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1、(10)申请公布号 CN 103275926 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103275926 A *CN103275926A* (21)申请号 201310170574.9 (22)申请日 2013.05.10 C12N 5/073(2010.01) (71)申请人 宁波普莱森特生物科技有限公司 地址 315040 浙江省宁波市国家高新区研发 园 C14 幢 (72)发明人 陈正琳 陈平 李杰 夏佳音 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 33226 代理人 程晓明 (54) 发明名称 一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的 方法 (57) 摘。
2、要 本发明公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚 全能干细胞的方法， 特点是包括胎盘预处理后， 利 用胎盘小叶组织制备细胞悬液， 再利用细胞悬液 制备得到亚全能干细胞分离液的步骤 ； 然后将亚 全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养， 收 集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干 细胞的步骤 ； 最后进行程序降温冻存， 将温度降 至 -80 -90.0后取出冻存样本， 放入液氮储 存罐长期保存即可， 优点是传代能力可达 20 代， 不仅具有向成骨、 软骨、 脂肪和神经细胞分化的能 力， 还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力， 亚 全能干细胞均一、 稳定、 生长周期短， 操作简单， 成 本低。 (5。
3、1)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 103275926 A CN 103275926 A *CN103275926A* 1/2 页 2 1. 一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 亚全能干细胞分离 A. 细胞悬液制备 ： 将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织， 将胎盘小叶组织剪成 0.5 1.5mm3小块， 置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后， 加入与胎盘组织等体积的浓度为 1 1.5mg/ml 的型胶原蛋白酶充分混匀， 。
4、于 37消化 0.5 2 小时后， 吸取离心管内上 清液， 将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀， 瞬间离心并吸取上清液， 重复离心操作两次， 合并上述各上清液并用 200 目无菌滤网过滤， 收集细胞初悬液 ； 将细胞初悬液于 1000 2000rpm 的转速下离心 5 20 分钟， 取离心得到的沉淀加入生理盐水定容， 得到的细胞悬 液 ； B. 亚全能干细胞分离液的制备 ： 将细胞悬液按体积比 1 2:1 的比例缓慢加入到淋巴 细胞分离液中， 于 500 1000rpm 离心 5 20min 后， 离心管内混合液自下到上依次分层为 红细胞层、 淋巴细胞分离液层、 单个核细胞层和生理盐水层， 吸取。
5、单个核细胞层至另一离心 管内， 加入 1.5 倍细胞悬液体积的生理盐水混匀， 于 1000 2000rpm 离心 5 20 分钟后， 将离心所得的沉淀用 0.5 倍细胞悬液体积的含 10% 胎牛血清的培养液混匀沉淀， 得到亚全 能干细胞分离液 ； （2） 亚全能干细胞培养 将亚全能干细胞分离液以 2105 10105个 /cm2的密度接种到无菌培养瓶内， 并加 入培养液， 然后置于 37、 饱和湿度、 CO2体积分数为 5% 的培养箱内开始原代培养 3-4 天 后 ； 将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉， 并重新加入相同体积的培养液， 置于上述 培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75。
