血小板源性生长因子BB产生增强剂、以及包含该增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂.pdf

摘要
申请专利号：	CN201180001106.8	申请日：	2011.07.01
公开号：	CN102971415A	公开日：	2013.03.13
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/0775申请日:20110701\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N5/0775; A23L1/30; A61K31/047; A61K31/661; A61K36/18; A61K36/53; A61P17/02	主分类号：	C12N5/0775
申请人：	株式会社资生堂
发明人：	相马勤; 饭野雅人; 山西治代
地址：	日本东京都
优先权：
专利代理机构：	北京市中咨律师事务所 11247	代理人：	段承恩;田欣
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内容摘要

本发明提供能够有效地增强有助于间充质系干细胞的产生促进和/或干细胞稳定化的血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的产生的新的制剂。本发明提供一种PDGF-BB？产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的1种或2种以上作为有效成分。

权利要求书

权利要求书一种血小板源性生长因子‑BB即PDGF‑BB产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的1种或2种以上作为有效成分。
根据权利要求1所述的PDGF‑BB产生增强剂，其在包含肌醇或肌醇磷酸的同时，还包含酵母提取物。
根据权利要求1或2所述的PDGF‑BB产生增强剂，其中，肌醇或肌醇磷酸来源于米糠。
一种间充质系干细胞产生促进剂，其中，包含权利要求1～3的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。
一种干细胞稳定剂，其中，包含权利要求1～3的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。
一种真皮再生剂，其中，包含权利要求1～3的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。

