本发。
22、明作进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明的保护范围。 0034 实施例 1 ： 0035 （1） SSR 多态性引物设计 0036 从烟草基因组序列中随机选择具有 SSR 序列的区间设计引物。从 GENBANK 数据库 中下载烟草全基因组序列， 通过 SSR Hunter 软件搜索包含 SSR 位点的序列， 通过 Oligo6.0 在其两侧设计引物， 目标片段长度在 110 250bp。 0037 （2） 单品种烟草 DNA 提取 0038 取新鲜或干燥不同年份、 产地的红花大金元、 NC102、 K326 等单品种烟草叶片， 分别 将。
23、其组织研磨成细粉末， 放入2mL离心管中， 加入0.41mL65预热的CTAB提取缓冲液和 1 2L0.2 V/V 的巯基乙醇， 震荡混匀 ； 65水浴 40min， 每隔 8min 混匀一次， 水浴结束 后每管样品加入等体积的24:1氯仿/异戊醇混合液， 混匀， 12000r/min离心10min后， 将上 清液转入新的 2mL 离心管中 , 重复此步骤一次 ； 离心管中加入 70% 体积已在 4冰箱中放 置预冷的异丙醇， 混匀液体， 放置 -20冰箱 1h ； 再用 12000r/min 离心 10min， 弃上清， 沉淀 用 20 40mL70% 乙醇和无水乙醇各洗两次， 倒出管中乙醇后。
24、， 将管子敞口放置 40恒温箱 中干燥 ； 待管子完全干燥后， 置于 -20冰箱中储存。 0039 （3） 品种特异性引物筛选 0040 全部 SSR 引物在所收集的烟草单品种样品中进行 PCR 扩增， 筛选多态性仅存在于 品种间的具有品种特异性的 SSR 标记， 引物筛选中 PCR 产物均用 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离， 银染显色。用品种特异性的标记引物扩增全部样品， PCR 产物通过 QIAxcel 进行毛细管 电泳， 读取片段长度。保留所筛选出的具有品种特异性的引物。 0041 PCR 反应在 PTC-200PCR 仪上按以下程序进行 ： 93预热 3min， 40-44 个循环 （。
25、93 30s， 52-56 30s， 72 15s） ， 72 7min。由于成品烟丝中 DNA 质量较差， 反应中退火 温度比引物理论退火温度相应降低 5-10。反应体系 25L （包括 10PCR 缓冲液 2.5L， dNTP(2.5mol each)0.5L， 引物各 0.5L(5mol/L) 和 Taq DNA0.3L(TaKaRa)） 。 0042 以红花大金元、 NC102和K326为例， 筛选出的具红花大金元品种特异性引物NT5在 红花大金元品种中扩增片段长度为 209bp， 在 NC102 和 K326 品种中扩增片段长度为 213bp ； 筛选出的具 NC102 品种特异性引。
26、物 NT10 在 NC102 品种中扩增片段长度为 156bp， 在红花大 金元和K326品种中扩增片段长度为159bp ； 筛选出的具K326品种特异性的引物NT1在K326 品种中扩增片段长度为 149bp， 在红花大金元和 NC102 品种中扩增长度为 152。 0043 （4） 市售云烟 （紫） 的鉴定 0044 卷烟专卖店中购买一包云烟 （紫） 进行真伪鉴定。 0045 取出卷烟样品中的烟丝， 按前述步骤提取总 DNA， 应用筛选出的品种特异性引物对 其进行 PCR 扩增 （步骤、 反应条件同前） 。与相应引物扩增的单品种烟草样品的 PCR 产物同 时通过 QIAxcel 仪器进行毛。
27、细管电泳， 电泳图谱如图 1 所示。 0046 图 1 中， D01 09 分别为 NT1， NT5， NT10 三对引物在 NC102， K326 和红花大金元 三个品种中变异式样的毛细管电泳图 ； D10 12 依次为 NT1 在云烟 ( 印象 )， 云烟 （软珍品） 和云烟 （紫） 中的式样。 0047 D01-D03 为 NT1 在 NC102， K326 和红花大金元中的变异式样， 假如样品中存在 说 明 书 CN 103451296 A 6 5/6 页 7 K326， 图谱中将显示有 K326 的变异式样。D10-D12 分别为 NT1 在云烟 ( 印象 )， 云烟 （软珍 品） 。