6、85%的融合度后， 倒掉无菌培养瓶内培 养液 ； 将浓度为 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 20% 培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内， 37消化 1 5 分钟后， 将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化， 拍打晃动培养瓶， 使细 胞完全脱落， 将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内， 于 1000 2000rpm 离心 5 10 分 钟， 将离心所得的沉淀用含 10% 胎牛血清的培养液混匀沉淀 ； 重复上述步骤进行二代培养， 收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞 ； （3） 亚全能干细胞冻存 将含 10% 胎牛血清的培养液和 99% 二甲基亚砜按体积比 3:1 的比例缓慢混匀后 配置。
7、成冻存液， 放入冰水混合物中预冷 15 20min， 将预冷过的冻存液慢加入到含有亚 全能干细胞的冻存管中， 将冻存管放入程控降温仪进行预冷， 开始冻存程序， 将温度降 至 -80 -90.0后取出冻存样本， 放入液氮储存罐长期保存。 2. 根据权利要求 1 所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法， 其特征 在于步骤 （1） 中所述的胎盘预处理过程具体为 ： 将胎盘置于无菌钢化皿内， 加入生理盐水 充分浸泡后， 除去胎盘表面与脐带连接处的结缔组织， 剪取胎盘小叶组织放入培养皿内， 用 无菌生理盐水清洗 3 5 次。 3. 根据权利要求 1 所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的。
8、方法， 其特 征在于所述的培养液配置方法如下 （成分单位 mg/L） ： 无水氯化钙 245.00， 五水硫酸铜 0.0013， L-亮氨酸 59.05， 亚油酸 0.042， 生素B12 0.65， 1,4-丁二胺二盐酸盐0.061， L-赖 氨酸盐酸盐91.25， 硫辛酸 0.105， 定二酸 75.00， 九水硝酸铁 0.05， L-蛋氨酸 17.24， 酚 红 9.30 七水硫酸亚铁 0.41， L- 苯丙氨酸 35.48， 氯化钾 400.00， L- 丝氨酸 42.00， 丙 权 利 要 求 书 CN 103275926 A 2 2/2 页 3 酮酸钠 55， 氯化镁 27.05，。
9、 L- 苏氨酸 53.45， 维生素 H 0.0035， 无水硫酸镁 48.82， L- 丙 氨酸 4.60， D- 泛酸钙 2.24， 氯化钠 6400.00， L- 天门冬酰胺 7.5， 氯化胆碱 8.98， 无水 磷酸二氢钠 54.2， L- 天门冬氨酸 8.65， 叶酸 4.00， 磷酸氢二钠 71.02， L- 半胱氨酸盐酸 盐 16.56， 肌醇 12.6， L- 谷氨酸 7.35， 烟酰胺 2.02， L- 精氨酸盐酸盐 147.5， L- 脯氨酸 17.25， 盐酸吡哆醛 2， L- 胱氨酸盐酸盐 31.25， L- 色氨酸 9.02， 盐酸吡哆醇 0.031， L- 酪 氨酸。
10、 38.4， 核黄素 0.219， 甘氨酸 18.75， L- 缬氨酸 52.85， 盐酸硫胺 2.17， L- 组氨酸盐 酸盐 31.46， D- 葡萄糖 1000.00， 胸苷 0.365， L- 异亮氨酸 54.47， 次黄嘌呤 3， 成纤维细 胞生长因子 0.01， 维生素 C 0.89， L- 谷氨酰胺 325。 4. 根据权利要求 1 所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法， 其特征在 于步骤 （3） 中所述的冻存程序如下 ： 第一步 1 12， 等待 ； 第二步 0.5 1.2 / 分钟降 至 0 -4 ； 第三步 5 12 / 分钟降至 -15 -25 ； 第四步 0。
