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1、(10)申请公布号 CN 102978196 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978196 A *CN102978196A* (21)申请号 201210498996.4 (22)申请日 2012.11.29 C12N 15/10(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑 路 1 号 (72)发明人 杨家新 杨江华 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 一种轮虫总 RNA 和总蛋白提取方法 (57) 摘要 本发明涉及一种提取轮。
2、虫总 RNA 和总蛋白的 方法。方法包括一种淡水轮虫、 轮虫通用培养液、 食物微藻及其培养液、 微孔筛网， 解剖镜、 低温冰 箱、 细胞破碎仪、 低温离心机， 充气泵、 PVP、 PBS 磷 酸缓冲液和 RNA 提取常规试剂 （包括 TRIZOL， 氯 仿， 异丙醇， DEPC 水， 乙醇） 。轮虫为单个体克隆培 养获得、 人工配制液体培养基培养、 食物微藻为淡 水微绿球藻、 PBS 磷酸缓冲液 pH=7.0。采用恒温、 充气、 持续光照方法， 快速获得大量轮虫， 除去微 藻， 富集活体轮虫进行总RNA和总蛋白的提取。 该 方法能方便， 快速， 经济的收集到大量的轮虫， 用 于分子生物学研究，。
3、 并能有效的消除微藻的影响， 适合实验室研究应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种轮虫总 RNA 和总蛋白提取的方法， 其特征包括以下步骤 ： （1） 轮虫培养 （2） 微藻去除 ： 将轮虫培养液装入 50ml 离心管中， 4500rpm， 4离心 5 分钟， 微藻沉积 在离心管底部， 倒出含有轮虫的上清， 本步骤重复 2-3 次直到藻类全部除去 ； （3） 轮虫富集 ： 将 300 目的筛网折成漏斗状， 架于烧杯上。
4、， 用胶头滴管吸取去除微藻的 轮虫培养液， 滴入筛网底部， 滤去水分， 之后用双蒸水冲洗数次， 在解剖镜下用 10-100ml 移 液枪将轮虫吸到 1.5ml 离心管中 ； （3） 冰冻 ： 在超净台下， 将轮虫转移到无 RNA 酶的离心管中， 加 1mlTRIZOL， 上下颠倒数 次， 混匀后将离心管放入 -80冰箱中， 使其完全结冰 ； （4） 总 RNA 提取 ： 将加 TRIZOL 的提取液室温融化， 12000 转 4离心 5min ； 吸取上清移 入新的 1.5ml 离心管中， 加入氯仿， 剧烈震荡 15s， 充分乳化后室温静置 5min， 12000 转 4 离心 15min ；。
5、 从离心机中取出， 离心管中分三层， 吸取上清移入新的 1.5ml 离心管中， 加入等 体积的异丙醇， 上下颠倒混匀后在 15-30下静置 10min， 12000 转 4离心 10min， 弃上清， 缓慢加入75%乙醇1ml， 上下颠倒， 12000转4离心5min， 去除乙醇， 室温干燥2-5min， 加入 26ulDEPC 水， -70保存 ； （5） 细胞破碎 ： 向步骤 3 离心管中加入 3ml 1%PVP， 震荡混匀， 超声破碎 10-20 次， 功率 300W， 破碎持续时间 2S， 间隔 5S ； 该步骤操作均在冰上进行 ； （6） 总蛋白提取 ： 破碎后 4000 转， 4离。
6、心 10 分钟， 取上清。 权 利 要 求 书 CN 102978196 A 2 1/5 页 3 一种轮虫总 RNA 和总蛋白提取方法 技术领域 0001 本发明属于水产学科生物技术领域， 具体是涉及一种提取水生浮游动物轮虫总蛋 白和总 RNA 的方法。 背景技术 0002 轮虫 （rotifer） 是淡水生态系统主要功能群， 90% 以上鱼类早期开口生物饵料， 也 是环境污染和环境风险评价受试动物。总蛋白和总 RNA 的提取是进行分子生物学研究的基 础。由于轮虫个体小， 游动快速， 难以富集足够量的活体轮虫进行分子生物学的研究。本发 明具有所需设备简单、 操作简便的特点。 发明内容 0003。