说明书

说明书血小板源性生长因子‑BB产生增强剂、以及包含该增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂
技术领域
本发明涉及血小板源性生长因子‑BB(PDGF‑BB)产生增强剂、以及包含该PDGF‑BB产生增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂。
背景技术
干细胞是兼有产生分化成多种细胞的细胞的多分化能力和通过细胞分裂产生与该细胞相同的细胞的自我复制能力这2种性质的细胞。来源于作为受精卵的早期发育阶段的胚的干细胞被称为胚性干细胞(ES细胞)。虽然人ES细胞可期待用于再生医疗，但是由于利用受精卵这样的伦理上的问题，因此不允许制作新的人ES细胞。
近年来，作为具有类似于ES细胞的性质的细胞，人工多能性干细胞(iPS细胞)也受到关注。然而，从细胞的癌化、制作效率等观点出发，iPS细胞的制作存在大量问题。另一方面，由于具有分化成特定组织的能力的体性干细胞可从患者自身的身体组织例如骨髓得到，因此不存在像胚性干细胞那样的伦理上的问题。
在皮肤中，在表皮基底层存在表皮干细胞(非专利文献1)是众所周知的，而且报告了在被称为毛囊隆突区(bulge region)的区域存在毛囊上皮干细胞(非专利文献2)、皮肤色素干细胞(非专利文献3)。另一方面，在真皮中，在以胶原为主体的纤维成分中存在呈细长的纺锤形的成纤维细胞，但是在真皮的成纤维细胞中是否存在干细胞还不清楚。此外，虽然已知真皮中存在分化成脂肪、神经胶质、软骨、肌肉等多个细胞系的皮肤源性前体细胞(skin‑derived precursors：SKP)(非专利文献4)，但是真皮成纤维细胞与SKP之间的关系还不清楚。
由于作为成纤维细胞的前体细胞而从骨髓被分离出的间充质系干细胞(非专利文献5)分化成属于间充质系的各种细胞(骨细胞、肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等)，因此可期待应用于骨、血管、肌肉的重建等再生医疗。最近，具有间充质系组织的组织大量存在的可能性明确起来，从脂肪、脐带血、胎盘等中也都分离出了间充质系干细胞(非专利文献6～8)。
根据近年来的认识可知，间充质系干细胞作为血管周细胞(pericyte)存在于全身血管中，在血管稳定化、组织稳态维持方面发挥作用(非专利文献9和10)。
此外，如果在组织损伤部位或其附近血管被破坏，则作为血管周细胞(pericyte)的间充质系干细胞从血管脱离并增殖，在供给丧失的细胞(非专利文献11～14)的同时，释放出具有生物活性的因子以保护组织(非专利文献15～19)，在损伤后的组织的修复、再生中发挥作用。这些分泌因子除了具有血管形成、抗细胞凋亡的作用以外，还被报告了具有有力抑制免疫的作用(非专利文献21和22)、抑制T细胞、B细胞介导的损伤组织的破坏(非专利文献9和22)。
此外已知，间充质系干细胞也显示抗纤维化的作用(非专利文献23和24)、和/或对多发性硬化症、糖尿病的效果(非专利文献9)。
另一方面，逐步明确了慢性炎症是在各种疾病(例如代谢综合征、动脉硬化性疾病、癌、神经变性疾病、自身免疫疾病等)中共有的基本病态(非专利文献25)。例如，报告了由慢性炎症诱导了内皮细胞功能障碍、胰岛素抵抗，从而成为糖尿病、动脉硬化性疾病等各种疾病的原因(非专利文献26)。进而也明确了，肥胖的脂肪组织本身会导致向炎症性变化(非专利文献27～29)。由于慢性炎症在血管周围发生，因此认为在慢性炎症中，作为血管周细胞(pericyte)的间充质系干细胞与血管的相互作用也发生了障碍。
基于以上认识可以认为，如果能够实现间充质系干细胞的产生促进和/或稳定化，则在血管稳定化、组织稳态维持、损伤组织的修复和/或再生、抗纤维化、多发性硬化症、糖尿病等各种疾病的预防和/或治疗、基于代谢综合征等慢性炎症的各种状态的预防和/或改善等各种用途中是极其有效的。
本发明者们报告了在真皮中也存在间充质系干细胞，确立了从真皮高效地分离间充质系干细胞的方法(日本特愿2009‑213291)。如果考虑上述的间充质系干细胞的作用，则认为通过实现真皮中的间充质系干细胞的稳定化和/或产生增强，从而在真皮的状态改善和/或再生等中也是有效的。
此外，本发明者们在更详细地明确在真皮、皮下脂肪中的间充质系干细胞的存在部位的同时，发现血小板源性生长因子‑BB(PDGF‑BB)参与间充质系干细胞的局部化，进而明确了血管内皮细胞中的PDGF‑BB的产生增强有助于间充质系干细胞的产生增强和稳定化(日本特愿2010‑209705)。
血小板源性生长因子(PDGF)是参与成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等间充质系干细胞的迁移和增殖等调节的生长因子，是由上皮细胞、内皮细胞等各种细胞产生的。PDGF中存在PDGF‑A、PDGF‑B、PDGF‑C和PDGF‑D至少4种，但通过A链和B链形成二硫键而得到同源二聚体或异源二聚体结构，从而具有3种异构体(PDGF‑AA、PDGF‑AB、PDGF‑BB)。已知PDGF介由作为酪氨酸激酶偶联型的PDGF受体(PDGFR)表现其生理作用。PDGF‑B的基因是公知的，已被基因克隆(非专利文献30)。
认为如果能够发现对上述PDGF‑BB的产生增强有效的成分，则可以使用该成分来实现间充质系干细胞的产生促进和/或干细胞的稳定化，进而可以在上述各种用途等中有效地使用。
非专利文献1：Watt FM，J Dermatol Sci，28：173‑180，2002
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非专利文献30：Dalla‑Favera R et al.，Nature，292：31‑35，1981
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述背景而提出的，其课题是提供对PDGF‑BB的产生增强有效的制剂，并且使用该制剂来提供对间充质系干细胞的产生促进和/或其稳定化有效的制剂。
用于解决课题的方法
本发明者们对多种材料进行了反复研究，从而筛选使PDGF‑BB的产生增强的药剂，结果发现，越桔、莽吉柿和黄芩的各植物来源物、以及肌醇和肌醇磷酸分别显示显著的PDGF‑BB产生增强作用，从而完成了本发明。
因此，本申请包括下述发明：
[1].一种血小板源性生长因子‑BB(PDGF‑BB)产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的1种或2种以上成分作为有效成分。
[2].根据[1]所述的PDGF‑BB产生增强剂，其在包含肌醇的同时，还包含酵母提取物。
[3].根据[1]或[2]所述的PDGF‑BB产生增强剂，其中，肌醇是来源于米糠的肌醇磷酸。
[4].一种间充质系干细胞产生促进剂，其包含[1]～[3]的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。
[5].一种干细胞稳定剂，其包含[1]～[3]的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。
[6].一种真皮再生剂，其包含[1]～[3]的任一项所述的PDGF‑BB产生增强剂。
发明的效果
根据本发明，提供对PDGF‑BB的产生增强有效的制剂，并且通过使用该制剂来提供对间充质系干细胞的产生促进和/或稳定化等有效的制剂。
具体实施方式
[越桔来源物]
越桔(学名：Vaccinium vitis‑idaea L.)是杜鹃花科越桔属的植物。在本发明中，作为越桔来源物，可以使用将越桔的花、花穗、果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得到的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得到的物质，或粉碎后通过酶处理、机械处理等处理进行分解而得到的物质。
在对越桔进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是可在提取中使用的溶剂即可，可以任意地使用，可以分别单独使用或组合使用例如水、甲醇、乙醇、丙二醇、1，3‑丁二醇、甘油等醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。
提取可以在常温下进行，也可以在加热下(例如使用温水、热水等加热后的溶剂)进行。
可以直接使用以上述溶剂提取得到的提取液或者浓缩后的提取物，或者也可以使用将这些提取物使用吸附法例如离子交换树脂除去杂质后的物质，和/或采用多孔聚合物(例如アンバ一ライトXAD‑2)的柱进行吸附后再用甲醇或乙醇溶出、浓缩而得的物质。此外，也可以使用通过公知的分配法(例如使用水/乙酸乙酯等的分配法)提取而得的提取物等。
在对越桔进行分解的情况下，可以进行能够选择性地分解细胞间质且维持细胞形态的“单细胞化处理”。可以将例如日本特开2002‑193734中记载的方法作为参考。具体是指下述处理：对于植物，通过酶解和/或机械分解等在几乎不分解细胞壁的情况下选择性地分解或破坏细胞间质，将对象物以维持细胞形态的状态分解成细胞单元，制成粥状、液体组合物或冷冻干燥品。为了进行上述选择性分解，可以使用酶处理。例如，可以使用通过通常公知的方法从根霉属(Rizopus)、曲霉属(Aspergillus)等的酶原料中分离或分离纯化而得的酶，此外，也可以使用市售品。在使这些单细胞化酶作用于越桔的情况下，优选在所用的酶的最适温度和最适pH值等最适条件下使其作用，并且使用必要最少量。这里，单细胞化酶的最适温度为30～45℃，最适pH值为4～6。此外，在酶反应后成为残渣的部分例如可以通过使用20目左右的筛来除去，从而制成能够包含在本外用组合物中的越桔来源物。
此外，除了上述的单细胞化植物的悬浮液以外，本发明中也可以使用通过离心分离等方法将该悬浮液脱水而获得的单细胞糊或其干燥品。
关于越桔，迄今为止有作为含有单细胞化处理后的越桔的外用剂(日本特开2002‑193734)、用于杀菌、抗菌和防止头皮屑的化妆品(日本特开昭61‑238719)、弹性蛋白酶活性抑制剂(日本特开2002‑363088)、活性酶清除剂(日本特开2002‑363027)、黑素生成抑制剂(日本特开2002‑363057)、过氧化脂质生成抑制剂(日本特开2002‑363089)、胶原酶活性抑制剂(日本特开2003‑12531)、透明质酸酶活性抑制剂(日本特开2003‑73287)、金属蛋白酶表达抑制剂(日本特开2002‑193738)、抗糖化剂(日本特表2004‑505007)、以及针对皮肤肥厚、皮肤硬化等皮肤损伤的抗皮肤损伤剂(日本特开2005‑306850)使用的例子，但越桔来源物具有PDGF‑BB产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们此次首次发现的。
[莽吉柿来源物]
莽吉柿(学名：Garcinia mangostana)是藤黄科藤黄属的植物。在本发明中，作为莽吉柿来源物，可以使用将莽吉柿的果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得的物质。
在对莽吉柿进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是可在提取中使用的溶剂即可，可以任意使用，例如，可以通过用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇等低级醇或含水低级醇、丙二醇、1，3‑丁二醇等多元醇或含水多元醇、丙酮、乙酸乙酯等各种有机溶剂提取，再蒸馏除去溶剂而获得。
提取可以在常温进行，也可以在加热下(例如，使用温水、热水等加热后的溶剂)进行。
此外，可以在溶剂中加入酶进行提取处理。通过加入酶，可以使果实的细胞组织破坏，由此可以进一步提高提取效率。作为酶，优选使用细胞组织浸解酶。作为这样的酶，可列举例如，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α‑淀粉酶、肌醇六磷酸酶。这些酶可以单独使用1种，也可以2种以上混合使用。
可以将使用上述提取溶剂而获得的提取液直接使用，也可以蒸馏除去提取溶剂，根据需要干燥后再使用。
关于莽吉柿，迄今为止有作为紫外线吸收剂(日本特开平9‑87155)、MMPs抑制剂(日本特开2003‑252745)、成纤维细胞活化剂(日本特开2006‑249051)使用的例子，而且，已知其具有呫吨酮衍生物的制造和胶原产生作用(日本特开2009‑84169)，但莽吉柿来源物具有PDGF‑BB产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们这次首次发现的。
[黄芩来源物]
黄芩(学名：Scutellaria baicalensis Georgi，Labiatae)是唇形科黄芩属的植物。在本发明中，作为黄芩来源物，可以使用将黄芩的果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得到的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得到的物质。
在对黄芩进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是通常可在植物提取等中使用的溶剂即可，可以任意使用，可列举例如，水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等低级醇、丙二醇、1，3‑丁二醇等多元醇、或这些醇类的含水物、正己烷、甲苯等烃系溶剂等。这些溶剂可以分别单独使用或任意的二种以上组合使用。其中，优选使用甲醇和/或乙醇等低级醇。
提取可以在常温下进行，也可以在加热下(例如，使用温水、热水等加热后的溶剂)进行。
