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1、(10)申请公布号 CN 103173466 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173466 A *CN103173466A* (21)申请号 201210210421.8 (22)申请日 2012.06.20 CCTCC NO:M208133 2012.05.10 C12N 15/31(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 13/10(2006.01) C12R 1/15(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 饶志明 许正宏。
2、 徐美娟 孙红梅 窦文芳 (54) 发明名称 敲除脯氨酸合成途径提高钝齿棒杆菌精氨酸 产量的方法 (57) 摘要 L- 精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性 氨基酸， 具有多种独特的生理和药理作用。本发 明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基 因进行敲除。以钝齿棒杆菌基因组为模板， 分别 以 proB 基因上下游引物进行 PCR 扩增， 利用重叠 PCR 扩增获得缺失型基因 proB 。连接重组质粒 pK18mobsacB-proB 电击转化进入钝齿棒杆菌， 筛 选二次同源重组基因缺失型菌株。将上述重组菌 钝齿棒杆菌 proB 进行摇瓶发酵实验， 钝齿棒杆 菌中 proB 基因的功能缺失， 。
3、使得脯氨酸合成的能 力大大降低， 同时提高了糖耗， 发酵液中脯氨酸的 积累量只有对照菌株的 2.7， 从而使目标氨基 酸 L- 精氨酸产量提高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103173466 A CN 103173466 A *CN103173466A* 1/1 页 2 1. 一种脯氨酸合成关键酶缺失型基因 proB， 其特征是 ： 以保藏编号为 CCTCC NO ： M208133的C.crenatu。
4、m SYPA菌株DNA为模板， 通过重叠PCR法将获得来自钝齿棒杆菌SYPA 的脯氨酸合成关键酶基因 proB 中的了 352 个核苷酸碱基缺失 ； 重叠 PCR 的引物序列为 ： 第 一轮 PCR 引物序列 ： PproBF EcoRI 5 -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGC PproBR SalI 5 -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC 第二轮 PCR 引物序列 ： PproB R 5 -CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATC PproB F 5 -TGTTTAAGTTT。
5、AGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT。 2. 一株重组钝齿棒杆菌 SYPA 5-5proB， 其特征是将权利要求 1 所述的缺失 proB 基因利用电转化的方法通过同源重组整合至钝齿棒杆菌 SYPA 5-5 染色体中获得。 3. 一种利用权利要求 2 中所述的重组钝齿棒杆菌发酵生产精氨酸的方法， 其特征在于 该菌株的脯氨酸的合成显著降低， L- 精氨酸的产量显著提高。 权 利 要 求 书 CN 103173466 A 2 1/4 页 3 敲除脯氨酸合成途径提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及工业微生物生产精氨酸的方法。。
6、 更具体的， 本 发明涉及基因工程重组钝齿棒杆菌生产精氨酸的方法。 背景技术 0002 L- 精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸， 是合成蛋白质肌酸的重要原 料， 也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物， 具有多种独特的生理和药理作用。 L-精 氨酸在临床医药、 食品、 化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前 L- 精氨 酸商业化生产比较有效和经济的方法。 0003 随着我国医药营养水平的提高， 对精氨酸的需求日益增长， 但传统生产 L- 精氨 酸的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得， 但此法有盲目性高、 工作量大， 且存在突变 株生理失调、 易退化等局限性 ； DNA 重。