7、 本发明的目的是提供一种提取轮虫总 RNA 和总蛋白的方法。 0004 所提供方法包括轮虫通用培养液配制、 饵料微藻培养液配制、 活体轮虫富集技术、 微藻去除方法、 总 RNA 释放方法、 超声破碎方法。 0005 本发明所述轮虫总蛋白和总 RNA 提取方法， 包括以下步骤 ： 0006 （1） 轮虫培养 ； 0007 （2） 微藻去除 ： 将轮虫培养液装入 50ml 离心管中， 4500rpm， 4离心 5 分钟， 微藻 沉在离心管底部， 小心倒出含有轮虫的上清， 本步骤可重复 2-3 次直到藻类全部除去 ； 0008 （3） 轮虫富集 ： 将 300 目的筛网折成漏斗状， 架于烧杯上， 用。
8、胶头滴管吸取去除微 藻的轮虫培养液， 缓慢的滴入筛网底部， 滤去水分， 之后用双蒸水冲洗数次， 在解剖镜下用 10-100ml 移液枪将轮虫吸到 1.5ml 离心管中 ； 0009 （4） 冰冻 ： 在超净台下， 将轮虫转移到无 RNA 酶的离心管中， 加 1mlTRIZOL， 上下颠 倒数次， 混匀后将离心管放入 -20冰箱中， 使其完全结冰 ； 0010 （5） 总 RNA 提取 ： 将加 TRIZOL 的提取液室温融化， 12000 转 4离心 5min ； 小心吸 取上清移入新的 1.5ml 离心管中， 约 750ul， 加入 150ul 的氯仿 （上清体积的 1/5） ， 用手剧烈 。
9、的震荡 15s， 充分乳化后室温静置 5min， 12000 转 4离心 15min ； 小心从离心机中取出， 分 三层 （无色上清， 中间层白色 DNA， 带颜色的下层是有机相蛋白质） ， 小心吸取上清移入新的 1.5ml 离心管中， 加入等体积的异丙醇， 上下颠倒混匀后在 15-30下静置 10min （期间配制 75%乙醇焦碳酸二乙酯 （DEPC） 水配制， 12000转4离心10min， 弃上清， 缓慢加入75%乙 醇 1ml， 上下颠倒， 12000 转 4离心 5min， 小心去除乙醇， 室温干燥 2-5min， 加入 30ulDEPC 水， -70保存。 （以上操作均在无菌操作台。
10、中进行， 用到的离心管和枪头等均无 RNA 酶） 0011 （6） 细胞破碎 ： 向步骤 3 离心管中加入 3ml1% 聚乙烯吡咯烷酮 （PVP K-30） （PBS 磷 酸缓冲液配制， PH=7.0） ， 震荡混匀， 超声破碎 10-15 次 （功率 300W， 破碎持续时间 2S， 间隔 5S） 。以上所有操作均在冰上进行。 0012 （7） 总蛋白提取 ： 破碎后 8000 转， 4离心 10 分钟， 取上清。 0013 本发明中使用培养基均为常用培养基， 其中轮虫通用培养基为轮虫人工配置培养 说 明 书 CN 102978196 A 3 2/5 页 4 基， 每升含有 NaHCO36m。
11、g、 CaSO4.2H2O 60mg、 MgSO4.7H2O 123mg、 KCl 4mg。根据需要利用 HCl 和 NaOH 调节 pH 值 7.5 左右。饵料微藻采用 BBM 培养基， 每升含有 NaNO3250mg,CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O 75mg,K2HPO475mg,KH2PO4175mg,NaCl 25 微量元素和维生素各 2mL。 0014 光照采用20-40W日光灯， 光照时间24小时， 温度控制在25-30， 每日摇动若干次 或者利用旋转培养装置转速 10-15 转 / 分钟。 0015 本发明所说筛网是 300 目的滤网， 孔径是 54 微米， 可以滤去。
12、多余的水分和残余的 微藻， 使用时将其折叠成漏斗状 （和滤纸使用方法类似， 图 1） 架于烧杯上， 将轮虫培养液缓 慢的滴入。 0016 本发明采用冰冻是由于轮虫过小， 普通研磨棒不能有效的将其破碎， 冻融后轮虫 虫体会自然裂解， 释放出 RNA。 0017 本发明采用超声破碎能够有效的破碎轮虫细胞， 释放出胞内复合物， 包括总蛋白。 0018 本发明所说的聚乙烯吡咯烷酮 （PVP K-30） 的浓度是 1%， 由 PH=7.0 的 PBS 磷酸缓 冲液现配现用。 0019 本发明的原理为 ： 0020 a. 藻类去除原理 ： 轮虫能够快速游动， 离心后轮虫能迅速游动到上清液中， 从而 能有效。