11、.5 1.2 / 分钟降 至 -35 -45； 第五步 5 12 / 分钟降至 -80 -90后取出冻存样本， 放入液氮储存 罐长期保存。 5. 根据权利要求 4 所述的一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法， 其特征在 于步骤 （3） 中所述的冻存程序如下 ： 以 1.0 / 分钟降至 -3.0 ， 然后以 10.0 / 分钟降 至-20.0， 再以1.0/分钟降至-40.0， 最后以10.0/分钟降至-90.0后取出冻存 样本， 放入液氮储存罐长期保存。 权 利 要 求 书 CN 103275926 A 3 1/7 页 4 一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法 技术领域 0001。
12、 本发明涉及干细胞制备领域， 尤其是涉及一种用胎盘组织制备亚全能干细胞的方 法。 背景技术 0002 干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一， 其研究内容几乎涉及所有生命 科学的生物医学领域， 除了在细胞治疗、 组织 / 器官移植和基因治疗中发挥重要作用外， 还 在发现新基因、 基因功能分析、 发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。 亚全能干 细胞 (sub-totipotent stem cells) 是来源于成熟胎盘组织中的干细胞， 具有高度自我更 新能力和多向分化潜能， 是细胞移植和组织工程的新型种子细胞， 具有广阔的应用前景。 0003 亚全能干细胞作为干细胞产业中一个新兴、。
13、 更具应用前景的项目， 虽然前景光明， 但还面临着一些产业化应用的技术标准， 胎盘组织中含有多种亚全能干细胞， 其采集部位 比较多， 比如羊膜、 蜕膜、 胎盘小叶等等， 不同部位来源的亚全能干细胞的生长存在着一定 的差异， 有些部位来源的间充质干细胞生长周期比较长 ； 有些组织来源的亚全能干细胞细 胞形态差异比较大等等。 中国发明专利名称为亚全能干细胞、 其制备方法及其用途 （申请号 CN200810240040.8） 公开了一种亚全能干细胞， 其来源于剪断的人类脐带或胎盘， 细胞标志 是 CD151+OCT4+CD184-， 其在培养容器中贴壁生长， 能向人体内、 中、 外胚层组织分化， 其。
14、制 备过程要扩增到四代以上， 才能获得足够的细胞用于建立亚全能干细胞种子库， 增殖能力 较弱， 增殖速度较缓慢。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的 方法， 该亚全能干细胞均一、 稳定、 生长周期短， 操作简单， 成本低。 0005 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 一种利用胎盘小叶组织制备亚全 能干细胞的方法， 包括以下步骤 ： （1） 亚全能干细胞分离 A. 细胞悬液制备 ： 将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织， 将胎盘小叶组织剪成 0.5 1.5mm3小块， 置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后， 加入与胎盘组织等体积的浓度为。
15、 1 1.5mg/ml 的型胶原蛋白酶充分混匀， 于 37消化 0.5 2 小时后， 吸取离心管内上 清液， 将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀， 瞬间离心并吸取上清液， 重复离心操作两次， 合并上述各上清液并用 200 目无菌滤网过滤， 收集细胞初悬液 ； 将细胞初悬液于 1000 2000rpm 的转速下离心 5 20 分钟， 取离心得到的沉淀加入生理盐水定容， 得到细胞悬液 ； 在酶消化后， 反复吸取上清和过滤是为了获取单个核细胞， 去掉一些组织块， 这样可以收集 到更多的单个核细胞， 有助于细胞快速增殖， 同时细胞生长的会比较均一 ； B. 亚全能干细胞分离液的制备 ： 将细胞悬液按体积。
