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1、(10)申请公布号 CN 103073629 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103073629 A *CN103073629A* (21)申请号 201310001962.4 (22)申请日 2013.01.04 C07K 14/47(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/63(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市。
2、南岗区马端 街 427 号 (72)发明人 王晓钧 胡哲 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 (54) 发明名称 一种可抑制病毒粒子释放的蛋白， 其编码序 列及在抑制逆转录病毒从细胞释放中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种可抑制逆转录病毒粒子释 放的蛋白， 其编码序列及在抑制病毒从细胞释放 中的应用。本发明研究了该蛋白与马传染性贫血 病毒 （EIAV） 、 人免疫缺陷病毒 （HIV-1）及猴免疫 缺陷病毒 （SIV） 的相互作用关系， 并确定他们相 互作用的关键位点。 本发明通过分子克隆技术， 获 得了该蛋白基因和 EIAV 病毒样颗。
3、粒的真核表达 载体， 经测序分析， 克隆的该蛋白基因与该基因的 预测序列的同源性为 99%， 相对应的氨基酸序列 同源率为 94.0%。该蛋白具有限制人免疫缺陷病 毒 1 型、 马传染性贫血病毒、 以及猴免疫缺陷病毒 病毒粒子从细胞释放的能力， 进一步的研究发现， EIAV的env蛋白能够拮抗该蛋白对病毒的限制作 用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 序列表 4 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书12页 序列表4页 附图8页 (10)申请公布号 CN 103073629 A CN 103073629。
4、 A *CN103073629A* 1/1 页 2 1. 一种可抑制逆转录病毒粒子释放的蛋白， 为马 tetherin 蛋白， 其特征在于具有 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的核苷酸序列。 3. 如权利要求 2 所述的核苷酸序列， 其特征在于所述的核苷酸序列如 SEQ IDNO.2 所 示。 4. 一种表达载体， 其特征在于含有权利要求 2 或 3 所述的核苷酸序列。 5. 一种宿主细胞， 其特征在于含有权利要求 4 所述的表达载体。 6. 权利要求 1 所述的蛋白在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药物中的应用， 所述的 逆转录病毒包括马传染性贫血病。
5、毒、 人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。 7.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药物中的应 用， 所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒、 人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。 8.马传染性贫血病毒的囊膜蛋白env在制备拮抗权利要求1所述的蛋白对逆转录病毒 从细胞释放的抑制作用的药物中应用， 所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒、 人免疫 缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。 9. 如权利要求 8 所述的应用， 其特征在于所述的囊膜蛋白 env 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。 权 利 要 求 书 CN 103073629 A 2 1/12 页 3 一种可抑制病毒粒子释。