7、组技术出现以后， 人们开始探索利用 DNA 重组技术调 控合成精氨酸代谢途径， 以达到提高精氨酸产量的目的。钝齿棒杆菌 (Corynebacterium crenatum) 是我国研究者分离到的一种钝齿状、 无芽孢的革兰式阳性菌， 其突变株在国内氨 基酸生产中被广泛应用， 但对其遗传背景的研究还处于空白状态。 C.crenatum SYPW是本实 验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株 ( 菌株的保藏编号为 CCTCC NO ： M208133)， SYPA 5-5 是此菌株经过传代 5 次后得到的菌株， 其菌株特性在传代中与 SYPW 保持一致。 0004 对氨基酸生产菌株代谢途径及代谢网络进行有。
8、目的的改造从而提高氨基酸的产 量是现代工业生物技术的一个主攻目标。对目标菌株进行遗传改造时， 经常涉及到多个 基因的连续敲除， 利用枯草杆菌中 sacB 基因作为一个条件致死型标记， 携带抗生素抗性与 sacB 双标记的新型整合型载体 pK18mobsacB， 对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实现了多基因 的无痕敲除及基因替代， 促进了棒杆菌属的一系列菌株的遗传改造， 为棒杆菌代谢工程改 造提供了良好的遗传改造手段。 发明内容 0005 本发明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除， 以增强目标产 物精氨酸合成途径关键酶基因簇表达的同时， 削弱脯氨酸合成竞争支路途径的代谢流， 最 终使 。
9、L- 谷氨酸分解代谢集中在 L- 精氨酸的合成代谢流从而进一步提高精氨酸的产量。 0006 通过对 L- 精氨酸合成代谢途径的分析， 代谢工程改造 L- 精氨酸生产菌株的另一 育种方案就是削弱葡萄糖 L- 谷氨酸 L- 精氨酸代谢相关竞争途径中的分支代谢流， 使 得更多的代谢流向合成 L- 精氨酸及其前体物 L- 谷氨酸。在钝齿棒杆菌 L- 精氨酸的合成 代谢途径中， 以葡萄糖为底物， 经过 TCA 循环中的 - 酮戊二酸合成 L- 谷氨酸， 在基因簇 argCH 编码的 7 个酶的催化下合成 L- 精氨酸。而 L-Glu 除作为合成 L- 精氨酸的前体物， 其代谢流还可以向 L- 脯氨酸和 。
10、L- 谷氨酰胺合成。对 C.crenatum SYPA( 相关菌株的保藏 编号为 CCTCC NO ： M208133) 发酵 L- 精氨酸来说， 应削弱旁路代谢流量而集中葡萄糖经 TCA 循环中的 - 酮戊二酸 L- 谷氨酸 L- 精氨酸的代谢流量， 因此本发明将对 L- 精氨酸合 说 明 书 CN 103173466 A 3 2/4 页 4 成相关竞争途径脯氨酸的合成进行敲除， 根据模式菌株谷氨酸棒杆菌全基因组中 proB 基因 (GenBank No.BA000036.3) 设计钝齿棒杆菌中 L- 脯氨酸合成 proB 基因的敲除， 从而 提高了钝齿棒杆菌发酵产 L- 精氨酸的产量而完成。
11、了本发明， 目前相关研究暂无报道。 0007 技术方案如下 ： 0008 (1)以钝齿棒杆菌基因组为模板， 分别以proB基因上下游引物进行PCR扩增， 其引 物序列如下 ： 0009 PproBF EcoRI 5 -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGC 0010 PproBR SalI 5 -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC 0011 PCR 获得长为 1,100bp 的目标特异产物， 经纯化后与 pMD18-T 连接， 转化 JM109， 提 取质粒， 酶切验证并测序。 0012 (2) 设计引物利用重叠 PCR 的方法扩增缺。
12、少了 300 500bp 的缺失型基因 proB ， 引物序列如下 ： 0013 PproB R5 -CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATC 0014 P proB F 5 -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT 0015 经两轮重叠 PCR 获得核苷酸片段经琼脂糖凝胶电泳检测， 图 1 所示为含同源片段 proB 与理论大小一致， 缺失片段构建成功 ； 将目的片段 proB 与 pK18mobsacB 线性化载体 相连构建重组质粒， 转化 E.coli JM109， 并挑取阳性转化子。 001。
13、6 (3) 将经酶切验证后质粒 pK18mobsacB-proB电击转化进入钝齿棒杆菌， 经 1800V， 5ms 电击后涂布于含有 LBG+Km 固体培养基平板上， 30培养 24 36h， 第一次同源 重组转化子长出。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选， 最终 在 LBG 平板上进行划线分离并挑取多个转化子， 通过 PCR 对发生第二次同源重组的菌株进 行回复野生型 / 基因缺失型的鉴定。 0017 (4) 发生二次同源重组后缺失了 200-300bp 的 proB 具有约 50的几率替代原 基因组中具有功能的 proB， 因此， 在上述 LBG 平板中随即挑取转化子。