16、比 1 2:1 的比例缓慢加入到淋巴 细胞分离液中， 于 500 1000rpm 离心 5 20min 后， 离心管内混合液自下到上依次分层为 说 明 书 CN 103275926 A 4 2/7 页 5 红细胞层、 淋巴细胞分离液层、 单个核细胞层和生理盐水层， 吸取单个核细胞层至另一离心 管内， 加入 1.5 倍细胞悬液体积的生理盐水混匀， 于 1000 2000rpm 离心 5 20 分钟后， 将离心所得的沉淀用 0.5 倍细胞悬液体积的含 10% 胎牛血清的培养液混匀沉淀， 得到亚全 能干细胞分离液 ； （2） 亚全能干细胞培养 将亚全能干细胞分离液以 2105 10105个 /cm2。
17、的密度接种到无菌培养瓶内， 并加 入培养液， 然后置于 37、 饱和湿度、 CO2体积分数为 5% 的培养箱内开始原代培养 3 4 天 后 ； 将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉， 并重新加入相同体积的培养液， 置于上述 培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到7585%的融合度后， 倒掉无菌培养瓶内培 养液 ； 将浓度为 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 20% 培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内， 37消化 1 5 分钟后， 将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化， 拍打晃动培养瓶， 使细 胞完全脱落， 将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内， 于 1000 2000rpm 离心 5 10 。
18、分 钟， 将离心所得的沉淀用含 10% 胎牛血清的培养液混匀沉淀 ； 重复上述步骤进行二代培养， 收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞 ； （3） 亚全能干细胞冻存 将 10% 胎牛血清的培养液和 99% 二甲基亚砜 （DMSO） 按体积比 3:1 缓慢混匀后配置成 冻存液， 放入冰水混合物中预冷 15 20min， 将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细 胞的冻存管中， 将冻存管放入程控降温仪进行预冷， 开始冻存程序， 将温度降至 -90.0后 取出冻存样本， 放入液氮储存罐长期保存。 0006 步骤 （1） 中所述的胎盘预处理过程具体为 ： 将胎盘置于无菌钢化皿内， 加入生理 。
19、盐水充分浸泡后， 除去胎盘表面与脐带连接处的结缔组织， 剪取胎盘小叶组织放入培养皿 内， 用无菌生理盐水清洗 3 5 次。 0007 所述的培养液配置方法如下 （成分单位 mg/L） ： 无水氯化钙 245.0， 五水硫酸铜 0.0013， L- 亮氨酸 59.05， 亚油酸 0.042， 生素 B12 0.65， 1,4- 丁二胺二盐酸盐 0.061， L- 赖 氨酸盐酸盐 91.25， 硫辛酸 0.105， 定二酸 75.00， 九水硝酸铁 0.05， L- 蛋氨酸 17.24， 酚红 9.30 七水硫酸亚铁 0.41， L- 苯丙氨酸 35.48， 氯化钾 400.00， L- 丝氨酸 。
20、42.00， 丙酮酸钠 55， 氯化镁 27.05， L- 苏氨酸 53.45， 维生素 H 0.0035， 无水硫酸镁 48.82， L- 丙氨酸 4.60， D-泛酸钙2.24， 氯化钠6400.00， L-天门冬酰胺7.5， 氯化胆碱8.98， 无水磷酸二氢钠54.2， L- 天门冬氨酸 8.65， 叶酸 4.00， 磷酸氢二钠 71.02， L- 半胱氨酸盐酸盐 16.56， 肌醇 12.6， L-谷氨酸7.35， 烟酰胺2.02， L-精氨酸盐酸盐147.5， L-脯氨酸17.25， 盐酸吡哆醛2， L-胱 氨酸盐酸盐 31.25， L- 色氨酸 9.02， 盐酸吡哆醇 0.031，。
21、 L- 酪氨酸 38.4， 核黄素 0.219， 甘 氨酸 18.75， L- 缬氨酸 52.85， 盐酸硫胺 2.17， L- 组氨酸盐酸盐 31.46， D- 葡萄糖 1000.00， 胸苷 0.365， L- 异亮氨酸 54.47， 次黄嘌呤 3， 成纤维细胞生长因子 （BFGF） 0.01， 维生素 C 0.89， L- 谷氨酰胺 325。使用上述方法配制的专门用于培养胎盘亚全能干细胞的培养液， 经 过培养能获得大量胎盘亚全能干细胞， 所获得的干细胞各方面性能才能达本发明所述的效 果， 包括传代能力、 扩增能力 （如 P2 代就能得到足够多的细胞数量用于建亚全能干细胞种 子库） 、 诱。
