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1、(10)申请公布号 CN 103146844 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146844 A *CN103146844A* (21)申请号 201310082099.X (22)申请日 2013.03.14 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 崔治中 马诚太 赵鹏 (74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人 郑明 (54) 发明名称 猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒 兔化弱毒核酸探针试剂盒 (57。
2、) 摘要 本发明涉及建立一种猪瘟活疫苗中病毒含量 测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒。 本发明采用 PCR 法制备 HCLV 特异性地高辛标记 的 DNA 探针， 同时将 HCLV 疫苗梯度稀释后接种 于 24 孔培养板上的 ST 细胞中， 在培养 7 天后分 别从接种各稀释度的不同孔细胞中提取 RNA 后， 用 RT-PCR 结合斑点杂交的方法检测病毒感染。 应用该方法能很好的对疫苗病毒实施以 TCID50 为单位的准确定量， 多次重复实验发现对同一批 次疫苗间定量的重复性好， 相互结果相差不大 （5.3104TCID50/ 头 份、 3.0104TCID50/ 头 份、 3.0104。
3、TCID50/头份） 。 本发明技术方案的实验结 果表明 RT-PCR 结合斑点杂交定量方法能准确、 完 全的对疫苗 HCLV 定量， 值得推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146844 A CN 103146844 A *CN103146844A* 1/1 页 2 1. 一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法， 其特征在于 ： （1） 是以 HCLV-E2 基因片段质粒为模板， 用序列。
4、 1 和序列 2 所述序列的引物 HCLV-F1/ HCLV-R1 进行扩增， 采用地高辛标记技术将扩增产物制备成地高辛标记 HCLV-E2DNA 探针 ； （2） 以从 24 孔培养板上的被不同稀释度猪瘟活疫苗感染的 ST 细胞提取的 RNA 为模板 用序列 3 和序列 4 所述序列的一对引物 HCLV-F2/HCLV-R2 进行 RT-PCR ； （3） 通过斑点杂交， 根据在硝酸纤维膜点样后的显色， 狄高辛标记的特异性核酸探针可 检测经猪瘟活疫苗感染的 ST 细胞中猪瘟兔化弱毒病毒的特异性核酸的 RT-PCR 产物存在 ； （4） 根据不同稀释度样本在硝酸纤维膜点样后的显色反应， 计算疫。
5、苗中以 TCID50/ 头份 为单位的猪瘟兔化弱毒病毒的含量。 2. 如权利要求 1 所述一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法的应用， 其特征在于用该 方法测定的以 TCID50/ 头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效价检验 的质量标准。 3. 一种实施权利要求 1 猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异 性核酸探针试剂盒， 其特征在于该试剂盒含有 ： （1） 经狄高辛标记的 HCLV-E2DNA 探针 ； （2） 未感染的正常 ST 细胞提取 RNA 的 RT-PCR 产物做为阴性对照和猪瘟兔化弱毒病毒 感染的 ST 细胞提取 RNA 的 RT-PCR 产物做为阳。
6、性对照 ； （3） 用于样品 RNA 扩增的一对特异性引物， 其序列如序列 3、 序列 4 所示 ； （4） 硝酸纤维膜、 封闭试剂、 NCPI 溶液、 NBT 溶液和 20SSC 溶液。 4. 如权利要求 3 所述一种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用， 其特征在于该 试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品检验中的效价检验。 5. 如权利要求 3 所述一种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用， 其特征在于该 试剂盒可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。 权 利 要 求 书 CN 103146844 A 2 1/10 页 3 猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸 探针试剂盒 技术领域 0。