6、放的蛋白， 其编码序列及在抑制逆 转录病毒从细胞释放中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种可抑制病毒粒子释放的蛋白， 其编码序列及在抑制逆转录病毒粒 子从细胞释放中的应用， 特别涉及一种马tetherin蛋白， 其编码序列及在抑制EIAV、 HIV以 及 SIV 从细胞释放中的应用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 机体内存在一些先天的免疫因子， 这些因子可以起到控制病毒蔓延和防止病毒跨 种间传播的作用， 被称为 “宿主限制因子” ， 参与先天性免疫反应， 干扰病毒生命周期的不同 阶段。在人免疫缺陷病毒研究中发现， 宿主细胞天然存在若干种屏障， 对病毒的侵入、 复制 和出芽存在限。
7、制作用。目前有四大类限制因子 ： APOBEC（可诱导前病毒 DNA 产生致命的超 级突变） 、 Trim5（可特异性与刚进入细胞的病毒核衣壳蛋白结合， 从而阻止病毒的脱壳和 逆转录） 、 Tetherin（限制逆转录病毒释放） 、 SAMHD1（阻碍逆转录病毒 cDNA 的合成， 干扰病 毒感染） 。这些限制因子可有效地限制逆转录病毒感染， 是宿主抵抗病毒感染的一个重要防 御屏障。 0003 1994年人们首次发现BST-2表达在人的浆细胞系、 骨髓间质细胞和B细胞的表面， 并推测该蛋白在B细胞的发育过程中发挥作用。 2006年， 研究人员证实BST-2是卡波西肉瘤 相关性疱疹病毒 （Kap。
8、osi s sarcoma-associated herpesvirus， KSHV） K5 蛋白 （又称 MIR2） 的一个靶点， 由此推测 BST-2 很可能与宿主抗病毒的防御机制有关。2008 年这一抗病毒活 性得到证实， 它可以抑制 Vpu 缺陷的 HIV-1 病毒的释放， 重新命名为 tetherin。 0004 Tetherin （BST2/CD317） 是一种由干扰素诱导产生的抗病毒分子， 它能够抑制感染 哺乳动物的多种衣壳病毒粒子从感染细胞中释放。 所有这些病毒共同具有的结构病毒 外膜， 是tetherin作用的靶点。 Tetherin通常只在类浆树突状细胞上、 部分癌细胞、 。
9、终末分 化成熟的 B 细胞和骨髓间质细胞中高效表达， 但是 tetherin 也可以受 I 型干扰素 （IFN-I） 的诱导而表达。人体感染 HIV-1 病毒后， 病毒粒子与树突状细胞 （IFN 的主要生成细胞） 上 的 CD4 受体结合， 经内吞作用进入细胞浆， 内涵 体中的病毒核酸与 TLR7/9 结合， 启动信号 传导通路， 诱导 IFN-I（包括 IFN、 IFN 和 IFN 三种形式） 的表达。IFN-I 可以诱导上 百种不同基因的表达， 并活化天然杀伤性细胞、 骨髓树突细胞、 T 细胞、 B 细胞和巨噬细胞。 IFN- 和 IFN- 与它们相应受体结合， 通过 JAK/STAT 信。
10、号途径诱导感染病毒的细胞中 tetherin 的表达。诱导产生的 tetherin 首先迁移到内质网上， 然后通过 COPII-coated 泡 状体运送到高尔基体的区室中， 最终到达浆膜， 同时利用胞质尾区保守的酪氨酸基团与 AP2 衔接蛋白复合物结合， 在网格蛋白介导的内吞作用下进入包涵体， 并在高尔基体和细胞表 面之间循环往返。 为了防止促炎细胞因子产生过剩， 造成免疫亢奋， 还有一个负反馈调节机 制， 即 tetherin 与浆细胞树突状细胞上的 TLR7 结合， 抑制 IFN-I 和其他促炎细胞因子的表 达。当新生的病毒出芽或释放时， Tethein 一端或两端的膜锚定区可插入到病毒。
11、的衣壳中， 进而将病毒锚定在细胞膜的表面， 在细胞的内吞作用下， 利用溶酶体降解病毒粒子。 说 明 书 CN 103073629 A 3 2/12 页 4 0005 在长期进化过程中， 病毒往往通过自身编码的蛋白来抑制 Tetherin 的活性， 从而 形成了特定的逃逸机制。例如， 人免疫缺陷病毒 （HIV-1） 的 Vpu 及猴免疫缺陷病毒 （SIV） 的 Nef 蛋白可拮抗 tetherin 的限制作用。然而适应一种宿主的病毒只能对抗该宿主的 tetherin 的限制作用， 对异种动物 tetherin 的限制不具有对抗作用。因此， tetherin 被认 为在防止病毒跨种间传播方面具有重。