22、导分化成其他组织的能力等。 0008 步骤 （3） 中所述的冻存程序如下 ： 第一步 1 12， 等待 ； 第二步 0.5 1.2 / 分钟降至 0 -4 ； 第三步 5 12 / 分钟降至 -15 -25 ； 第四步 0.5 1.2 / 分 说 明 书 CN 103275926 A 5 3/7 页 6 钟降至 -35 -45； 第五步 5 12 / 分钟降至 -80 -90后取出冻存样本， 放入液氮 储存罐长期保存。 0009 本发明采用程控降温仪通过设定适合于胎盘亚全能干细胞冻存的降温速度程序 对干细胞进行冻存。在细胞冻存的过程中， 液态水转化为冰， 细胞代谢停止， 同时， 水分也 随之散。
23、失， 导致细胞内盐、 代谢物浓度改变， 进而造成渗透压失衡， 直接影响细胞复苏后活 性。过快或过慢降温都不是合适的方法， 冷冻速率太快， 细胞内冰晶形成， 破坏细胞内超微 结构 ； 冷冻速率太慢， 细胞外冰晶形成， 容易导致细胞严重脱水皱缩而死亡， 两者都不利于 细胞存活。不同细胞冷冻在各个温度区域有最适合的降温速度。通过使用合适的降温速度 程序， 将冷冻程序分成多段进行， 可安全而迅速地过度冷冻损害温度区以保持干细胞复苏 后的活性。 0010 上述冻存程序选优如下 ： 以 1.0 / 分钟降至 -3.0 ， 然后以 10.0 / 分钟降 至-20.0， 再以1.0/分钟降至-40.0， 最后。
24、以10.0/分钟降至-90.0后取出冻存 样本， 放入液氮储存罐长期保存。 0011 与现有技术相比， 本发明的优点在于 ： 本发明公开了一种利用胎盘组织制备亚全 能干细胞的方法， 包括干细胞的分离、 培养和冻存， 采用胎盘小叶作为提取干细胞的组织来 源， 小叶组织来源的亚全能干细胞均一、 稳定、 生长周期短， 节约亚全能干细胞的制备成本。 0012 本发明采用多次离心和过滤的干细胞分离技术， 能够收集到更多的单个核细胞， 去掉尽量多的组织块， 有利于细胞快速增殖， 同时提高细胞生长的均一性。 0013 本发明中干细胞分离技术中所使用的酶是型胶原蛋白酶， 用型胶原蛋白酶解 离胎盘小叶组织细胞的。
25、时候解离细胞的效果比较好。 0014 本发明分离技术中采用了淋巴细胞液作为分离液， 有效分隔了红细胞和单个核细 胞， 大大加强了分离效果。 未加入淋巴细胞液之前， 离心以后， 红细胞层贴着单个核细胞层， 很难分离到纯净的单个核细胞， 影响到最后的培养。加入淋巴液之后， 经过离心， 淋巴细胞 分隔了红细胞层和单个核细胞， 容易得到纯净的单个核细胞， 有利于后期的分离培养。 0015 采用本发明的干细胞分离技术结合本发明的专门针对亚全能干细胞配置的培养 液， 培养后的细胞传代至 P2 代就能得到足够数量的干细胞用于储存。干细胞传代代数越 小， 细胞的扩增能力、 活力、 状态以及诱导分化成其他组织的。
26、能力都越好， 而现有技术 （专利 CN200810240040.8） 要扩增到四代以上， 才能获得足够的细胞用于建立亚全能干细胞种子 库， 增殖能力较弱， 增殖速度较缓慢， 而且由于传代代数的增加， 使干细胞各方面的性能大 打折扣。 0016 本发明得到的胎盘亚全能干细胞的 CD73、 CD90、 CD105、 CD151、 CD200、 Oct-4、 HLA-G 表达率均在 90% 以上， 而 CD14、 CD45、 CD79、 HLA-DR、 CD184 表达率均在 2% 以下， 说明我们 分离得到的是胎盘亚全能干细胞而不是其他细胞。 0017 本发明的干细胞经集落培养后， 形成的集落种类。
27、较多， 比如 ： CFU-E( 红细胞形成 单位 )、 CFE-G（粒细胞集落形成单位） 、 CFU-GEMM( 粒细胞、 红细胞、 巨噬细胞、 巨核细胞集 落形成单位 )、 CFU-GM（粒细胞、 巨噬细胞 - 集落形成单位） 、 CFU-M（巨细胞 - 集落形成单 位） ， 并且形成的集落数较多。 0018 本发明得到的胎盘亚全能干细胞传代能力可达 20 代， 不仅具有向成骨、 软骨、 脂 肪和神经细胞分化的能力， 还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力。 说 明 书 CN 103275926 A 6 4/7 页 7 0019 综上所述， 本发明是一种实用简单的从胎盘小叶组织中大量分离胎盘亚。