此外，可以在溶剂中加入酶进行提取处理。通过加入酶，可以使果实的细胞组织破坏，由此可以进一步提高提取效率。作为酶，优选使用细胞组织浸解酶。作为这样的酶，可列举例如，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α‑淀粉酶、肌醇六磷酸酶。这些酶可以单独使用1种，也可以2种以上混合使用。
可以将使用上述提取溶剂获得的提取液直接使用，也可以蒸馏除去提取溶剂、根据需要干燥后再使用。
关于黄芩，迄今为止有作为毛乳头活化剂(日本特开平11‑240823)、透明质酸产生能力增强剂(日本特开平10‑95735)、防止紫外线皮肤免疫机能降低用免疫活化剂(日本特开平11‑71295)、抗炎剂(日本特开2006‑8536)、以及抗氧化剂(日本特开平5‑238925)使用的例子，但黄芩来源物具有PDGF‑BB产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们此次首次发现的。
[肌醇、肌醇磷酸]
肌醇被认为是维生素B的一种，已知其也可在生物体内由葡萄糖生物合成。肌醇在谷物、糠、豆、水果等植物中也含有。肌醇经常以其羟基被磷酸化的形态(肌醇磷酸)存在。在本发明中，也可以使用上述肌醇磷酸。本发明中使用的肌醇包括肌醇的各种立体异构体。作为肌醇的立体异构体，有顺‑肌醇(1，2，3，4，5，6/0‑肌醇)、表‑肌醇(1，2，3，4，5/6‑肌醇)、异‑肌醇(1，2，3，4/5，6‑肌醇)、肌‑肌醇(1，2，3，5/4，6‑肌醇、粘‑肌醇(1，2，4，5/3，6‑肌醇)、新‑肌醇(1，2，3/4，5，6‑肌醇)、手性肌醇(1，2，4/3，5，6‑肌醇)和青蟹肌醇(1，3，5/2，4，6‑肌醇)。作为肌醇磷酸，可列举肌醇的6个羟基中的任意1个或2个以上被磷酸化了的化合物。其中，优选作为肌醇的6个羟基全部被磷酸化了的化合物的肌醇六磷酸。本发明中使用的肌醇或肌醇磷酸优选来源于米糠。此外，肌醇磷酸的任意的盐也可以在本发明中使用。
根据本发明的某实施方式，肌醇和肌醇磷酸可以将单独的粉末溶解在培养基中适当稀释来使用。
肌醇和肌醇磷酸也可以通过与其它物质组合来提高PDGF‑BB产生增强作用。作为上述其它物质，可列举酵母提取物，可以使用例如，バイオダイン(注册商标)EMPP(Arch Personal Care Products L.P.公司制)。在使用该提取物的情况下，可以通过从提取物的干燥残分进行浓度转换，在培养基中添加0.1％左右的提取物使用。
关于肌醇和肌醇磷酸，迄今为止有作为含有肌醇的老化皮肤和/或受压皮肤用美容组合物(日本特表204‑501069)、含有肌醇磷酸(特别是肌醇六磷酸及其盐)的用于降低或预防脂肪性浮肿症状的化妆品组合物(日本特开平8‑253406)、以及皮肤保湿和/或皮肤保护和/或皮肤抗老化用的组合物(日本特开2010‑150258)使用的例子。此外，作为维生素B类，有作为含有维生素B2和B6的细胞活化用皮肤外用剂(日本特开平9‑241146)、含有维生素B的抗氧化剂(日本特开平7‑277939和日本特开205306831等)使用的例子。然而，维生素B类或肌醇或肌醇磷酸具有PDGF‑BB产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们此次首次发现的。
[PDGF‑BB产生增强剂、间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂]
本发明的PDGF‑BB产生增强剂含有选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的1种或2种以上成分作为有效成分。此外，本发明的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂含有包含上述有效成分的本发明的PDGF‑BB产生增强剂。本发明的PDGF‑BB产生增强剂、间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂(以下有时将它们总称为“本发明的制剂”。)可以单独含有上述有效成分的任意1种，也可以以任意的组合和比率含有上述有效成分的任意2种以上。
如上所述，根据本发明者们的认识，PDGF‑BB由于参与间充质系干细胞的局部化，增强血管内皮细胞中的PDGF‑BB的产生，因此可以实现间充质系干细胞的产生增强和稳定化(日本特愿2010‑209705)。即，本发明的PDGF‑BB产生增强剂能够极其有效地用于间充质系干细胞的产生增强和稳定化的目标。
此外，如上所述可知，间充质系干细胞的产生增强和稳定化在血管的稳定化、组织稳态的维持、损伤组织的修复和/或再生(特别是真皮的再生)、抗纤维化、多发性硬化症和/或糖尿病等各种疾病的预防和/或治疗、基于代谢综合征等慢性炎症的各种状态的预防和/或改善等用途中是极其有效的。因此，使用了本发明的PDGF‑BB产生增强剂的本发明的间充质系干细胞产生促进剂和干细胞稳定剂可以极其有效地用于这些用途。
本发明的制剂也可以是将上述有效成分与1种或2种以上其它成分例如赋形剂、载体和/或稀释剂等组合而成的组合物。组合物的组成、形态是任意的，只要根据有效成分、用途等条件适当选择即可。该组合物可以根据其剂型按照与赋形剂、载体和/或稀释剂等、以及其它成分适当组合的处方，使用常规方法来制造。
本发明的制剂可以配合在各种饮食品、饲料(宠物食品等)中使人和动物摄取。此外，也可以配合在化妆品等中用于人和动物，或作为医药制剂向人和动物给药。
具体而言，在将本发明的制剂配合在饮食品、饲料等中的情况下，植物体或其提取物的配合量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适当确定。例如，可以配合使得成人每天的植物或其提取物的摄取量在余甘子(amla)提取物的情况下为0.5mg～1g左右(干燥残分)，在越桔提取物的情况下为0.5mg～3g左右。特别是在作为保健用饮食品等利用的情况下，为了充分发挥本发明的有效成分产生的规定效果，优选含有使得成人每天摄取量在余甘子提取物的情况下为10mg～500mg(干燥残分)，在越桔提取物的情况下为10mg～1.5g(干燥残分)。
作为饮食品、饲料的形态，可以是任意的形态，可以成型为例如颗粒状、粒状、糊状、凝胶状、固体状或液体状。这些形态中可以适当含有允许在饮食品等中含有的公知的各种物质，例如，粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、pH值调节剂等赋形剂。
在将本发明的制剂应用于化妆品的情况下，植物体或其提取物的配合量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适当确定。例如，在化妆品总量中，可以分别配合余甘子提取物、越桔提取物各0.00001％～50％(干燥质量换算)，其中，优选0.0001％～5％(干燥质量换算)。
除了上述成分以外，可以进一步根据需要在不损害本发明效果的范围内，根据需要适当配合通常在化妆品、药品等皮肤外用剂中使用的成分，例如抗氧化剂、油分、紫外线防御剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色料、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
此外，也可以适当配合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属离子螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂、咖啡因、单宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜的果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类等。
此外，该皮肤外用剂可以在适用于外皮的化妆品、准药品等、特别优选为化妆品中广泛应用。其剂型只要可以应用于皮肤即可，可应用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水‑油二层系、水‑油‑粉末三层系、软膏、化妆水、凝胶、气雾剂等任意的剂型。
在将本发明的制剂作为化妆品使用的情况下，优选作为化妆水、乳液、粉底、口红、唇膏、清洁霜、按摩霜、面膜、护手霜、护手粉、体用香波、身体乳液、体用润肤霜、浴用化妆品等形态使用，此时，也可以适当配合制成这些形态时通常添加、配合的成分，例如保湿剂、香料、增溶剂、稳定剂、紫外线吸收剂、紫外线散射剂等成分。
在将本发明的制剂作为外用剂应用的情况下，植物体或其提取物的配合量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适当确定。例如，在化妆品总量中优选为0.00001％～50％(干燥质量换算)，在其它的饮食品中优选为0.0001％～5％(干燥质量换算)。
在将本发明的制剂作为准药品使用的情况下，该制剂可口服或非口服(静脉给药、腹腔内给药等)地适当使用。剂型也是任意的，例如可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等口服用固体制剂、内服液剂、糖浆剂等口服用液体制剂或注射剂等非口服用液体制剂等，这些形态均可通过公知的方法来适当调制。这些医药制剂中可以适当使用通常使用的粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、pH值调节剂等赋形剂。
在是外用剂的情况下，可以广泛应用于各种软膏剂等形态，但优选作为洗剂、悬浮剂和/或乳剂、液剂、软膏剂、贴剂等形态使用。另外，本发明的制剂可采用的形态不限于这些剂型和形态。
关于给药本发明的制剂时的间充质系干细胞中的PDGF‑BB基因的表达，例如可以通过测定PDGF‑BB的量来确定表达量从而进行评价。优选地，该测定可以利用对PDGF‑BB为特异性的抗体，通过本领域中公知的方法，例如利用荧光物质、色素、酶等的免疫染色法、蛋白质印迹(Western blotting)法、免疫测定方法例如ELISA法、RIA法等各种方法来进行。此外，例如，还可以通过提取间充质系干细胞中的总RNA，测定编码PDGF‑B的mRNA的量来确定表达量，从而进行评价。mRNA的提取、其量的测定在本领域中也是公知的，例如，RNA的定量可通过定量聚合酶链反应(PCR)法、例如实时聚合酶链反应(RT‑PCR)进行。适合RT‑PCR的引物可以通过本领域技术人员公知的方法来选定。
实施例
接下来，通过实施例更详细地说明本发明。另外，本发明不限于此。
[评价对象样品]
使用以下样品作为PDGF‑BB的产生增强作用的评价对象样品。
·肌醇：
将市售的肌醇粉末(和光纯药工业社制：肌‑肌醇)溶解在PBS中，然后以相对于后述的培养基为10ppm的量使用。
·肌醇六磷酸：
将市售的肌醇六磷酸(ナカライテスク社制：50％水溶液)以相对于后述的培养基为10ppm的量使用。
·黄芩提取物：
使用将黄芩的除去了周皮后的根用70体积％乙醇(水与乙醇的体积比例3∶7的混合液)提取得到的提取物。提取物干燥保存，在就要使用之间加入70体积％乙醇使其溶解，然后以相对于后述的培养基(以提取物的干燥重量换算)为15ppm的量使用。
·越桔CRS(细胞释放系统，cell release system)：
使用在将越桔的叶用细胞分解酶(マセロチ一ムA)处理后的细胞悬浮液中加入1，3‑BG 40体积％而得的悬浮液。悬浮液作为液体保存，以相对于后述的培养基(以提取物的干燥重量换算)为30ppm的量使用。
·莽吉柿树皮提取物：
使用将莽吉柿的树皮用70体积％的1，3‑BG(水与1，3‑BG的体积比例3∶7的混合液)提取而得的提取物。提取物干燥保存，在就要使用前加入70体积％的1，3‑BG使其溶解，然后以相对于后述的培养基(以提取物的干燥重量换算)为10ppm的量使用。
[血管内皮细胞中的PDGF‑BB的产生增强作用的评价]
将人血管内皮细胞HUVEC用EGM‑2培养基(三光纯药)传代培养，将传代第4代的细胞悬浮在不含VEGF‑A的Humedia‑EG2培养基(クラボウ)中，在涂有胶原的24孔多孔板(旭硝子)中以20,000个的比例接种，在5％CO2存在下，在37℃下培养3～5天直到细胞达到密集。以上述浓度添加上述各样品，或者交换成添加了用于溶解各评价对象样品的溶剂的Humedia‑EG2培养基(クラボウ)，然后再培养2天。使用RNA提取试剂MagNA Pure LC mRNA HS Kit(Roche)和自动核酸提取装置MagNA Pure LC 1.0Instrument(Roche)，依照所提供的方案从培养后的细胞中提取、纯化mRNA。对于各样品，以相同容量的mRNA作为模板，使用后述的序列号1和2的引物对、反应试剂QuantiFast SYBR Green RT‑PCR Kit(Qiagen)和反应装置LightCycler(Roche)，进行PDGF‑B基因的一步法定量实时(RT)‑PCR。组成条件依照Qiagen的方案。此外，RT‑PCR的条件是，RT反应在50℃下进行20分钟，初始变性在95℃下进行15分钟，变性在94℃下进行15秒，退火在60℃下进行20秒，延伸在72℃下进行30秒。另外，G3PDH作为内标使用(序列号3和4的引物对)，使用该内标来校正对照组的mRNA量。
PDGF‑B：
正向引物：5’‑CCTGGCATGCAAGTGTGA‑3’(序列号1)
反向引物：5’‑CCAATGGTCACCCGATTT‑3’(序列号2)
G3PDH：
正向引物：5’‑GCACCGTCAAGGCTGAGAAC‑3’(序列号3)
反向引物：5’‑ATGGTGGTGAAGACGCCAGT‑3’(序列号4)
[评价结果]
按照上述评价步骤，将由上述各样品获得的PDGF‑BB的mRNA的表达量相对于由对照(用于溶解各评价对象样品的溶剂)获得的表达量的比示于下表。由以下结果可知，这些成分具有使PDGF‑BB表达增强的活性。
[表1]