13、的分离出微藻 ； 0021 b. 活体富集原理 ： 微孔筛网的过滤能够去除多余的水分和残存的藻类 ； 0022 c.RNA 释放原理 ： 加 TRIZOL 后， 冰冻能够破裂虫体释放 RNA ； 0023 d. 细胞破碎原理 ： 超声破碎能很好的破坏虫体， 释放出胞内蛋白。该方法操作简 便， 快速， 经济， 便于应用。 附图说明 0024 图 1 是筛网使用示意图。 0025 图 2 是富集后高密度的轮虫。 0026 图 3 是微藻去除前后对比图。 具体实施方式 0027 在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。 0028 下面结合具体实施例， 。
14、并参照数据进一步详细地描述本发明。 应理解， 这些实施例 只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0029 在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相 同试剂如无特殊说明， 均以首次标明的内容相同。 0030 实施例 1 ： 饵料藻类的去除 0031 （1） 轮虫培养 0032 利用 13 号浮游物网从养殖池塘表层捞取活体样本 200mL。带回实验室。挑选 1 个 携带非混交雌体， 移入微孔细胞培养板中。微孔加入微绿球藻浓度 3106ind/mL 的轮虫混 。
15、合悬液。在 20-40W 日光灯下连续光照培养、 温度 25-28 C、 连续充气培养。2 天后挑选 50 说 明 书 CN 102978196 A 4 3/5 页 5 个携带非混交卵的个体移入 100mL 微绿球藻浓度 3106ind/mL 的轮虫培养悬液。 0033 （2） 藻类去除 0034 将轮虫培养液装入 50ml 离心管中， 4500rpm， 4离心 5 分钟， 微藻沉在离心管底 部， 小心倒出含有轮虫的上清， 本步骤可重复 2-3 次直到藻类全部除去。 0035 实施例 2 ： 活体轮虫的富集 0036 将 300 目的筛网折成漏斗状， 架于烧杯上 （图 1） ， 用胶头滴管吸取。
16、去除微藻的轮虫 培养液， 缓慢的滴入筛网底部， 滤去水分， 之后用双蒸水冲洗数次， 在解剖镜下用 10-100ml 移液枪将轮虫吸到 1.5ml 离心管中。 0037 实施例 3 ： 总 RNA 提取 0038 传统研磨和冰冻破碎总 RNA 提取效率比较 0039 藻类去除后， 轮虫破碎处理采用下列方式 ： 处理一 ： 将其转移到预先准备好 的研磨棒中， 加 1mlTRIZOL， 研磨数次 ； 处理二 ： 将轮虫转移到无 RNA 酶离心管中， 加入 1mlTRIZOL， 放入低温冰箱中冰冻 （约 30min） ， 然后取出冰上融化 ： 对照 ： 轮虫转移到无 RNA 酶离心管中后， 加 1ml。
17、TRIZOL， 上下震荡 10S。RNA 提取后续操作步骤相同。RNA 提取结果如 表 1 所示， 冰冻能高效的提取轮虫总 RNA， 其他操作均会降低 RNA 提取效率。 0040 表 1 轮虫总 RNA 浓度值测定 0041 0042 0043 实施例 4 ： 总蛋白的提取 0044 细胞破碎 ： 向步骤 3 离心管中加入 3ml、 质量分数为 1%PVP K-30（PBS 磷酸缓冲液 配制， PH=7.0） ， 震荡混匀， 超声破碎 10-15 次 （功率 300W， 破碎持续时间 2S， 间隔 5S） 。以上 所有操作均在冰上进行。 0045 总蛋白提取 ： 破碎后 8000 转， 4离。
18、心 10 分钟， 取上清。 0046 最佳超生破碎次数的确定 ： 说 明 书 CN 102978196 A 5 4/5 页 6 0047 超声破碎次数分别是 20 次， 15 次， 10 次， 5 次。最终提取的蛋白量如表 2 所示， 破 碎次数在 10-20 次时蛋白浓度最高， 过的超声会破坏蛋白的结构， 使其失去其生理活性， 超 声次数过少， 虫体破碎不充分， 不利于蛋白的充分释放。 0048 表 2. 不同超生破碎次数对总蛋白浓度的影响 0049 0050 说 明 书 CN 102978196 A 6 5/5 页 7 说 明 书 CN 102978196 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102978196 A 8 。