28、和中的式样， 从图上可知云烟 （紫） 样品中没有显示 K326 的式样， 从而可推断云烟 （紫） 样品中可能不含有 K326， 对照红云红河集团叶组配方表， 可知 2011 年 7 月 2012 年 1 月 生产的云烟 （紫） 配方中没有 K326， 所购买的云烟 （紫） 为 2011 年底生产， 其配方中应不含有 K326 组分。证明所购买的卷烟为正品。 0048 实施例 2 ： 0049 （1） SSR 多态性引物设计、 单品种烟草 DNA 提取、 品种特异性引物筛选步骤同实施 例 1。 0050 （2） 混合样品中目标品种的鉴定 0051 将三个品种的烟叶按不同比例两两混合， 混合品种和。
29、比例如表 1 所示。 0052 表 1 混合样品组成 0053 0054 提取混合样品总 DNA， 按前述步骤进行， 应用筛选出的品种特异性引物 NT5 对其进 行 PCR 扩增 （步骤、 反应条件同前） 。获得的 PCR 产物通过 QIAxcel 仪器进行毛细管电泳， 电 泳图谱如图 2 所示。 0055 图 2 中 A01 至 A03 为 NT5 扩增的 NC102 与 K326 混合物条带， A04 至 A06 为 NT5 扩 增的红花大金元与 K326 混合物条带， A07 至 A09 为 NT5 扩增的红花大金元与 NC102 混合物 条带。在含有红花大金元的所有比例混合的样品中 （。
30、A04-A09） 均显示出两个特征性条带。 其中 A04 为 95% 红花大金元与 5%K326 混合物， A07 为 95% 红花大金元与 5%NC102 混合物， 这两个样品中， 只有 5% 含量的 K326 与 NC102 均能扩增出各自的特征性条带， 说明应用方法 能有效检测出样品中含量较少的组分， 具有较高的灵敏度， 适用于品种含量不同的混合烟 丝的鉴定。 0056 实施例 3 ： 0057 （1） SSR 多态性引物设计、 单品种烟草 DNA 提取、 品种特异性引物筛选步骤同实施 例 1。 0058 （2） 混合样品中目标品种的鉴定 0059 将三个品种的烟叶按不同比例两两混合， 。
31、混合品种和比例与实施例 2 中表 1 所示 说 明 书 CN 103451296 A 7 6/6 页 8 一致。 0060 提取混合样品总 DNA， 按前述步骤进行， 应用筛选出的品种特异性引物 NT10 对其 进行 PCR 扩增 （步骤、 反应条件同前） 。获得的 PCR 产物通过 QIAxcel 仪器进行毛细管电泳， 电泳图谱如图 3 所示。 0061 图 3 中 B01 至 B03 为 NT10 扩增的 NC102 与 K326 混合物条带， B04 至 B06 为 NT10 扩增的红花大金元与 K326 混合物条带， B07 至 B09 为 NT10 扩增的红花大金元与 NC102 混。
32、 合物条带。在含有 NC102 的所有比例混合的样品中 （B01-B03,B07-B09） 均显示出两个特征 性条带。其中 B01 为 95%NC102 与 5%K326 混合物， B07 为 95% 红花大金元与 5%NC102 混合 物， 这两个样品中， 只有 5% 含量的 K326 与 NC102 均能扩增出各自的特征性条带， 说明应用 此方法能有效检测出样品中含量较少的组分， 具有较高的灵敏度。适用于品种含量不同的 混合烟丝的鉴定。 说 明 书 CN 103451296 A 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103451296 A 9 2/2 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103451296 A 10 。