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102971415 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102971415 A *CN102971415A* (21)申请号 201180001106.8 (22)申请日 2011.07.01 C12N 5/0775(2006.01) A23L 1/30(2006.01) A61K 31/047(2006.01) A61K 31/661(2006.01) A61K 36/18(2006.01) A61K 36/53(2006.01) A61P 17/02(2006.01) (71)申请人株式会社资生堂地址日本东京都 (72)发明人相马勤饭野雅。

2、人山西治代 (74)专利代理机构北京市中咨律师事务所 11247 代理人段承恩田欣 (54) 发明名称血小板源性生长因子 -BB 产生增强剂、以及包含该增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂 (57) 摘要本发明提供能够有效地增强有助于间充质系干细胞的产生促进和 / 或干细胞稳定化的血小板源性生长因子 -BB(PDGF-BB) 的产生的新的制剂。本发明提供一种 PDGF-BB 产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的 1 种或 2 种以上作为有效成分。 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.0。

3、8.15 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2011/065207 2011.07.01 (87)PCT申请的公布数据 WO2013/005281 JA 2013.01.10 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 10 页序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 10 页序列表 2 页 1/1 页 2 1.一种血小板源性生长因子-BB即PDGF-BB产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的 1 种或 2 种以上作为有效成分。 2.根据权利要求1所述的PDGF-。

4、BB产生增强剂，其在包含肌醇或肌醇磷酸的同时，还包含酵母提取物。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的 PDGF-BB 产生增强剂，其中，肌醇或肌醇磷酸来源于米糠。 4. 一种间充质系干细胞产生促进剂，其中，包含权利要求 1 3 的任一项所述的 PDGF-BB 产生增强剂。 5. 一种干细胞稳定剂，其中，包含权利要求 1 3 的任一项所述的 PDGF-BB 产生增强剂。 6. 一种真皮再生剂，其中，包含权利要求 1 3 的任一项所述的 PDGF-BB 产生增强剂。权利要求书 CN 102971415 A 2 1/10 页 3 血小板源性生长因子 -BB 产。