12、要作用。 0006 Vpu 蛋白是 HIV-1 病毒的辅助调节蛋白之一， 是一个大小为 16kDa 的跨膜蛋白， 可 直接与Tetherin的跨膜区相互作用。 这种相互作用具有高度的特异性， tetherin跨膜区位 点的突变可使其克服Vpu的拮抗作用。 Vpu引起宿主细胞表面tetherin水平下降、 也会使细 胞中 tetherin 总量减少。Vpu 在高尔基体反面的网状结构或早期内涵体上靶定 tetherin， 通过 -TrCP（嵌合泛素连接酶） - 依赖机制， 经蛋白酶或溶酶体途径降解 tetherin， 从而 将 tetherin 的作用沉默。然而， Vpu 上的结合位点 -TrCP。
13、 的突变并不能完全干扰 Vpu 克服 tetherin 的作用 ； 而 tetherin 含量下调也并不完全取决于 Vpu 的中和作用。所以， tetherin 在细胞表面表达减少、 在细胞内被降解或者沉默的确切机制， 以及 Vpu 依赖性的 病毒释放增强机制中各因子的作用还需要进一步的研究。 0007 大多数灵长类慢病毒并不含有 Vpu 蛋白， 有些慢病毒 （例如分别感染乌白眉猴 sooty mangabeys、 短尾猴 macaques、 Syke 猴、 Syke s monkeys 和非洲绿猴 African green monkeys的SIVsmm、 SIVmac、 SIVsyk和SI。
14、Vagm病毒） 利用自身编码的Nef蛋白抵抗tetherin 的抑制作用。另外， 感染黑猩猩 chimpanzees 和大猩猩 gorillaz 的 SIVcpz 和 SIVgor 病毒 是 HIV-1 的起源， 也含有 Vpu 蛋白， 但是却应用 Nef 蛋白阻断 tetherin 的作用。Nef 是病 毒在体内有效复制的关键蛋白， 它可以在宿主细胞中调控细胞的运输、 信号转导和基因的 表达。Nef 是如何拮抗 tetherin 的作用目前还不清楚， 但是 Nef 可作为衔接蛋白 （adaptor protein） ， 与胞浆中的 CD4、 CD28 和 MHC-I 相互作用， 使它们的表达。
15、量降低。Nef 还可以锚 定 Tetherin 的胞质尾区， 降低 tetherin 在宿主细胞表面的表达。如果在 Nef 上做某些突 变， 可阻断它对 tetherin 的作用， 同时也可以消除它对 CD4 表达量下调的作用。 0008 Tetherin 抗病毒活性的发现为宿主防御机制研究方面开辟了一个新的领域。目 前， 人们对病毒与宿主之间相互作用的复杂机制的了解还刚刚开始， 仍有一些宿主限制因 子没有发现， 受 IFN-I 诱导产生因子的功能也还未可知。是否不能诱导 IFN-1 反应的病毒 就不需要有自身编码的拮抗基因的存在还不清楚。 Tetherin拮抗物对于病毒复制方面的重 要意义还。
16、需要进一步的研究。 进一步的研究不仅可以揭示病毒与其宿主相互斗争的分子机 制， 而且还可以引入基因干预的思路来治疗 HIV 和其他病毒 发明内容 0009 本发明的目的在于通过分子克隆技术， 构建马 tetherin 蛋白基因和 EIAV 感染性 克隆的真核表达载体， 研究马tetherin与EIAV的相互作用关系， 并确定他们相互作用的关 键位点。 0010 为了达到以上目的本发明采用了以下技术方案 ： 0011 本发明利用普通 PCR 从马血中扩增马 tetherin 基因， 应用克隆技术构建该基因 及其突变基因 （delCT、 delGPI、 N51A、 N78A） 的重组质粒， 利用融。
17、合 PCR 技术和克隆技术构 建 EIAV ENV的 Gp2、 Gp3 包装质粒 ； 通过脂质体 Lipofectamine2000 在驴皮肤细胞上转染马 说 明 书 CN 103073629 A 4 3/12 页 5 tetherin重组质粒， 再感染EIAV病毒， 或者在Hela或者HEK293T细胞上通过磷酸钙法共转 染目的基因和包装质粒， 收集细胞裂解液和培养液上清， 进行Western Blotting分析， 或者 固定细胞进行间接免疫荧光试验。结果成功构建了 pEF4.HA.Flag 和 Eq.te 重组质粒， 经测 序分析， 克隆的马 tetherin 基因与该基因的预测序列的同。
18、源性为 99% （493/498） ， 相对应的 氨基酸序列同源率为 94.0%（156/166） ； 经 Western blottining 分析， 在 26Ku 处能够检测 到目的蛋白的表达。 0012 在感染试验中， 通过研究发现转染马 tetherin 的驴皮肤细胞的培养液上清中检 测不到 EIAV。在重组质粒共转染试验中， 马 tetherin 和 Gp1/Gp2/Gp3 重组质粒共转染 HEK293T或Hela细胞， 经Western blottining分析， 对照组未转染tetherin的细胞裂解物 和培养液上清中均可检测到 EIAV 的病毒样颗粒， 而不能在转染 tethe。