7、001 本发明涉及一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针 试剂盒， 属于兽用生物制品制造领域。 背景技术 0002 猪瘟 （classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒 （classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、 热性和高度接触性传染病， HCL 在世界养猪国家有不同 程度流行， 被世界动物卫生组织 (OIE) 列为法定报告动物疫病， 我国将其列为一类动物 疫病 （王琴 . 猪瘟病毒流行病学、 病原致病特性及猪瘟综合防制研究 . 中国农业科技导 报， 2006， 8(5) ： 13-18） 。HCLV 是黄病毒科。
8、 （Flaviviridae）瘟病毒属 （Pestivirus）的一 个成员。病毒基因组为单股正链 RNA， 全长 12.3kb， 包括一个大的 ORF， 编码由 3898 个 氨基酸残基组成的多聚蛋白， 此多聚蛋白又进一步被加工成 4 个成熟的结构蛋白 （C、 E0、 E1、 E2）和 7 个 非 结 构 蛋 白 (Npro、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)（Rumenapf T,Meyers G,Stark R,et al.Molecular characterization of hog cholera virus. Arch virol Suppl.。
9、1991,3:7-18 ； Van Ri jn P A,Van Gennip H G P,Moormann R J M.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classicalswine fever(CSFV). Vaccine,1999,17:433-440） 。 0003 1955 年我国研制出用经人工诱变获得的猪瘟病毒兔化弱毒 （HCLV）株 （又称 C 株） 制备的猪瘟活疫苗， 该疫苗具有高。
10、度安全性和优良的免疫原性至今仍在世界范围内 被广泛应用 （仇华吉， 童光志， 沈荣显 . 猪瘟兔化弱毒疫苗 - 半个世纪的回顾 . 中国农业 科学， 2005， 38(8) ： 1675-1685） ， 该疫苗对控制猪瘟起到了重要作用， 在预防猪瘟方面做出 了巨大贡献。因此， 疫苗合格与否十分重要， 因此疫苗的质量也变得至关重要。检测疫苗 质量的关键指标就是疫苗的效价， 因此对疫苗的准确完全定量显得极为重要。HCLV 可以 在 PK-15、 ST 等多种细胞上生长， 但是均不产生细胞病变 （CPE） 。因此， 迄今为止对猪瘟 弱毒疫苗中的病毒含量还没有一个稳定的重复性好定量方法。在过去 60 。
11、多年中， 兔体定 型热反应法一直是对其疫苗效价测定的经典方法。但是该方法需要时间太长， 并且实验 中有很多不可控制的因素影响结果的可靠性和稳定性。特别是兔子对疫苗病毒热反应的 个体差异性会显著影响检测结果。 。但是至今却不能为该疫苗完全定量， 近年来国内外建 立了数种检测方法， 特别是荧光定量 RT-PCR 技术应用于检测 CSFV 的比较多 （温国元， 万 超 . 应用荧光定量 PCR 技术快速定量检测猪瘟病毒 . 武汉大学学报 ： 理学版， 2004， 50(6) ： 746-750 ； Hoffmann B,Beer M,Schelp C,et al.Validation of a re。
12、al-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J Virol Methods,2005,130(1-2):36-44 ； 高博， 杨晓农， 子掌辉， 等 . 快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗 株的 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 方法的建立应用 . 西南民族大学学报 ： 自然科学版， 2009， 说 明 书 CN 103146844 A 3 2/10 页 4 35(1) ： 92-97 ； 朱中武， 黄萍， 鲁杏华， 等 . 实时荧光 RT-PCR 快速检测猪源性食品中猪瘟病 。
13、毒的研究 . 中国预防兽医学报， 2009， 31(8) ： 627-630） ， 但这些方法都不是完全定量的方 法。目前建立的 Taq-Man 实时荧光定量 RT-PCR 方法可以对疫苗中的病毒核酸做定量， 并且 具有很高的灵敏度。 但是该方法不能将疫苗中的有复制能力的活病毒粒子与死亡的病毒粒 子区别开来， 不能区别具有感染力和不具有感染力的病毒， 还是没有实现对疫苗所必须的 活病毒的定量。 0004 RT-PCR 作为一种先进的生物学技术具有很高灵敏度已经被广泛应用于猪瘟病 毒病原 （罗廷荣 , 莫扬 , 吴文德 , 等 .RT-CR 技术诊断猪瘟的应用研究 . 中国预防兽医学 报 ,20。
14、03,25(3):219-222） 和其他传染源的鉴定和临床诊断， 但不能用于定量。而且该方法 同样也难以区分疫苗中具有感染力和不具有感染力的病毒。并且还容易出现非特性产物， 电泳后在凝胶成像仪下看到的条带不一定就是目的条带， 易出现假阳性。 同时， 在凝胶成像 仪下看不到目的条带也不一定就是阴性结果， 因为电泳能看到的条带最少也是 10ng 级别， 因此也容易出现假阴性， 如同本实验的结果， RT-PCR 的产物电泳后虽然除阳性对照外看不 到任何条带 . 但是如果结合斑点杂交， 结果却是不同， 不仅解决了特异性的问题， 也提高了 灵敏度。本实验标记的 HCLV-E2 基因的核酸探针可以检测到。