5、生增强剂、以及包含该增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂技术领域 0001 本发明涉及血小板源性生长因子 -BB(PDGF-BB) 产生增强剂、以及包含该 PDGF-BB 产生增强剂的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂。背景技术 0002 干细胞是兼有产生分化成多种细胞的细胞的多分化能力和通过细胞分裂产生与该细胞相同的细胞的自我复制能力这 2 种性质的细胞。来源于作为受精卵的早期发育阶段的胚的干细胞被称为胚性干细胞 (ES 细胞 )。虽然人 ES 细胞可期待用于再生医疗，但是由于利用受精卵这样的伦理上的问题，因此不允许制作新的人。

6、ES 细胞。 0003 近年来，作为具有类似于 ES 细胞的性质的细胞，人工多能性干细胞 (iPS 细胞 ) 也受到关注。然而，从细胞的癌化、制作效率等观点出发， iPS 细胞的制作存在大量问题。另一方面，由于具有分化成特定组织的能力的体性干细胞可从患者自身的身体组织例如骨髓得到，因此不存在像胚性干细胞那样的伦理上的问题。 0004 在皮肤中，在表皮基底层存在表皮干细胞 ( 非专利文献 1) 是众所周知的，而且报告了在被称为毛囊隆突区(bulge region)的区域存在毛囊上皮干细胞(非专利文献2)、皮肤色素干细胞(非专利文献3)。另一方面，在真皮中，在以胶。

7、原为主体的纤维成分中存在呈细长的纺锤形的成纤维细胞，但是在真皮的成纤维细胞中是否存在干细胞还不清楚。此外，虽然已知真皮中存在分化成脂肪、神经胶质、软骨、肌肉等多个细胞系的皮肤源性前体细胞 (skin-derived precursors ： SKP)(非专利文献4)，但是真皮成纤维细胞与SKP之间的关系还不清楚。 0005 由于作为成纤维细胞的前体细胞而从骨髓被分离出的间充质系干细胞 ( 非专利文献 5) 分化成属于间充质系的各种细胞 ( 骨细胞、肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等 )，因此可期待应用于骨、血管、肌肉的重建等再生医疗。最近，具有间充质系组。

8、织的组织大量存在的可能性明确起来，从脂肪、脐带血、胎盘等中也都分离出了间充质系干细胞 ( 非专利文献 6 8)。 0006 根据近年来的认识可知，间充质系干细胞作为血管周细胞 (pericyte) 存在于全身血管中，在血管稳定化、组织稳态维持方面发挥作用 ( 非专利文献 9 和 10)。 0007 此外，如果在组织损伤部位或其附近血管被破坏，则作为血管周细胞 (pericyte) 的间充质系干细胞从血管脱离并增殖，在供给丧失的细胞 ( 非专利文献 11 14) 的同时，释放出具有生物活性的因子以保护组织 ( 非专利文献 15 19)，在损伤后的组织的修复、再生中发。

9、挥作用。这些分泌因子除了具有血管形成、抗细胞凋亡的作用以外，还被报告了具有有力抑制免疫的作用 ( 非专利文献 21 和 22)、抑制 T 细胞、 B 细胞介导的损伤组织的破坏 ( 非专利文献 9 和 22)。 0008 此外已知，间充质系干细胞也显示抗纤维化的作用(非专利文献23和24)、和/或说明书 CN 102971415 A 3 2/10 页 4 对多发性硬化症、糖尿病的效果 ( 非专利文献 9)。 0009 另一方面，逐步明确了慢性炎症是在各种疾病 ( 例如代谢综合征、动脉硬化性疾病、癌、神经变性疾病、自身免疫疾病等 ) 中共有的基本病态 ( 非专利文。

10、献 25)。例如，报告了由慢性炎症诱导了内皮细胞功能障碍、胰岛素抵抗，从而成为糖尿病、动脉硬化性疾病等各种疾病的原因(非专利文献26)。进而也明确了，肥胖的脂肪组织本身会导致向炎症性变化(非专利文献2729)。由于慢性炎症在血管周围发生，因此认为在慢性炎症中，作为血管周细胞 (pericyte) 的间充质系干细胞与血管的相互作用也发生了障碍。 0010 基于以上认识可以认为，如果能够实现间充质系干细胞的产生促进和 / 或稳定化，则在血管稳定化、组织稳态维持、损伤组织的修复和 / 或再生、抗纤维化、多发性硬化症、糖尿病等各种疾病的预防和 / 或治疗、。

11、基于代谢综合征等慢性炎症的各种状态的预防和 / 或改善等各种用途中是极其有效的。 0011 本发明者们报告了在真皮中也存在间充质系干细胞，确立了从真皮高效地分离间充质系干细胞的方法 ( 日本特愿 2009-213291)。如果考虑上述的间充质系干细胞的作用，则认为通过实现真皮中的间充质系干细胞的稳定化和 / 或产生增强，从而在真皮的状态改善和 / 或再生等中也是有效的。 0012 此外，本发明者们在更详细地明确在真皮、皮下脂肪中的间充质系干细胞的存在部位的同时，发现血小板源性生长因子 -BB(PDGF-BB) 参与间充质系干细胞的局部化，进而明确了血管内皮细胞中的 PD。

12、GF-BB 的产生增强有助于间充质系干细胞的产生增强和稳定化 ( 日本特愿 2010-209705)。 0013 血小板源性生长因子 (PDGF) 是参与成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等间充质系干细胞的迁移和增殖等调节的生长因子，是由上皮细胞、内皮细胞等各种细胞产生的。 PDGF中存在PDGF-A、 PDGF-B、 PDGF-C和PDGF-D至少4种，但通过A链和B链形成二硫键而得到同源二聚体或异源二聚体结构，从而具有 3 种异构体 (PDGF-AA、 PDGF-AB、 PDGF-BB)。已知 PDGF 介由作为酪氨酸激酶偶联型的 PDGF 受体 (PDGFR) 表。

13、现其生理作用。PDGF-B 的基因是公知的，已被基因克隆 ( 非专利文献 30)。 0014 认为如果能够发现对上述 PDGF-BB 的产生增强有效的成分，则可以使用该成分来实现间充质系干细胞的产生促进和 / 或干细胞的稳定化，进而可以在上述各种用途等中有效地使用。 0015 非专利文献 1 ： Watt FM， J Dermatol Sci， 28 ： 173-180， 2002 0016 非专利文献 2 ： Cotsarelis G et al.， Cell， 57 ： 201-209， 1989 0017 非专利文献 3 ： Nishimura EK et al.， Natu。

14、re， 416 ： 854-860， 2002 0018 非专利文献 4 ： Wong CE al.， J Cell Biol， 175 ： 1005-1015， 2006 0019 非专利文献 5 ： Pittenger MF et al.， Science， 284 ： 143-147， 1999 0020 非专利文献 6 ： Park KW et al.， Cell Metab， 8 ： 454-457， 2008 0021 非专利文献 7 ： Flynn A et al.， Cytotherapy， 9 ： 717-726， 2007 0022 非专利文献 8 ： Igura K et。

15、 al.， Cytotherapy， 6 ： 543-553， 2004 0023 非专利文献 9 ： da Silva Meirelles L et al.， Stem Cells， 2008Sep ； 26(9) ： 2287-2299 0024 非专利文献 10 ： da Silva Meirelles L et al.， J Cell Sci， 2006 ； 119 ：说明书 CN 102971415 A 4 3/10 页 5 2204-2213 0025 非专利文献 11 ： Dai WD et al.， Circulation， 2005 ； 112 ： 214-22。