19、rin 的细胞却在上清 液检测到病毒 ； 应用间接免疫荧光试验， 在共聚焦显微镜下观察， 马 tetherin 和 EIAV 共定 位于细胞浆、 细胞膜和核膜上。共转染马 tetherin 缺失基因 delCT/delGPI 或 N51A/N78A 和 Gp2 重组质粒， delCT 和 delGPI 的培养液上清中可检测到 EIAV， 其所释放的病毒量少于 阴性对照、 多于阳性对照的 ； N51A 和 N78A 上清液中所释放的病毒与阳性对照无明显差异， 与阴性对照相比病毒量均显著降低。共转染马 tetherin、 EIAV 的 env 和 Gp1 重组质粒， 在 上清液中能够重新检测到 E。
20、IAV 的病毒样颗粒。 0013 通过以上实验证实本发明所克隆得到的马 tetherin 基因所编码的蛋白可以抑制 EIAV病毒从细胞中释放， 并将EIAV限制在细胞膜和核膜上， 马tetherin基因中的胞浆尾区 （CT） 和 GPI 是 tetherin 与 EIAV 作用的关键位点， N51 和 N78 糖基化位点的突变对病毒的 限制作用没有影响。在病毒与宿主的相互作用上， EIAV 的 env 蛋白能够拮抗 tetherin 对 EIAV 的限制作用。另外， 通过进一步的实验研究发现， 本发明所克隆得到的马 tetherin 基 因所编码的蛋白同样可以抑制 HIV 以及 SIV 病毒从。
21、细胞中释放。 0014 因此， 在此研究的基础上， 提出了本发明。 0015 本发明的一种可抑制病毒粒子释放的蛋白， 为马 tetherin 蛋白， 其特征在于具有 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列。 0016 本发明还提供了编码所述蛋白的核苷酸序列。 0017 在本发明中， 优选的， 所述的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0018 含有所述的核苷酸序列的表达载体及含有该所述的表达载体的宿主细胞也在本 发明的保护范围之内。 0019 再进一步的， 本发明还提供了所述的蛋白在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药 物中的应用， 所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒 （EIAV） 。
22、、 人免疫缺陷病毒 （HIV） 及 猴免疫缺陷病毒 （SIV） 。 0020 所述的核苷酸序列在制备抑制病毒从细胞释放的药物中的应用， 所述的病毒包括 马传染性贫血病毒 （EIAV） 、 人免疫缺陷病毒 （HIV） 及猴免疫缺陷病毒 （SIV） 。 0021 更进一步的， 本发明还提供了马传染性贫血病毒 （EIAV） 的囊膜蛋白 （env） 在制备 拮抗本发明所述的蛋白对马传染性贫血病毒 （EIAV） 从细胞释放的抑制作用 的药物中应 用。在本发明中， 所述的囊膜蛋白 （env） 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。 附图说明 说 明 书 CN 103073629 A 5 4/12 。
23、页 6 0022 图 1 为 VR-Gp2 载体构建示意图 ； 0023 图 2 为 VR-Gp3 载体构建示意图 ； 0024 图 3 为 pHAHA 阳性质粒的酶切鉴定结果 ； 0025 1 ： pcDNA3.1(+) ； 2 ： pHAHA-Clone1 ； 3 ： pHAHA-Clone2 0026 图 4 为 pHF 重组质粒 PCR 鉴定结果 ； 0027 图 5 为目的基因的扩增 ； 0028 图 6 为 Eq.te 重组质粒的鉴定 ； 0029 图 7 为核苷酸序列的比对结果 ； 0030 图 8 为蛋白质序列的比对结果 ； 0031 图 9 为 Eq.te、 delCT 和 。
24、delGPI 阳性克隆序列的比对结果 ； 0032 图 10 为 Eq.te、 delCT 和 delGPI 重组质粒在 HEK293T 细胞上的表达情况 ； 0033 图 11 为马 Tetherin 抑制 EIAV 病毒的释放情况 ； 0034 图 12 为马 tetherin 与 EIAV 的共定位 ； 0035 图 13 为马 teherin 突变体对 EIAV 的影响 ； 0036 图 14 为 EIAV Env 对马 tetherin 的影响 ； 0037 图 15 为马 tetherin 对 HIV 释放的影响 ； 0038 图 16 为马 tetherin 对 SIV 释放的影。