28、全能干细 胞的方法， 操作简单， 方便实用， 能得到大量的亚全能干细胞。 具体实施方式 0020 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例 0021 一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法， 具体包括以下步骤 ： 1、 亚全能干细胞分离 1.1 胎盘预处理 征得产前检查正常 （无病毒感染、 怀孕期无异常情况） 的产妇同意并签署 知情同意书 后， 从医院产科取回脱离母体 24 小时之内的胎盘， 进入实验室备用 ； 在百级层流室内， 将胎盘置于无菌钢化皿内， 加入生理盐水充分浸泡后， 除去胎盘表面 与脐带连接处的结缔组织， 剪取胎盘小叶组织放入培养皿内， 用无菌生理盐水清洗 3 5。
29、 次 ； 1.2 细胞悬液制备 将胎盘小叶组织剪成 0.5 1.5mm3小块， 置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后， 加入与胎盘组织等体积的浓度为 1 1.5mg/ml 的型胶原蛋白酶充分混匀， 于 37消化 0.5 2 小时后， 吸取离心管内上清液， 将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀， 瞬间离心并 吸取上清液， 重复离心操作两次， 合并上述各上清液并用 200 目无菌滤网过滤， 收集细胞初 悬液 ； 将细胞初悬液于 1000 2000rpm 的转速下离心 5 20 分钟， 取离心得到的沉淀加入 生理盐水定容， 得到的细胞悬液 ； 在酶消化后， 反复的吸取上清和过滤是为了收集更多的单 个核细。
30、胞， 去掉一些组织块， 这样可以收集到更多的单个核细胞， 有利于细胞快速增殖， 同 时细胞生长会比较均一 ； 1.3 亚全能干细胞分离液的制备 将细胞悬液按体积比12:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中， 于5001000rpm 离心 5 20min 后， 离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、 淋巴细胞分离液层、 单 个核细胞层和生理盐水层， 吸取单个核细胞层至另一离心管内， 加入 1.5 倍细胞悬液体积 的生理盐水混匀， 于 1000 2000rpm 离心 5 20 分钟后， 将离心所得的沉淀用 0.5 倍细胞 悬液体积的培养液混匀沉淀， 得到亚全能干细胞分离液。 0022 2、 亚全。
31、能干细胞培养 （1）用无菌移液枪头吸取 20ul 细胞悬液， 显微镜下计数， 根据细胞计数结果， 以 210510105个/cm2的密度， 将细胞悬液接种到数个T75无菌培养瓶内， 并每瓶加入培 养液至 15ml 左右 ； 其中所述的培养液配置方法如下 （成分单位 mg/L） ： 无水氯化钙 245.0， 五水硫酸铜 0.0013， L- 亮氨酸 59.05， 亚油酸 0.042， 生素 B12 0.65， 1,4- 丁二胺二盐酸盐 0.061， L- 赖氨酸盐酸盐 91.25， 硫辛酸 0.105， 定二酸 75.00， 九水硝酸铁 0.05， L- 蛋氨酸 17.24， 酚红 9.30 七。
32、水硫酸亚铁 0.41， L- 苯丙氨酸 35.48， 氯化钾 400.00， L- 丝氨酸 42.00， 丙酮酸钠 55， 氯化镁 27.05， L- 苏氨酸 53.45， 维生素 H 0.0035， 无水硫酸镁 48.82， L- 丙氨 酸 4.60， D- 泛酸钙 2.24， 氯化钠 6400.00， L- 天门冬酰胺 7.5， 氯化胆碱 8.98， 无水磷酸二 说 明 书 CN 103275926 A 7 5/7 页 8 氢钠 54.2， L- 天门冬氨酸 8.65， 叶酸 4.00， 磷酸氢二钠 71.02， L- 半胱氨酸盐酸盐 16.56， 肌醇 12.6， L- 谷氨酸 7.35。