16、3 0026 非专利文献 12 ： Fazel S et al.， J Thorac Cardiovasc Surg， 2005 ； 130 ： 1310-1318 0027 非专利文献 13 ： Noiseux N et al.， Mol Ther， 2006 ； 14 ： 840-850 0028 非专利文献 14 ： Zhao LR et al.， Exp Neurol， 2002 ； 174 ： 11-20 0029 非专利文献 15 ： Gnecchi M et al.， Nat Med， 2005 ； 11 ： 367-368 0030 非专利文献 16 ： Kinnair。

17、d T et al.， Circ Res， 2004 ； 94 ： 678-685 0031 非专利文献 17 ： Kinnaird T et al.， Circulation， 2004 ； 109 ： 1543-1549 0032 非专利文献 18 ： Tang YL et al.， Ann Thorac Surg， 2005 ； 80 ： 229-237 0033 非专利文献 19 ： Zhang M et al.， FASEB J， 2007 ； 21 ： 3197-3207 0034 非专利文献 20 ： Le Blanc K et al.， J Intern Med， 2007 ；。

18、 262 ： 509-525 0035 非专利文献 21 ： Uccelli A et al.， Trends Immunol， 2007 ； 28 ： 219-226 0036 非专利文献 22 ： Caplan AI et al.， J Cell Biochem， 2006 ； 98 ： 1076-1084 0037 非专利文献 23 ： Fang BJ et al.， Transplantation， 2004 ； 78 ： 83-88 0038 非专利文献24 ： Ortiz LA et al.， Proc Natl Acad Sci USA， 2003 ； 100 ： 8407-84。

19、1 0039 非专利文献 25 ：小川佳宏，实验医学， 28 ： 1680-1687， 2010 0040 非专利文献 26 ： Medzhitov R， Nature， 454 ： 428-35， 2008 0041 非专利文献 27 ： Hotamisligil GS， Nature， 444(7121) ： 860-7， 2006 0042 非专利文献 28 ： Wellen KE et al.， J Clin Invest， 115(5) ： 1111-9， 2005 0043 非专利文献 29 ：菅波孝祥他，实验医学， 28 ： 1717-1723， 2010 0044 非专。

20、利文献 30 ： Dalla-Favera R et al.， Nature， 292 ： 31-35， 1981 发明内容 0045 发明所要解决的课题 0046 本发明是鉴于上述背景而提出的，其课题是提供对 PDGF-BB 的产生增强有效的制剂，并且使用该制剂来提供对间充质系干细胞的产生促进和 / 或其稳定化有效的制剂。 0047 用于解决课题的方法 0048 本发明者们对多种材料进行了反复研究，从而筛选使 PDGF-BB 的产生增强的药剂，结果发现，越桔、莽吉柿和黄芩的各植物来源物、以及肌醇和肌醇磷酸分别显示显著的 PDGF-BB 产生增强作用，从而完成了本发明。 0。

21、049 因此，本申请包括下述发明： 0050 1. 一种血小板源性生长因子 -BB(PDGF-BB) 产生增强剂，其包含选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的 1 种或 2 种以上成分作为有效成分。 0051 2.根据1所述的PDGF-BB产生增强剂，其在包含肌醇的同时，还包含酵母提取物。 0052 3.根据1或2所述的PDGF-BB产生增强剂，其中，肌醇是来源于米糠的肌醇磷酸。 0053 4. 一种间充质系干细胞产生促进剂，其包含 1 3 的任一项所述的说明书 CN 102971415 A 5 4/10 页 6 PDGF-BB 产生增强。

22、剂。 0054 5.一种干细胞稳定剂，其包含13的任一项所述的PDGF-BB产生增强剂。 0055 6. 一种真皮再生剂，其包含 1 3 的任一项所述的 PDGF-BB 产生增强剂。 0056 发明的效果 0057 根据本发明，提供对 PDGF-BB 的产生增强有效的制剂，并且通过使用该制剂来提供对间充质系干细胞的产生促进和 / 或稳定化等有效的制剂。具体实施方式 0058 越桔来源物 0059 越桔 ( 学名： Vaccinium vitis-idaea L.) 是杜鹃花科越桔属的植物。在本发明中，作为越桔来源物，可以使用将越桔的花、花穗、果穗、果皮、果实、茎、。

23、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得到的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得到的物质，或粉碎后通过酶处理、机械处理等处理进行分解而得到的物质。 0060 在对越桔进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是可在提取中使用的溶剂即可，可以任意地使用，可以分别单独使用或组合使用例如水、甲醇、乙醇、丙二醇、 1， 3- 丁二醇、甘油等醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。 0061 提取可以在常温下进行，也可以在加热下 ( 例如使用温水、热水等加热后的溶剂 ) 进行。 0062 可以直接使用以上述溶剂提取。

24、得到的提取液或者浓缩后的提取物，或者也可以使用将这些提取物使用吸附法例如离子交换树脂除去杂质后的物质，和 / 或采用多孔聚合物 ( 例如一 XAD-2) 的柱进行吸附后再用甲醇或乙醇溶出、浓缩而得的物质。此外，也可以使用通过公知的分配法 ( 例如使用水 / 乙酸乙酯等的分配法 ) 提取而得的提取物等。 0063 在对越桔进行分解的情况下，可以进行能够选择性地分解细胞间质且维持细胞形态的 “单细胞化处理” 。可以将例如日本特开 2002-193734 中记载的方法作为参考。具体是指下述处理：对于植物，通过酶解和 / 或机械分解等在几乎不分解细胞壁的情况下选择性地分解或。

25、破坏细胞间质，将对象物以维持细胞形态的状态分解成细胞单元，制成粥状、液体组合物或冷冻干燥品。为了进行上述选择性分解，可以使用酶处理。例如，可以使用通过通常公知的方法从根霉属 (Rizopus)、曲霉属 (Aspergillus) 等的酶原料中分离或分离纯化而得的酶，此外，也可以使用市售品。在使这些单细胞化酶作用于越桔的情况下，优选在所用的酶的最适温度和最适 pH 值等最适条件下使其作用，并且使用必要最少量。这里，单细胞化酶的最适温度为 30 45，最适 pH 值为 4 6。此外，在酶反应后成为残渣的部分例如可以通过使用 20 目左右的筛来除去，从而制成能。

26、够包含在本外用组合物中的越桔来源物。 0064 此外，除了上述的单细胞化植物的悬浮液以外，本发明中也可以使用通过离心分离等方法将该悬浮液脱水而获得的单细胞糊或其干燥品。 0065 关于越桔，迄今为止有作为含有单细胞化处理后的越桔的外用剂 ( 日本特开 2002-193734)、用于杀菌、抗菌和防止头皮屑的化妆品 ( 日本特开昭 61-238719)、弹性蛋白酶活性抑制剂 ( 日本特开 2002-363088)、活性酶清除剂 ( 日本特开 2002-363027)、说明书 CN 102971415 A 6 5/10 页 7 黑素生成抑制剂 ( 日本特开。

27、 2002-363057)、过氧化脂质生成抑制剂 ( 日本特开 2002-363089)、胶原酶活性抑制剂 ( 日本特开 2003-12531)、透明质酸酶活性抑制剂 ( 日本特开 2003-73287)、金属蛋白酶表达抑制剂 ( 日本特开 2002-193738)、抗糖化剂 ( 日本特表 2004-505007)、以及针对皮肤肥厚、皮肤硬化等皮肤损伤的抗皮肤损伤剂 ( 日本特开 2005-306850) 使用的例子，但越桔来源物具有 PDGF-BB 产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，。