15、 RT-PCR 产物的 1 2pg 的水 平。 发明内容 0005 本发明建立的定量方法是先将以不同稀释度的疫苗接种于ST细胞后用RT-PCR结 合斑点杂交检测每个细胞孔的感染状态， 具有准确， 灵敏， 特异的特点， 是一个完全的定量 方法。疫苗接种于细胞后可以除去无感染力细胞的干扰， 实验中所标记的探针的重复性和 稳定性较好。斑点杂交是一种特异性强、 灵敏的检测技术， 操作简单， 结果易于判断。利用 斑点杂交对鸡传染性贫血病毒 （刘岳龙 , 崔治中 , 段玉友 .PCR 和斑点杂交检测鸡传染性贫 血病毒.中国兽医学报,1996,16(1):38-41） 、 犬瘟热病毒 （王宏俊,丁少忠.核酸。
16、探针检测 犬瘟热病毒方法的建立和初步应用 . 中国兽药杂志 .2006,40(5):19-22） 等多种病毒成功 做了相应的地高辛标记探针。地高辛是一种非放射性物质， 对人及环境没有危害。此外， 核 酸探针检测法操作简便， 一次可同时检测多个样品， 且在检测时， 对仪器的要求不高， 特别 适宜于基层的掌握和使用， 因此， 该方法不仅可以用于猪瘟兔化弱毒疫苗的定量， 也可以作 为一种猪瘟的检测方法和流行病学调查的手段在基层使用。 0006 将疫苗接种于 ST 细胞， 可以排除掉疫苗中不具有感染力的死病毒， 具有准确的特 点 ； RT-PCR可以扩增HCLV核酸片段， 具有增强敏感度的特点 ； 斑。
17、点杂交不仅敏感， 而且具有 很高的特异性， 操作简单。上世纪 90 年代本发明人就用核酸探针检出型马立克氏病毒 （崔治中 . 用非放射性 DNA 探针从感染鸡羽毛囊中检出型马立克氏病病毒 . 中国兽医科 技 ,1992,22(9):20-21） ， 因此， 本发明将三者 （接种细胞、 RT-PCR 和斑点杂交） 的优势巧妙 的结合在一起， 组成了一种对 HCLV 完全的定量方法， 该方法的特点就是准确， 敏感， 特异， 完全， 应用该方法对某疫苗公司不同批次的疫苗进行了检测， 得到了理想的结果。 0007 本发明的技术方案 0008 1. 本发明所涉及的一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法包括 。
18、： 0009 （1）是以 HCLV-E2 基因片段质粒为模板， 用序列 1 和序列 2 所述序列的引 说 明 书 CN 103146844 A 4 3/10 页 5 物 HCLV-F1/HCLV-R1 进行扩增， 采用地高辛标记技术将扩增产物制备成地高辛标记 HCLV-E2DNA 探针 ； 0010 （2） 以从 24 孔培养板上的被不同稀释度猪瘟活疫苗感染的 ST 细胞提取的 RNA 为 模板用序列 3 和序列 4 所述序列的一对引物 HCLV-F2/HCLV-R2 进行 RT-PCR ； 0011 （3） 通过斑点杂交， 根据在硝酸纤维膜点样后的显色， 狄高辛标记的特异性核酸探 针可检测经。
19、猪瘟活疫苗感染的ST细胞中猪瘟兔化弱毒病毒的特异性核酸的RT-PCR产物存 在 ； 0012 （4） 根据不同稀释度样本在硝酸纤维膜点样后的显色反应， 计算疫苗中以 TCID50/ 头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒的含量。 0013 2 本发明所述的猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法用于测定的以TCID50/头份为 单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效力检验的质量标准。 0014 3一种实施本发明猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异 性核酸探针试剂盒， 含有 ： 0015 （1） 经狄高辛标记的 HCLV-E2DNA 探针 ； 0016 （2） 未感染的正常 ST 细胞提取 。
20、RNA 的 RT-PCR 产物做为阴性对照和猪瘟兔化弱毒 病毒感染的 ST 细胞提取 RNA 的 RT-PCR 产物做为阳性对照 ； 0017 （3） 用于样品 RNA 扩增的一对特异性引物， 其序列如序列 3、 序列 4 所示 ； 0018 （4） 硝酸纤维膜、 封闭试剂、 NCPI 溶液、 NBT 溶液和 20SSC 溶液。 0019 4本发明所涉及的猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品 检验中的效价检验 ； 也可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。 具体实施方式 0020 1.HCLV-E2DNA 探针制备和探针特异性与灵敏度的检测 0021 （1） PCR 法制备地高辛标。
21、记 HCLV-E2DNA 探针 0022 以 HCLV-E2 基因片段质粒 （由中国人民解放军军事兽医研究所涂长春研究员惠 赠） 为模板， 用表 1 中的 HCLV-F1/HCLV-R1 引物扩增， 出现预期 450bp 目的条带 （图 1） 。PCR 产物经测序无误后， 回收、 纯化及定量， 采用地高辛 PCR 法标记技术， 用罗氏公司的试剂盒 （PCR DIG Probe Synthesis Kit， Cat.No.11636090910， Version December2005） 进行地高 辛标记 E2 基因片段 DNA 制备探针， 探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行， 标记的探 。