25、响。 具体实施方式 0039 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明， 应该理解的是， 这些实施例 仅用于例证的目的， 决不限制本发明的保护范围。 本领域普通技术人员理解， 在本发明权利 要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变， 修改， 甚至等效变更， 但都将落入本发明 的保护范围内。 0040 实施例 1 0041 1材料与方法 0042 1.1 材料 0043 111 细胞 0044 E.coli HB101 工程菌由本实验室保存， 培养与 LB 培养基中 （细菌培养所用胰蛋白 胨 （Tryptone） 、 酵母提取物 （Yeast Extract） 均购自 Sigma 公司） 。
26、； HEK293T、 Hela、 驴皮肤 （FDD） 细胞和驴血管内皮细胞由本实验室保存， 培养于 DMEM 高糖 （购自 Gibco 公司） 培养基 中。 0045 1.1.2 载体与主要试剂 0046 pef4myc-his-B、 pFD3-8(含有EIAV的全基因序列)质粒为本实验室留存， pMD-18T 购自 TaKaRa 公司， pcDNA3.1(+)、 pVR 载体由本实验保存 ； pNL43-Hsas 质粒为 HIV Vif 缺 失性的感染性克隆， pBR238EN质粒为 SIV Env 和 Nef 缺失性的感染性克隆 ； 人 Tetherin （Ho.te） 和猴 Tether。
27、in（M ac.te） 、 真核表达质粒为本实验室已构建并保存的。AxyPrep 血 RNA 小量制备试剂盒购自 AXYGEN 公司 ； PCR 产物纯化试剂盒、 质粒提取试剂盒和凝胶 回收试剂盒均购自 Omega 公司 ； Lipofectamine2000 脂质体购自 Invitrogen 公司 ； 细胞 培养用试剂血清等均购自 Gibco 公司 ； M-MLV 逆转录酶购自 Invitrogen 公司 ； LA Taq、 说 明 书 CN 103073629 A 6 5/12 页 7 dNTP 购自 TaKaRa 公司 ； EcoRI、 NotI、 BamHI 等限制性内切酶和 T4DN。
28、A ligase 购自 NEB 公 司。Monoclonal Anti-HA clone HA-8Mouse Ascites Fluid(H9658) 和 Monoclonal anti-beta-actin clone AC-15Mouse Ascites Fluid(A5441)购自Sigma公司Anti-mouse IgG(HL)Antibody IRDye800Conjugated(MinXBvCh Gt GP Ham Hs Hu Rb RtSh Serum Proteins)(610-732-124) 购自 ROCKLAND 公司 ； Rabbit polyclonal second。
29、ary antibody to horse IgG-H 激光共聚焦显微镜购自 Leica 公司。 0049 1.2 方法 0050 1.2.1RNA 的提取 0051 真空采取健康马血， 用 AxyPrep 血 RNA 小量制备试剂盒提取血液中的总 RNA， 300l 全血按说明书的步骤操作， 最终加入 100l Buffer TE 洗脱获得马血液 RNA。 0052 1.2.2 引物的合成 0053 根 据 Equus caballus tetherin 基 因 预 测 的 序 列 （GeneBank 登 录 号 ： XM-001915091.1） 设计并合成引物， 利用引物 eq.te.F。
30、 和 eq.te.R 扩增马 tetherin 序列， 利用上、 下引物HAHA.F/R、 HAflag.F/R或Pst I.Linker.S/Bgl II.Linker.A退火构建带有 HAHA、 HAflag 标签和含有 Linker 序列的质粒， 利用引物 eq.delCT.F 和 eq.te.R 扩增 5 端 （N 端） 缺失胞浆尾区的马 tetherin 序列， 利用引物 eq.te.F 和 eq.delGPI.R 扩增 3 端 （C 端） 缺失 GPI 片段的马 tetherin 序列， 利用引物 eqTe.N51A.F/R 或 eqTe.N78A.F/R 引物进 行 N 到 A 。