28、这些作用是由本发明者们此次首次发现的。 0066 莽吉柿来源物 0067 莽吉柿 ( 学名： Garcinia mangostana) 是藤黄科藤黄属的植物。在本发明中，作为莽吉柿来源物，可以使用将莽吉柿的果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得的物质。 0068 在对莽吉柿进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是可在提取中使用的溶剂即可，可以任意使用，例如，可以通过用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇等低级醇或含水低级醇、丙二醇、 1， 3- 丁。

29、二醇等多元醇或含水多元醇、丙酮、乙酸乙酯等各种有机溶剂提取，再蒸馏除去溶剂而获得。 0069 提取可以在常温进行，也可以在加热下 ( 例如，使用温水、热水等加热后的溶剂 ) 进行。 0070 此外，可以在溶剂中加入酶进行提取处理。通过加入酶，可以使果实的细胞组织破坏，由此可以进一步提高提取效率。作为酶，优选使用细胞组织浸解酶。作为这样的酶，可列举例如，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、 - 淀粉酶、肌醇六磷酸酶。这些酶可以单独使用 1 种，也可以 2 种以上混合使用。 0071 可以将使用上述提取溶剂而获得的提取液直接使用，也可以蒸馏除去提取溶剂，根据。

30、需要干燥后再使用。 0072 关于莽吉柿，迄今为止有作为紫外线吸收剂 ( 日本特开平 9-87155)、 MMPs 抑制剂 ( 日本特开 2003-252745)、成纤维细胞活化剂 ( 日本特开 2006-249051) 使用的例子，而且，已知其具有呫吨酮衍生物的制造和胶原产生作用 ( 日本特开 2009-84169)，但莽吉柿来源物具有 PDGF-BB 产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们这次首次发现的。 0073 黄芩来源物 0074 黄芩 ( 学名： Scutellaria baical。

31、ensis Georgi， Labiatae) 是唇形科黄芩属的植物。在本发明中，作为黄芩来源物，可以使用将黄芩的果穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全植株粉碎后榨取而得到的物质，或粉碎后用溶剂等提取而得到的物质。 0075 在对黄芩进行提取的情况下，作为提取溶剂，只要是通常可在植物提取等中使用的溶剂即可，可以任意使用，可列举例如，水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等低级醇、丙二醇、 1， 3- 丁二醇等多元醇、或这些醇类的含水物、正己烷、甲苯等烃系溶剂等。这些溶剂可以分别单独使用或任意的二种以上组合。

32、使用。其中，优选使用甲醇和 / 或乙醇等低级醇。 0076 提取可以在常温下进行，也可以在加热下 ( 例如，使用温水、热水等加热后的溶剂 ) 进行。说明书 CN 102971415 A 7 6/10 页 8 0077 此外，可以在溶剂中加入酶进行提取处理。通过加入酶，可以使果实的细胞组织破坏，由此可以进一步提高提取效率。作为酶，优选使用细胞组织浸解酶。作为这样的酶，可列举例如，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、 - 淀粉酶、肌醇六磷酸酶。这些酶可以单独使用 1 种，也可以 2 种以上混合使用。 0078 可以将使用上述提取溶剂获得的提取液直接使用，也可。

33、以蒸馏除去提取溶剂、根据需要干燥后再使用。 0079 关于黄芩，迄今为止有作为毛乳头活化剂 ( 日本特开平 11-240823)、透明质酸产生能力增强剂(日本特开平10-95735)、防止紫外线皮肤免疫机能降低用免疫活化剂(日本特开平 11-71295)、抗炎剂 ( 日本特开 2006-8536)、以及抗氧化剂 ( 日本特开平 5-238925) 使用的例子，但黄芩来源物具有 PDGF-BB 产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们此次首次发现的。 0080 肌醇、肌醇磷酸 0081 肌。

34、醇被认为是维生素 B 的一种，已知其也可在生物体内由葡萄糖生物合成。肌醇在谷物、糠、豆、水果等植物中也含有。肌醇经常以其羟基被磷酸化的形态 ( 肌醇磷酸 ) 存在。在本发明中，也可以使用上述肌醇磷酸。本发明中使用的肌醇包括肌醇的各种立体异构体。作为肌醇的立体异构体，有顺 - 肌醇 (1， 2， 3， 4， 5， 6/0- 肌醇 )、表 - 肌醇 (1， 2， 3， 4， 5/6- 肌醇 )、异 - 肌醇 (1， 2， 3， 4/5， 6- 肌醇 )、肌 - 肌醇 (1， 2， 3， 5/4， 6- 肌醇、粘 - 肌醇 (1， 2， 4， 5/3， 6- 肌醇 )、新。

35、 - 肌醇 (1， 2， 3/4， 5， 6- 肌醇 )、手性肌醇 (1， 2， 4/3， 5， 6- 肌醇 ) 和青蟹肌醇 (1， 3， 5/2， 4， 6- 肌醇 )。作为肌醇磷酸，可列举肌醇的 6 个羟基中的任意 1 个或 2 个以上被磷酸化了的化合物。其中，优选作为肌醇的 6 个羟基全部被磷酸化了的化合物的肌醇六磷酸。本发明中使用的肌醇或肌醇磷酸优选来源于米糠。此外，肌醇磷酸的任意的盐也可以在本发明中使用。 0082 根据本发明的某实施方式，肌醇和肌醇磷酸可以将单独的粉末溶解在培养基中适当稀释来使用。 0083 肌醇和肌醇磷酸也可以通过与其它物质组合来提高 PDGF。

36、-BB 产生增强作用。作为上述其它物质，可列举酵母提取物，可以使用例如， ( 注册商标 )EMPP(Arch Personal Care Products L.P. 公司制 )。在使用该提取物的情况下，可以通过从提取物的干燥残分进行浓度转换，在培养基中添加 0.1左右的提取物使用。 0084 关于肌醇和肌醇磷酸，迄今为止有作为含有肌醇的老化皮肤和 / 或受压皮肤用美容组合物(日本特表204-501069)、含有肌醇磷酸(特别是肌醇六磷酸及其盐)的用于降低或预防脂肪性浮肿症状的化妆品组合物 ( 日本特开平 8-253406)、以及皮肤保湿和 / 或皮肤保护和 / 或皮肤抗。

37、老化用的组合物 ( 日本特开 2010-150258) 使用的例子。此外，作为维生素 B 类，有作为含有维生素 B2 和 B6 的细胞活化用皮肤外用剂 ( 日本特开平 9-241146)、含有维生素 B 的抗氧化剂 ( 日本特开平 7-277939 和日本特开 205306831 等 ) 使用的例子。然而，维生素B类或肌醇或肌醇磷酸具有PDGF-BB产生促进作用、间充质系干细胞产生促进作用、干细胞稳定化作用和真皮稳定化作用迄今为止还完全未知，这些作用是由本发明者们此次首次发现的。 0085 PDGF-BB 产生增强剂、间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生。