14、， 提取染色体为模板， 以目标基因 proB 的上下游引物进行 PCR 扩增， PCR 鉴定结果如图 2 所示。经 PCR 验证， 第 3、 5 泳道对应的转化子为基因缺失型钝齿棒杆菌 proB。 附图说明 0018 图 1 含同源臂片段的缺失型基因 proB 的 PCR 扩增图 0019 图 2 二次重组菌株的基因缺失型和回复野生型转化子 proB PCR 鉴定 0020 泳道说明 1 ： DL2000marker ； 2， 4 ： 回复突变型 proB ； 3， 5 ： 基因缺失型 proB ； 6 ： DNA/Hind III marker 0021 图 3 重组钝齿棒杆菌与原始对照菌株。
15、摇瓶发酵产酸比较分析 0022 (A) 原始对照菌株 (B) 重组钝齿棒杆菌 proB 具体实施方式 0023 实施例 1 ： 重组钝齿棒杆菌中谷氨酸激酶酶活力的检测 0024 随机选择上述验证的 proB 基因缺失型转化子在种子培养基中培养至对数生长 期， 收集菌体经超声波破碎后测定胞内谷氨酸激酶酶活 ： 以 L- 谷氨酸为底物， 在 pH 7.0 的 说 明 书 CN 103173466 A 4 3/4 页 5 0.25mL 体系中加入 50mM L- 谷氨酸， 10mM ATP， 20mM MgCl2， 100mM 盐酸羟氨， 50mM Tris， 加 入 200L 粗酶液， 充分混匀后。
16、置于 37， 30min 反应。加入含三氯乙酸的 FeCl3反应终止 液 1mL， 3,500g 低速离心后取上清液于 535nm 下测定 - 谷氨酸氧肟酸的吸光值。1U 定义 为每分钟生成 1mol 氧肟酸盐所需的酶量。与对照菌钝齿棒杆菌 SYPA 5-5 相比， 转化子 粗酶液中基本测不到 proB 编码的谷氨酸激酶酶活力， 确定了重组菌 SYPA 5-5proB 失去 由谷氨酸激酶催化谷氨酸磷酸化合成 L- 谷氨酸 -5-P 的功能。 0025 实施例 2 ： 重组钝齿棒杆菌 proB 转化子摇瓶发酵产 L- 精氨酸 0026 种 子 培 养 基 (g/L) ： 葡 萄 糖 30， 玉 。
17、米 浆 20， 尿 素 1.5， KH2PO41， (NH4)2SO420， MgSO47H2O 0.5 ； pH 为 7.0 7.2， 装液量 30mL/250mL， 121灭菌 20min。 0027 发酵培养基 (g/L) ： 葡萄糖 150( 分消 )， 玉米浆 40， 生物素 810-5， L- 组氨酸 510-4， MnSO4H2O 0.02， (NH4)2SO420， MgSO47H2O 0.5， KH2PO41.5， FeSO47H2O 0.02， CaCO330( 分消灭菌 )。pH 为 7.0 7.2， 装液量 25mL/250mL， 121灭菌 10min。 0028 将。
18、上述经酶活验证的重组菌钝齿棒杆菌 SYPA 5-5proB 进行摇瓶发酵实验， 从 新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环钝齿棒杆菌 ( 对照菌及重组菌 ) 于种子培养基中 (30mL/250mL)， 30， 220r/min往复式摇床培养1416h， 至OD0.6时， 以5接种量， 发 酵 96h 其 L- 精氨酸产量比对照菌株钝齿棒杆菌 SYPA 5-5 显著提高， 提高率为 20.4。 0029 实施例 3 ： 重组钝齿棒杆菌 proB 转化子 5L 发酵罐发酵产酸 0030 种 子 培 养 基 (g/L) ： 葡 萄 糖 30， 玉 米 浆 20， 尿 素 1.5， KH2PO41， (NH。
19、4)2SO420， MgSO47H2O 0.5 ； pH 为 7.0 7.2， 装液量 30mL/250mL， 121灭菌 20min。 0031 发酵培养基 (g/L) ： 葡萄糖 150( 分消 )， 玉米浆 40， 生物素 810-5， L- 组氨酸 510-4， MnSO4H2O 0.02， (NH4)2SO420， MgSO47H2O 0.5， KH2PO41.5， FeSO47H2O 0.02， CaCO330( 分消灭菌 )。pH 为 7.0 7.2， 装液量 25mL/250mL， 121灭菌 10min93。 0032 5L 自控发酵罐分批发酵条件 ： 5L 发酵罐中装液量 。
20、3L， 接种量采用 5， 30， 通气 量为 3L/min， 自动流加氨水以控制 pH 在 6.8， 采用工厂发酵 L- 精氨酸专用消泡剂， 溶氧自 动控制， 搅拌转速为 600r/min， 发酵 96h。 0033 结果表明 ： 钝齿棒杆菌中 proB 基因的功能缺失， 使得脯氨酸合成的能力大大降 低， 发酵液中脯氨酸的积累量只有对照菌株的 2.7， 同时提高了糖耗， 使得精氨酸产量提 高， 其中精氨酸产量提高了 13.6。 0034 经氨基酸分析仪测定其发酵液中各游离氨基酸含量， 如图 3、 表 1 所示。 0035 表 1 发酵液中残糖、 生长量和各氨基酸含量分析 0036 说 明 书 CN 103173466 A 5 4/4 页 6 说 明 书 CN 103173466 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103173466 A 7 。