22、针在电泳图谱上明显滞后于普通dNTP扩增产物条带 （图2） ， 说明探针标记成功， 同时和DNA Marker 条带比较， 所标记探针的量大约为 30ng/l。 0023 表 1 标记 HCLV 探针和 HCLV 株 RT-PCR 扩增的引物 0024 说 明 书 CN 103146844 A 5 4/10 页 6 0025 以上引物均由上海 Sangon 公司合成。 0026 （2） 探针特异性和灵敏度的检测 0027 将猪繁殖与呼吸综合症病毒 （PRRSV） 、 猪圆环病毒 （PCV-2） 、 猪伪狂犬病毒 （PRV） 、 猪细小病毒 （PPV） 基因质粒 （本实验室保存） 四种病毒的 D。
23、NA 片段及 HCLV-E2 基哠 450bp 片 段的 PCR 回收产物 DNA 均做 10 倍梯度稀释， 分别稀释至 100pg 10pg、 1pg、 0.1g、 0.01pg 的 量检测所标记探针的灵敏度和牸异性。 0028 DNA 80 2h 交、 洗膜僊色 （见附注） 。通过斑点的有无判 断结果， 盓果见图 3。 0029 图 3 显示 ： A1-E1 ： HCLV-E2 同源 DNA， A1-C0 出现防性斑点 ； A2-E2 ： PPV 同源 DNA， 均无斑点 ； A3-E3 ： PCV 同源 DNA， 均无斑点 ； A4-D4 ： PRV 同源 DNA， 均无斑点 ； A5-。
24、E5- ： PRRSV 同源 DNA ； A6-E6， 均无斑点 ： 超纯水 ； A1-A5 ： 100pg 量的 DNA ； B1-B5 ： 10pg 量的 DNA ； C1-C5 ： 1pg 量的 DNA ； D1-D5 ： 0.1pg 量的 DNA ； E1-E5 ： 0.01g 量的 DNA。 0030 图3结果显示， 制备的地高辛标记HCLV-E2 DNA探针具有很好的特异性， 而且敏感 性也很好， 可以检测到 1pg 量的 DNA。 0031 2. 猪瘟兔化弱毒疫苗株的定量 0032 （1） 疫苗接种于 ST 细胞 0033 将长成单层的 ST 细胞胰酶消化后充分吹打， 传代于 2。
25、4 孔细胞培养板， 于 37 5% 的 CO2培养箱中培养， 待其贴壁后将疫苗用 3ml 生长液稀释， 分装于 3 个 1.5ml 离心管， 漩 涡振荡 15S,12000r/min 低温离心 3 分钟， 取上清用一次性滤器过滤后再从 10-1 10-6做 10 倍梯度倍比稀释， 接种于单层细胞， 除第六个稀释度留两个孔做阴性对照而只接种两个 孔外， 其他 5 个稀释度均做 4 个重复， 每孔 100l， 吸附 3h 后弃去上清和非吸附细胞， 并加 1ml1%FBS 的维持液， 连续观察 7 天后收获细胞， 冻存于 -80。 0034 （2） RT-PCR 扩增 HCLV 基因片段 0035 。
26、用 Viral RNA Kit（R6874-01 购自公司） 从猪瘟活疫苗中直接提取猪瘟兔化弱毒 病毒 RNA 为模板用 TakaRa RNA PCR Kit(AMV)V3.0（#DRR019A 购自日本 TakaRa 公司） 用 HCLV-F2/HCLV-R2引物 （见表1） 进行RT-PCR， 每个样品做两个重复。 10l RT体系包括1l dNTP,2l Mg2+,1l RT-Buffer,1l HCLV-R2,0.5l AMV条件 ： 42延伸60min,99变 性 5min。PCR 条件 ： 95预变性 4min 后 94变性 30s,58退火 30s,72延伸 90s,32 个 循。
27、环， 最后延伸 10min 分钟。 0036 （3） 斑点杂交检测扩增片段 说 明 书 CN 103146844 A 6 5/10 页 7 0037 按照附注记载的方法， 用 DIG Labeling and Detectiong Kit 试剂盒 （购自 Roche 公司公司） 做斑点杂交， 检测 RT-PCR 产物。 0038 （4） 重复性试验 0039 1）批内重复试验 ： 在相同条件下， 对某一批次的猪瘟活疫苗做 3 个重复 （A1、 A2、 A3） ， 结果见图 4、 图 5 和图 6。应用该方法能很好的对疫苗病毒进行定量， 显示重 复性很好， 同一批次疫苗间三次重复定量结果相差不大。
28、 （分别为 5.3104TCID50/ 头份、 3.0104TCID50/ 头份、 3.0104TCID50/ 头份） 0040 图4显示 ： A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0101倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物， 全部出现阳性把斑点 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物， 全部出现阳性把斑点 ； A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0103倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR 产物， A3、 B3、 G3 和 H3 出现斑点 ； A4-H4:HCLV 疫苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT。