38、说明书 CN 102971415 A 8 7/10 页 9 剂 0086 本发明的 PDGF-BB 产生增强剂含有选自越桔来源物、莽吉柿来源物、黄芩来源物、肌醇和肌醇磷酸中的 1 种或 2 种以上成分作为有效成分。此外，本发明的间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂含有包含上述有效成分的本发明的 PDGF-BB 产生增强剂。本发明的 PDGF-BB 产生增强剂、间充质系干细胞产生促进剂、干细胞稳定剂和真皮再生剂 ( 以下有时将它们总称为 “本发明的制剂” 。) 可以单独含有上述有效成分的任意 1 种，也可以以任意的组合和比率含有上述有效成分的任意 2 种以。

39、上。 0087 如上所述，根据本发明者们的认识， PDGF-BB 由于参与间充质系干细胞的局部化，增强血管内皮细胞中的 PDGF-BB 的产生，因此可以实现间充质系干细胞的产生增强和稳定化 ( 日本特愿 2010-209705)。即，本发明的 PDGF-BB 产生增强剂能够极其有效地用于间充质系干细胞的产生增强和稳定化的目标。 0088 此外，如上所述可知，间充质系干细胞的产生增强和稳定化在血管的稳定化、组织稳态的维持、损伤组织的修复和 / 或再生 ( 特别是真皮的再生 )、抗纤维化、多发性硬化症和 / 或糖尿病等各种疾病的预防和 / 或治疗、基于代谢综合征等慢性。

40、炎症的各种状态的预防和 / 或改善等用途中是极其有效的。因此，使用了本发明的 PDGF-BB 产生增强剂的本发明的间充质系干细胞产生促进剂和干细胞稳定剂可以极其有效地用于这些用途。 0089 本发明的制剂也可以是将上述有效成分与 1 种或 2 种以上其它成分例如赋形剂、载体和 / 或稀释剂等组合而成的组合物。组合物的组成、形态是任意的，只要根据有效成分、用途等条件适当选择即可。该组合物可以根据其剂型按照与赋形剂、载体和 / 或稀释剂等、以及其它成分适当组合的处方，使用常规方法来制造。 0090 本发明的制剂可以配合在各种饮食品、饲料(宠物食品等)中使人和动物摄取。此。

41、外，也可以配合在化妆品等中用于人和动物，或作为医药制剂向人和动物给药。 0091 具体而言，在将本发明的制剂配合在饮食品、饲料等中的情况下，植物体或其提取物的配合量 ( 干燥质量 ) 可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适当确定。例如，可以配合使得成人每天的植物或其提取物的摄取量在余甘子 (amla) 提取物的情况下为 0.5mg 1g 左右 ( 干燥残分 )，在越桔提取物的情况下为 0.5mg 3g 左右。特别是在作为保健用饮食品等利用的情况下，为了充分发挥本发明的有效成分产生的规定效果，优选含有使得成人每天摄取量在余甘子提取物的情况下为10mg500m。

42、g(干燥残分)，在越桔提取物的情况下为 10mg 1.5g( 干燥残分 )。 0092 作为饮食品、饲料的形态，可以是任意的形态，可以成型为例如颗粒状、粒状、糊状、凝胶状、固体状或液体状。这些形态中可以适当含有允许在饮食品等中含有的公知的各种物质，例如，粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、 pH 值调节剂等赋形剂。 0093 在将本发明的制剂应用于化妆品的情况下，植物体或其提取物的配合量 ( 干燥质量 ) 可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适当确定。

43、。例如，在化妆品总量中，可以分别配合余甘子提取物、越桔提取物各 0.00001 50 ( 干燥质量换算 )，其中，优选 0.0001 5 ( 干燥质量换算 )。 0094 除了上述成分以外，可以进一步根据需要在不损害本发明效果的范围内，根据需要适当配合通常在化妆品、药品等皮肤外用剂中使用的成分，例如抗氧化剂、油分、紫外线说明书 CN 102971415 A 9 8/10 页 10 防御剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色料、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。 0095 此外，也可以适当配合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、。

44、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属离子螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂、咖啡因、单宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜的果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素 C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类等。 0096 此外，该皮肤外用剂可以在适用于外皮的化妆品、准药品等、特别优选为化妆品中广泛应用。其剂型只要可以应用于皮肤即可，可应用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水。

45、- 油二层系、水 - 油 - 粉末三层系、软膏、化妆水、凝胶、气雾剂等任意的剂型。 0097 在将本发明的制剂作为化妆品使用的情况下，优选作为化妆水、乳液、粉底、口红、唇膏、清洁霜、按摩霜、面膜、护手霜、护手粉、体用香波、身体乳液、体用润肤霜、浴用化妆品等形态使用，此时，也可以适当配合制成这些形态时通常添加、配合的成分，例如保湿剂、香料、增溶剂、稳定剂、紫外线吸收剂、紫外线散射剂等成分。 0098 在将本发明的制剂作为外用剂应用的情况下，植物体或其提取物的配合量 ( 干燥质量 ) 可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等适。

46、当确定。例如，在化妆品总量中优选为0.0000150(干燥质量换算)，在其它的饮食品中优选为0.00015(干燥质量换算 )。 0099 在将本发明的制剂作为准药品使用的情况下，该制剂可口服或非口服 ( 静脉给药、腹腔内给药等 ) 地适当使用。剂型也是任意的，例如可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等口服用固体制剂、内服液剂、糖浆剂等口服用液体制剂或注射剂等非口服用液体制剂等，这些形态均可通过公知的方法来适当调制。这些医药制剂中可以适当使用通常使用的粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂。

47、、等渗剂、稳定剂、 pH 值调节剂等赋形剂。 0100 在是外用剂的情况下，可以广泛应用于各种软膏剂等形态，但优选作为洗剂、悬浮剂和 / 或乳剂、液剂、软膏剂、贴剂等形态使用。另外，本发明的制剂可采用的形态不限于这些剂型和形态。 0101 关于给药本发明的制剂时的间充质系干细胞中的 PDGF-BB 基因的表达，例如可以通过测定 PDGF-BB 的量来确定表达量从而进行评价。优选地，该测定可以利用对 PDGF-BB 为特异性的抗体，通过本领域中公知的方法，例如利用荧光物质、色素、酶等的免疫染色法、蛋白质印迹 (Western blotting) 法、免疫测。

48、定方法例如 ELISA 法、 RIA 法等各种方法来进行。此外，例如，还可以通过提取间充质系干细胞中的总 RNA，测定编码 PDGF-B 的 mRNA 的量来确定表达量，从而进行评价。mRNA 的提取、其量的测定在本领域中也是公知的，例如， RNA 的定量可通过定量聚合酶链反应 (PCR) 法、例如实时聚合酶链反应 (RT-PCR) 进行。适合 RT-PCR 的引物可以通过本领域技术人员公知的方法来选定。 0102 实施例 0103 接下来，通过实施例更详细地说明本发明。另外，本发明不限于此。 0104 评价对象样品 0105 使用以下样品作为 PDGF-BB 的产生增强作用的评价对象样品。说明书 CN 102971415 A 10 9/10 页 11 0106 肌醇： 0107 将市售的肌醇粉末 ( 和光纯药工业社制：肌 - 肌醇 ) 溶解在 PBS 中，然后以相对于后述的培养基为 10ppm 的量使用。 0108 肌醇六磷酸： 0109 将市售的肌醇六磷酸 ( 社制： 50水溶液 ) 以相对于后述的培养基为 10ppm 的量使用。 0110 黄芩提取物： 0111 使用将黄芩的除去了周皮后的根用 70 体积乙醇 ( 水与乙醇的体积比例 3 。

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