33、， 烟酰胺 2.02， L- 精氨酸盐酸盐 147.5， L- 脯氨酸 17.25， 盐酸吡 哆醛 2， L- 胱氨酸盐酸盐 31.25， L- 色氨酸 9.02， 盐酸吡哆醇 0.031， L- 酪氨酸 38.4， 核黄 素 0.219， 甘氨酸 18.75， L- 缬氨酸 52.85， 盐酸硫胺 2.17， L- 组氨酸盐酸盐 31.46， D- 葡萄 糖 1000.00， 胸苷 0.365， L- 异亮氨酸 54.47， 次黄嘌呤 3， 成纤维细胞生长因子 （BFGF） 0.01， 维生素 C 0.89， L- 谷氨酰胺 325 ； (2) 将 T75 无菌培养瓶置于 37、 饱和湿度、。
34、 CO2体积分数为 5% 的 CO2培养箱内， 开始 原代培养 ； 原代培养开始 3 天后， 取出 T75 无菌培养瓶到百级层流室内， 将瓶中培养液和未 贴壁的细胞倒掉， 并重新加入 15ml 培养液， 置于 CO2培养箱内继续培养 ； 3) 每天在显微镜下观察细胞形态， 细胞达到 75 85% 的融合度时， 取出 T75 无菌培养 瓶到百级层流室内， 将 T75 无菌培养瓶内培养液倒入 50ml 无菌离心管内 ； (4) 向 T75 无菌培养瓶内加入 3ml 的 0.25% 的胰蛋白酶溶液， 37消化 1 5 分钟后， 将无菌培养液内的培养液倒入培养瓶内终止消化， 拍打晃动培养瓶， 使细胞完。
35、全脱落 ； (5) 将完全脱落的细胞和培养液再次倒入离心管内， 1000 2000rpm 离心 5 10 分 钟 ； (6) 离心后去除上清， 用 10ml 含 10% 胎牛血清的培养液混匀沉淀 ； (7）用无菌移液枪头吸取 20ul 细胞悬液， 显微镜下计数， 根据细胞计数结果， 以 210510105个/cm2的密度， 将细胞悬液接种到数个T75无菌培养瓶内， 并每瓶加入培 养液至 15ml 左右 ； （8） 将 T75 无菌培养瓶标记为 P1， 置于 37、 饱和湿度、 体积分数为 5% 的 CO2培养箱 内开始培养 3-4 天 ； （9） 重复步骤 （3） （8） ， 进行 P2 代细。
36、胞培养， 收集 P2 代培养过程中完全脱落细胞即得 到亚全能干细 ； 由于 P1 代得到的细胞量太少， 需要进行 P2 代细胞培养以得到更多的细胞。 0023 3、 亚全能干细胞冻存 将 3mL 含 10% 胎牛血清的培养液， 1mL 99% 二甲基亚砜 （DMSO） 缓慢混匀后配置成冻存 液， 放入冰水混合物中预冷1520min， 将预冷过的5mL冻存液慢加入到含有亚全能干细胞 的冻存管中， 将冻存管放入程控降温仪进行预冷， 开始冻存程序， 冻存程序如下 ： 第一步 1 12， 等待 ； 第二步 0.5 1.2 / 分钟降至 0 -4 ( 箱体 ) ； 第三步 5 12 / 分钟降至 -15。
37、 -25 ( 箱体 ) ； 第四步 0.5 1.2 / 分钟降至 -35 -45 ( 箱体 ) ； 第五步 5 12 / 分钟降至 -80 -90 ( 箱体 ) ； 第六步 结束后取出冻存样本， 放入液氮储存罐长期保存。 0024 上述冻存程序可优选如下 ： 以 1.0 / 分钟降至 -3.0 ， 然后以 10.0 / 分钟降 至-20.0， 再以1.0/分钟降至-40.0， 最后以10.0/分钟降至-90.0后取出冻存 样本， 放入液氮储存罐长期保存。 0025 4、 亚全能干细胞鉴定 （1） 流式细胞仪检测干细胞表面标志物 ： 将上述亚全能干细胞培养的步骤 （10） 收集的 亚全能干细胞用。
38、 5ml PBS 缓冲液混匀， 用 PBS 缓冲液洗涤并离心 2 次， 鼠抗人 CD14、 CD45、 说 明 书 CN 103275926 A 8 6/7 页 9 CD73、 CD105、 HLA-G、 HLA-DR、 CD90、 CD79、 CD151、 CD200、 Oct-4、 CD184 单克隆抗体细胞 悬液 4避光孵育 30min， PBS 缓冲液洗涤并离心 3 次后， 流式细胞仪检测分析结果， 发现 CD73、 CD90、 CD105、 CD151、 CD200、 Oct-4、 HLA-G表达率均在90%以上， 而CD14、 CD45、 CD79、 HLA-DR、 CD184 表。