31、的定点突变 ； 利用融合 PCR 分别扩增 EIAV 序列的 A、 B 和 C 段序列， 利用引物 gpF 和 gpR 扩增 EIAV 的 gag 和 pol 基因序列， 利用引物 gtpF 和 gtpR 扩增 EIAV 的 gag、 tat 和 pol 基因序列。扩增基因的引物名称及其序列如表 1 所示。 0054 表 1. 扩增基因的引物名称及其序列 0055 说 明 书 CN 103073629 A 7 6/12 页 8 0056 0057 1.2.3RT-PCR 扩增 0058 以提取的健康马总 RNA 为模板， 利用 PCR 扩增的下游引物 （eq.te.R） 反转录合成 cDNA，。
32、 以此为模板进行 PCR 扩增， 在 25l 的反应体系中， dNTP Mixture（各 2.5mmol/L） 1l 引物 （eq.te.F 和 eq.te.R） 各 10pmol， cDNA5l10LAPCR BufferII(Mg2+)， LA Taq 酶 （5U/l） 0.3l ； 扩增条件为 95变性 5min， 以 95变性 45sec， 67退火 30sec， 72 延伸 45sec， 40 个循环， 72延伸 10min。 说 明 书 CN 103073629 A 8 7/12 页 9 0059 1.2.4 各种标签载体的构建 0060 （1） pHAHA 标签载体的构建 00。
33、61 在 100l 体系中分别加入 50l 的 NotI.HA.S 和 XbaI.HA.A， 94 4min， 自然降 至室温， 得到带有粘端的 HAHA 合成产物， 该产物与 pcDNA3.1(+) 经 NotI 和 XbaI 双酶切的 胶回收产物， T4DNA 连接酶连接， 转化大肠杆菌 HB101 感受态， 在含有 100g/mL 的氨苄西 林的 LB 固体培养基上筛选重组子。提取阳性克隆的质粒， 经 XbaI 和 NdeI 双酶切鉴定， 得 到 pcDNA3.1(+) 上带有 HAHA 标签的重组质粒 pHAHA， 并测序分析。 0062 （2） VR-Linker-HA 标签载体的构。
34、建 0063 首先构建 VR-Linker 载体， 在 100l 体系中分别加入 50l 的 Linker.F 和 Linker.R， 94 4min， 自然降至室温， 得到带有 PstI 和 BglII 粘端的 Linker 合成产物， 该 产物与 pVR 经 PstI 和 BglII 双酶切的胶回收产物， T4DNA 连接酶连接， 转化大肠杆菌 HB101 感受态， 在含有 100g/mL 的氨苄西林的 LB 固体培养基上筛选重组子， 经测序鉴定获得 VR-Linker 载体。该 Linker 序列上包含有 HindIII、 BamHI、 EcoRI、 NotI、 XhoI、 XbaI， 。
35、利用 NotI 和 XbalI 的酶切位点将 HA 标签克隆到 VR-Linker 上 （pVRLHA） 。 0064 （3） pEF4.HA.Flag（pHF） 标签载体的构建 0065 在 100l 体系中分别加入 50l 的 HAflag.F 和 HAflag.R， 94 4min， 自然降至 室温， 得到带有粘端的 HAflag 合成产物， 该产物与 pEF4.HA.Flag 经 KpnI 和 BamHI 双酶切 的胶回收产物混合， T4DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌HB101感受态， 在含有100g/mL的氨 苄西林的LB固体培养基上筛选重组子， 37培养16-20h后， 挑去单克。
36、隆菌落于5ml100g/ mL 的氨苄西林的 LB 液体培养基中， 37过夜培养。利用 T7 和 BGHrev 通用引物进行菌液 PCR 鉴定， 将鉴定结果为阳性的菌液提取质粒， 得到重组克隆 pEF4.HA.Flag（pHF） ， 并测序 分析。 0066 1.2.5 真核表达质粒 Eq.te 及其缺失株或突变株的构建 0067 将马 tetherin 经 RT-PCR 扩增并回收纯化的产物和 pHF 分别经 EcoRI 和 NotI 双 酶切， 胶回收产物， T4DNA 连接酶连接， 转化大肠杆菌 HB101 感受态 （同 1.2.4 所述） ， 进行菌 液 PCR 和阳性克隆质粒的酶切鉴。