29、-PCR产物， 无斑点出现 ； A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0105倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR 产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 均出现斑点 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现。 0041 根据 Reed-Mench 法计算得到疫苗 A1 定量结果为 ： 3.0104个 TCID50/ 头份的病 毒。 0042 图5显示 ： A1。
30、-H1:HCLV疫苗稀释3.0101倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物， 全部出现阳性把斑点 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物， 全部出现阳性把斑点 ； A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0103倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR 产物， A3、 B3、 C3、 D3、 G3 和 H3 出现斑点 ； A4-H4:HCLV 疫苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提 取RNA后RT-PCR产物， 无斑点出现 ； A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0105倍接到ST细胞提取RNA 后 RT-PCR 产物 ； A6-H6。
31、:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无 斑点出现 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 均出现斑 点 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现。 0043 根据 Reed-Mench 法计算得到疫苗 A2 定量结果为 ： 5.3104个 TCID50/ 头份的病 毒。 0044 图6显示 ： A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0101倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物， 全部出现阳性把斑点 ； A2-H2:HCLV 。
32、疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物， 全部出现阳性把斑点 ； A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0103倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR 产物， C3、 D3、 G3 和 H3 出现斑点 ； A4-H4:HCLV 疫苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR产物， 无斑点出现 ； A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0105倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR 产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照，。
33、 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 均出现斑点 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现。 0045 根据 Reed-Mench 法计算得到疫苗 A3 定量结果为 ： 3.0104个 TCID50/ 头份的病 毒。 0046 2） 批间重复试验 ： 在相同条件下， 对 3 个不同批次的疫苗 （A1、 B、 C） 做独立的检 测， 结果见图 4、 图 7 和图 8 所示， 表现为不同批次疫苗间的定量结果参差不齐 （3.0104个 说 明 书 CN 103146844 A 7 6/10 页 8 TCID50/ 头份， 。
34、9.5103TCID50/ 头份和 1.7103TCID50/ 头份） , 相差 17.5 倍， 是批内试验误 差的 10 倍。这说明对猪瘟弱毒疫苗现行的定量方法很不准确。 0047 图 4 疫苗 A1 的定量结果见上 1） 节所示疫苗 A1 定量结果为 3.0104个 TCID50的 病毒。 0048 图 7 疫苗 B 的定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性斑点 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性斑点 ； A7-。