39、达率均在 2% 以下。 0026 （2） 成骨细胞诱导 ： 向上述亚全能干细胞培养的步骤 （3） 中达到 80% 左右细胞融合 度的培养瓶中加入成骨诱导培养基， 在 37、 饱和湿度、 体积分数为 5% 的 CO2培养箱内培 养， 每 3 天换液。21 28 天后， 进行茜素红染色， 出现大量黑色的 ALP 阳性成骨细胞， 证明 亚全能干细胞可向成骨细胞分化。 0027 （3） 成脂肪细胞诱导 ： 向上述亚全能干细胞培养的步骤 （3） 中达到 80% 左右细胞融 合度的培养瓶中加入成脂诱导培养基， 在 37、 饱和湿度、 体积分数为 5% 的 CO2培养箱内 培养， 每3天换液。 1421天后。
40、， 弃培养液， 在倒置相差显微镜下观察细胞质中脂滴状态并 用油红O染色， 出现大量红色的油红O染色阳性脂肪细胞， 证明亚全能干细胞可向脂肪细胞 分化。 0028 （4） 成神经元样细胞诱导 ： 向上述亚全能干细胞培养的步骤 （3） 中达到 80% 左右细 胞融合度的培养瓶中加入 2 DMSO、 100umol/L BHA 和 10ng/ml b-FGF 诱导， 在 37、 饱和 湿度、 体积分数为 5% 的 CO2培养箱内培养， 培养细胞在诱导分化 1 天后采用常规方法免疫 细胞化学染色， 发现 60% 以上的细胞神经元细胞标志物 NSE、 NF 为阳性， 证明亚全能干细胞 可向神经元细胞分化。
41、。 0029 （5） 成胰岛样细胞诱导 ： 向上述亚全能干细胞培养的步骤 （3） 中达到 80% 左右细胞 融合度的培养瓶中加入 10ug/L 碱性成纤维细胞生长因子、 尼克酰胺诱导， 双硫腙染色后镜 检， 发现胰腺细胞标志物 PDX-1、 Ngn3 呈不同程度的阳性， 证明亚全能干细胞可向胰腺细胞 分化。 0030 （6） 成表皮细胞诱导 ： 向上述亚全能干细胞培养的步骤 （3） 中达到 80% 左右细胞 融合度的培养瓶中加入 20g/L 表皮细胞生长因子， 常规培养 7 天， 每 2 天半量换液 1 次， 诱导细胞免疫荧光染色分析， 发现表皮细胞标志物 CK19、 CK10 呈不同程度的阳。
42、性， 证明亚 全能干细胞可向表皮细胞分化。 0031 集落培养 ： 将上述亚全能干细胞培养的步骤 （10） 中收集的亚全能干细胞用甲基 纤维素做集落培养， 发现形成的集落种类较多， 比如 ： CFU-E( 红细胞形成单位 )、 CFE-G（粒 细胞集落形成单位） 、 CFU-GEMM( 粒细胞、 红细胞、 巨噬细胞、 巨核细胞集落形成单位 )、 CFU-GM（粒细胞、 巨噬细胞 - 集落形成单位） 、 CFU-M（巨细胞 - 集落形成单位） ， 并且形成的 集落数较多， 细胞贴壁生长可达 20 代。 0032 上述细胞悬液制备过程中， 胎盘小叶组织可剪成 0.5mm3、 1mm3或 1.5mm。
43、3小块 ； 型胶原蛋白酶浓度可为 1mg/ml、 1.2mg/ml 或 1.5mg/ml ； 细胞初悬液于 1500rpm 的转速下离 心 12 分钟或者细胞初悬液于 1000rpm 的转速下离心 20 分钟或者细胞初悬液于 2000rpm 的 转速下离心 5 分钟。 0033 上述亚全能干细胞分离液的制备过程中， 细胞悬液与淋巴细胞分离液的体积比为 1:1、 1.5:1 或者 2:1 ； 两者混合后于 500rpm 离心 20min、 750rpm 离心 15min 或者 1000rpm 离 心 5min ； 吸取单个核细胞层至另一离心管内， 加入 1.5 倍细胞悬液体积的生理盐水混匀， 于。
44、 于 1000rpm 离心 20min、 1500rpm 离心 15min 或者 2000rpm 离心 5min。 说 明 书 CN 103275926 A 9 7/7 页 10 0034 上述亚全能干细胞培养过程中， 细胞融合度可达 75%、 80% 或者 85% ； 加入胰蛋白 酶溶液的消化时间可为 1、 3 或 5 分钟 ； 将完全脱落的细胞和培养液再次倒入离心管内， 于 1000rpm 离心 10 分钟、 1500rpm 离心 7.5 分钟或者 2000rpm 离心 5 分钟 ； 上述说明并非对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术 人员在本发明的实质范围内， 作出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护范围， 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说 明 书 CN 103275926 A 10 。