37、定， 得到重组克隆 Eq.te， 并测序分析。 0068 利用 HMMTOP 软件 (http:/www.enzim.hu/hmmtop/) 预测马 tetherin 的拓扑结 构， 分析其跨膜区位于第 11-33 位氨基酸， 第 1-10 位氨基酸位于胞浆尾区 （CT） ， 第 34-166 位氨基酸均位于胞浆内 ； 利用 big-PI Predictor GPI Modification Site Prediction 预测软件 (http:/mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html) 预测糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定位点， 可能位于第 139 。
38、位或 133 位。利用 PCR 方法从已构建的 Eq.te 重组质粒上 分别扩增N端缺失1-10位氨基酸 （delCT） 或C端缺失第139-166位氨基酸 （delGPI） 的核苷 酸片段， 再利用 Eco RI 和 NotI 将其克隆到 pHA 载体上， 构建 delCT 和 delGPI 马 tetherin 缺失载体。 0069 利 用 NetNGlyc1.0Server(http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 识 别 可能存在的 N- 糖基化位点， 分别位于 51 和 78 位。利用 Fast Mutagenesis System 试剂 盒构。
39、建 N51A 和 N78A 马 tetherin 突变株。PCR 反应体系为 ： Eq.te 重组质粒 10ng， 引物 （eqTe.N51A.F/R或eqTe.N78A.F/R） 各10pmol， 5TransStart FastPfu buffer 10l10mM dNTPs， 1l TranStart FastPfu DNA Polymerase ； 循环参数为 95变性 5min， 以 95变 说 明 书 CN 103073629 A 9 8/12 页 10 性 30sec， 55退火 30sec， 72延伸 5min， 30 个循环， 72延伸 10min。PCR 产物在 1% 琼脂。
40、 糖凝胶电泳上检测。在 PCR 产物中加入 1l DMT 酶， 37孵育 1h， 取 2-5l 该消化产物于 50l DMT 感受态细胞中， 进行转化和克隆鉴定。 0070 1.2.6 假病毒粒子的构建 0071 1.2.6.1VR-Gp2 载体的构建 0072 以携带 EIAV 全基因的表达质粒 pFD3-8 为模板， 构建缺失 EIAV env 基因的重 组载体 pMD-18T-Tat-Gag-Pol-GFP。利用 PCR 反应分别扩增 pFD3-8 序列上的 A 片 段 （4876bp-5553bp） 和 C 片段 （7240bp-8256bp） ， 以及含有 GFP 序列的 B 片段。。
41、首先将 A 和 B 片段的 PCR 产物分别进行 50退火， 延伸 1min， 各取产物 5l 混合， 50退火， 延伸 2min， 10 个循环 ； 取该 PCR 产物 5l 利用 A 段上游引物 F 和 B 段下游引物 R 进行 PCR 扩增， 退火 温度为50， 其他参数同前所述， 30个循环， 获得含有A和B段的PCR产物， 将该产物与C片 段进行上述融合 PCR 反应， 获得含有 A， B 和 C 片段的 PCR 产物， 并将其克隆到 pMD18-T 载体 上， 即 T-GFP。PCR 反应扩增 tat-gag-pol 片段， 利用 PstI 和 NcoI 内切酶将该片段插入到 T-。
42、GFP 上， 构建 T-tat-gag-pol-GFP 质粒。再利用 PstI 和 Xbal 内切酶将 tat-gag-pol-GFP 片段克隆到 VRLinkerHA 载体上， 构建 VR-tat-gag-pol-GFP 质粒， 简称 VR-Gp2 或者 Gp2， 其 载体构建示意图如图 1 所示。 0073 1.2.6.2VR-Gp3 载体的构建 0074 PCR 分别扩增 gag-pol 片段和 REE 片段， 利用 Eco RI 和 NotI 内切酶将 gag-pol 片 段克隆到 VR-Linker-HA 载体上 （VR-gag-pol， 即 VR-Gp1 或 Gp1） ， 然后利用。
43、 NotI 和 Xbal 内 切酶将 RRE 片段克隆到 VR-gag-pol 质粒上， 构建 VR-gag-pol-tat 质粒， 简称 VR-Gp3 或者 Gp3， 其载体构建示意图如图 2 所示。 0075 1.2.7 编码 EIAV Env 基因重组质粒的构建 0076 1.2.8PCR 扩增 pFD3-8 上 RU5 片段， 并连接到 pMD-18T 载体上 （p18T-RU5） ； 利用 NcoI 和 XhoI 内切酶将 pFD3-8 上 Env 克隆到 p18T-RU5 上， 将获得的阳性克隆质粒送往测 序公司测序， 最后利用 HindIII 和 XhoI 将阳性质粒上的 RU5。