35、D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫 苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性斑点 ； 其他点样位置均无斑点出现。 0049 根据 Reed-Mench 法计算得到疫苗 B 定量结果为 ： 9.5103TCID50/ 头份的病毒。 0050 图 8 疫苗 C 的定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性斑点 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物 , 仅 C2 和 D2 出现阳性斑点 ； A7-D7:HCLV 。
36、疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性斑点 ； 其他各点样位置上均无阳性斑点出现。 0051 根据 Reed-Mench 法计算得到疫苗 B 定量结果为 ： 1.7103TCID50/ 头份的病毒。 0052 本发明使用主要试剂及其来源 ： 0053 TaqDNA 聚合酶 (5U/l)、 dNTP Mixture( 各 2.5mmol/L)、（10） PCR Buffer( 含 Mg2+)、 DNA Marker(DL2000) 等均购自宝生物工程 （大连） 有限公司 ； 核酸回收试剂盒 DNA Purification Kit From G。
37、els and Solutions购自OMEGA公司。 DMEM干粉购自INVITROGEN 公司。胎牛血清 (FBS) 购自美国 GIBCO 公司。尼龙膜， DNA Digoxigenin 标记和检测试剂 盒购自 Roche 公司。其他常规试剂均为国产分析纯。 附图说明 0054 图 1HCLV450bpPCR 产物电泳结果 M:2000DL ； 1: 以 HCLV 质粒为模板的普通 PCR 扩 增电泳结果。 0055 图 2HCLV 核酸探针标记电泳结果 M:2000DL;1: 以回收 450bp 基因片段为模板 PCR 法标记的地高辛HCLV核酸探针 ； 2:以回收450bp基因片段为模。
38、板的普通PCR结果 ； 3:以超 纯水为模板的普通 PCR 扩增结果。 0056 图 3 ： 探针的灵敏度和特异性检测结果图中 ： A1-E1 ： HCLV-E2 同源 DNA ； A2-E2 ： PPV 同源 DNA ； A3-E3 ： PCV 同源 DNA ； A4-D4 ： PRV 同源 DNA ； A5-E5- ： PRRSV 同源 DNA ； A6-E6 ： 超纯 水 ； A1-A5 ： 100pg 量的 DNA ； B1-B5 ： 10pg 量的 DNA ； C1-C5 ： 1pg 量的 DNA ； D1-D5 ： 0.1pg 量的 DNA ； E1-E5 ： 0.01g 量的 D。
39、NA。 0057 图 4 疫苗 A1 定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性把斑点 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞 提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 全部出现阳性把斑点 ； A3-H3:HCLV 疫苗稀释 3.0103倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， A3、 B3、 G3 和 H3 出现斑点 ； A4-H4:HCLV 疫苗稀释 3.0104倍 接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现 ； A5-H5:HCLV 。
40、疫苗稀释 3.0105倍接到 ST细胞提取RNA后RT-PCR产物 ； A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0106倍接到ST细胞提取RNA后 RT-PCR 产物， 无斑点出现 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产物， 均出现斑点 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物， 无斑点出现。 说 明 书 CN 103146844 A 8 7/10 页 9 0058 图 5 疫苗 A2 定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ；。
41、 A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； A3-H3:HCLV 疫苗稀释 3.0103倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A4-H4:HCLV 疫 苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A5-H5:HCLV 疫苗稀释 3.0105 倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RN。