44、-Env 片段克隆到真核表达载体 pHAHA上， 获得重组质粒pRU5-Env。 Western Blotting分析检测重组蛋白的表达和EIAV的 产生与释放 0077 1.2.8.1 重组蛋白的检测 0078 用磷酸钙法或者 Lipofectamine2000 试剂盒将重组质粒 Eq.te 或者 env 分别转染 HEK293T， 同时转染 pHF 做阴性对照 （NC） 。转染前一天按 8105个 / 孔细胞消化饲养与 6 孔板中， 次日转染步骤如Lipofectamine2000说明书所述， 转染后6h换全培养基， 继续培养 48h后， 弃掉上清液， 用裂解液裂解细胞350l/孔， 在水。
45、平摇床上作用15分钟， 将裂解的细 胞 12,000rpm 离心 2 分钟， 获得的上清液进行 SDS-PAGE 电泳 ； 电泳后半干式转膜仪 19V， 转 膜 1h ； 取出膜后， 进行 Western Blotting 分析， 室温 5%TBS 脱脂乳封闭 2h， Anti-HA 单克隆 抗体 （1:5000 倍稀释） 或者 EIAV 感染马血清 （1 ： 500 倍稀释） 室温作用 1h， 抗鼠或者抗马二 抗 （1:5000 倍稀释） 室温作用 1h， Odyssey 扫描成像。 0079 1.2.8.2 重组蛋白与 EIAV 相互作用 0080 （1） 共转染试验 0081 用 Lip。
46、ofectamine2000 将重组质粒 Eq.te/delCT/delGPI 和 Gp2 共转染 Hela 细胞 说 明 书 CN 103073629 A 10 9/12 页 11 /HEK293T 细胞 （磷酸钙法转染） ， 重组质粒 pHF和Gp2共转染作为阴性对照 （NC） ， DNA转染总 量为 1g， 转染后 48h 处理细胞和上清液 （方法同 1.2.7.1 所述） ， 进行 Western Blotting 分析， 细胞裂解物分别与 Anti-HA 单克隆抗体 （1:5000 倍稀释） 、 beta-actin 单克隆抗体 （1:5000 倍稀释） 、 EIAV 感染马血清 （。
47、1 ： 500 倍稀释） 室温作用 1h， 相应的抗鼠或者抗马二抗 （1:5000 倍稀释） 室温作用 1h， Odyssey 扫描成像。 0082 （2） 感染试验 0083 用Lipofectamine2000将重组质粒Eq.te转染驴皮肤 （FDD） 细胞， 转染6小时换液 时感染 1 ： 10 倍稀释的 EIAV 疫苗株， 作用 2h， 换成完全培养基培养 48h 后， 收集细胞裂解物 和培养液上清， 进行 Western Blotting 分析 ； 或者将感染的细胞进行间接免疫荧光实验， 于 Leica 共聚焦显微镜下观察马 tetherin 与 EIAV 的定位。 0084 （3）。
48、 间接免疫荧光 0085 用 Lipofectamine2000 将重组质粒 Eq.te 和 Gp3 共转染 Hela 细胞、 HEK293T 细 胞 （磷酸钙法转染） 或者驴血管内皮细胞， 重组质粒 pHF 和 Gp3 共转染作为阴性对照 （NC） ， 转染前一天按 3.2105个 / 孔细胞消化饲养于共聚焦平血内的小圆圈中， DNA 转染总量为 1g， 转染后 48h， 4% 多聚甲醛固定细胞 30min， PBS 洗 3 次， 5min/ 次， 0.1%Triton X-100 通透 10min， PBS 洗 3 次， 5min/ 次， 5%PBS 脱脂乳封闭 2h， Anti-HA 单。
49、克隆抗体 （1:200 倍稀 释） 或者马血清 （1:200 倍稀释） 室温作用 2h， 抗鼠荧光 （FITC 或者 RP） 二抗室温作用 1h， 以 1g/ml DIPA 染色细胞核 15min， 于 Leica 共聚焦显微镜下观察马 tetherin 与 EIAV 的定 位。 0086 1.2.8.3EIAV env 与马 tetherin 的相互作用 0087 用 Lipofectamine2000 将重组质粒 Eq.te 和 pRU5-Env(env) 两质粒 （阴性对照， NC） ， 或者 Eq.te、 env 和 Gp1 三质粒共转染 HEK293T 细胞， 质粒的转染、 细胞裂解物和上清液 的 Western Blotting 分析如前所述。 0088 。