42、A 后 RT-PCR 产 物 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物。 0059 图 6 疫苗 A3 定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； A3-H3:HCLV 疫苗稀释 3.0103倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A4-H4:HCLV 疫 苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A5-H5:HCLV。
43、 疫苗稀释 3.0105 倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物。 0060 图 7 疫苗 B 的定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA。
44、 后 RT-PCR 产 物 ； A3-H3:HCLV 疫苗稀释 3.0103倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A4-H4:HCLV 疫 苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A5-H5:HCLV 疫苗稀释 3.0105 倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取。
45、 RNA 后 RT-PCR 产物。 0061 图 8 疫苗 C 的定量结果图中 ： A1-H1:HCLV 疫苗稀释 3.0101倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A2-H2:HCLV 疫苗稀释 3.0102倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； A3-H3:HCLV 疫苗稀释 3.0103倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A4-H4:HCLV 疫 苗稀释 3.0104倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A5-H5:HCLV 疫苗稀释 3.0105 倍接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 。
46、产物 ； A6-H6:HCLV 疫苗稀释 3.0106倍接到 ST 细胞提 取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A7-D7:HCLV 疫苗阳性对照， 即直接提取 HCLV 疫苗 RNA 后 RT-PCR 产 物 ； E7-H7: 未接毒的空白 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物。 0062 图 9 疫苗的定量结果疫苗 1 ： A1-B1:HCLV 疫苗稀释 100、 C1-D1: 疫苗稀释 10-1、 E1-F1: 疫苗稀释 10-2； A2-B2:HCLV 疫苗稀释 10-3、 C2-D2: 疫苗稀释 10-4、 E2-F2: 疫苗稀释 10-5接到 ST 细胞提取 RNA 。
47、后 RT-PCR 产物 ； 疫苗 2 ： A3-B3:HCLV 疫苗稀释 100、 C3-D3: 疫苗 稀释 10-1、 E3-F3: 疫苗稀释 10-2； A4-B4:HCLV 疫苗稀释 10-3、 C4-D4: 疫苗稀释 10-4、 E4-F4: 疫苗稀释 10-5接到 ST 细胞提取 RNA 后 RT-PCR 产物 ； A5-D5 ： 为阳性对照 ； E5 ： 为空白对照 （DEPC H2O） F5: 阴性对照。 0063 本发明涉及的微生物资源 0064 本发明涉及的微生物为猪瘟病毒病毒 （Classical swine fever virus， CSFV） 兔 化弱毒株， 又称 C 。
48、株 （HCLV， CVCC AV1412） ； 该毒株是我国和世界许多国家制备猪瘟活疫苗 的生产毒株 （中国兽医药品监察所， 中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著 . 中国兽医菌 种目录， 第二版 2002， 中国农业科学技术出版社， 2002， p145） 。 说 明 书 CN 103146844 A 9 8/10 页 10 0065 本发明的积极意义 0066 本发明涉及建立一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸 探针试剂盒。本发明采用 PCR 法制备 HCLV 特异性地高辛标记的 DNA 探针， 同时将 HCLV 疫 苗梯度稀释后接种于 24 孔培养板上的 ST 细胞中， 。
49、在培养 7 天后分别从接种各稀释度的不 同孔细胞中提取 RNA 后， 用 RT-PCR 结合斑点杂交的方法检测病毒感染。应用该方法能很好 的对疫苗病毒实施以 TCID50为单位的准确定量， 多次重复实验发现对同一批次疫苗间定量 的重复好， 相互结果相差不大 （5.3104TCID50、 3.0104TCID50、 3.0104TCID50） 。本发明技 术方案的实验结果表明RT-PCR结合斑点杂交定量方法能准确、 完全的对疫苗HCLV定量， 值 得推广应用。 0067 实施例 1 0068 疫苗检验的结果 0069 （1） 猪瘟活疫苗 ： 浙江诺倍威生物技术有限公司生产， 20 头份 / 瓶。 0070 疫苗 1 ： 起始用 1ml DMEM 稀释疫苗 （100） 后， 1。