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1、(10)申请公布号 CN 103146765 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146765 A *CN103146765A* (21)申请号 201310057740.4 (22)申请日 2013.02.25 C12P 7/10(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路 35 号 (72)发明人 孙晓琦 张柏林 张寅 刘啸 王晓 (54) 发明名称 一种来源于枫树半纤维素的乙醇及其制备方 法 (57) 摘要 本发明提供一种来源于枫树半纤维素的乙醇 及其制备方法， 涉及燃料乙醇与发酵技。
2、术领域。 本 发明包括原料的预处理和乙醇发酵两个过程。以 研磨过 0.5 毫米筛的枫树为原料， 以 0.5 v/v 草 酸为液相， 固体浓度 10 W/V， 160下预处理 35 分钟。预处理后， 降温至 25， 过滤， 取上清液， 用 2mol/L KOH 调整 pH 至 7.5， 添加酵母提取物 10g/ L 和蛋白胨 20g/L， 接入大肠杆菌 K011， 37进行 半纤维乙醇发酵。在该工艺参数下发酵得到的乙 醇产量达到理论产值的 94左右。采用本发明的 生产技术， 能显著降低半纤维的损失， 提高乙醇产 量， 具有很高的经济效益和社会效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说。
3、明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 103146765 A CN 103146765 A *CN103146765A* 1/1 页 2 1. 一种半纤维素乙醇发酵技术， 其特征在于枫树有机酸预处理后所得的半纤维水解 液， 不需脱毒处理， 直接调整 pH 值， 添加生长因子刺激物， 接入可发酵五碳糖的菌株， 37 进行乙醇发酵。 2.按权利要求1所述的半纤维素乙醇发酵技术， 其枫树材料特征为研磨后， 过0.5毫米 筛。 3. 按权利要求 1 所述的半纤维素乙醇发酵技术， 有机酸为 0.5 v/v 草酸。 。
4、4. 按权利要求 1 所述的半纤维素乙醇发酵技术， 半纤维水解液的制备方法及步骤为 ： 以 0.5 v/v 草酸为液相， 固体浓度 10 W/V， 25下预先浸泡 12 小时， 160预处理 35 分 钟。预处理后， 降温至 25， 真空抽滤， 得半纤维素水解液。 5. 按权利要求 1 所述的半纤维素乙醇发酵技术， 生长因子刺激物的制备方法及步 骤为 ： 碱性蛋白酶在 pH2.2， 温度 60， 水解 2.0的乳清蛋白， 酶与底物比 7.0， 获得 200D-1500D 短肤混合物。 6. 按权利要求 1 所述的半纤维素乙醇发酵技术， 其发酵方法为 ： 首先用 2mol/LKOH 调 整 pH。
5、 至 7.5， 氮源水解物， 添加生长因子刺激物， 接入大肠杆菌 K011， 37进行半纤维乙醇 发酵。 7. 根据权利要求 1 或 6 所述的发酵技术， 发酵半纤维素水解液的菌株为转基因大肠杆 菌 K011(ATCC55124)。 权 利 要 求 书 CN 103146765 A 2 1/2 页 3 一种来源于枫树半纤维素的乙醇及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种来源于枫树半纤维素的乙醇及其制备方法， 属于生物质能源与燃 料乙醇发酵技术领域。 背景技术 0002 燃料乙醇， 一般是指体积浓度达到 99.5以上的无水乙醇， 可在专用的乙醇发动 机中使用 ； 又可按一定的比例与汽油混。
6、合， 在不对原汽油发动机做任何改动的前提下直接 使用。一方面可以作为汽油的替代物以减少汽油消耗量， 另一方面可以减少汽车尾气污染 物的排放， 改善城市大气环境。 0003 传统的乙醇发酵以糖或淀粉为原料。但糖和淀粉的主要来源是食物， 以粮食为原 料生产燃料乙醇已经对世界粮食安全构成了威胁， 迫切需要找到其他原料代替粮食。所以 以木质纤维素为原料的燃料乙醇生产成为各国竞相研究的热点。在木质纤维素中， 半纤维 素作为第二丰富的碳水化合物排在纤维素之后， 其含量高达35以上。 到目前为止， 生物质 燃料乙醇的生产主要以纤维素为原材料， 首先进行预处理， 然后必须纤过酶解， 才能释放出 葡萄糖进而进行。
7、乙醇发酵。 但半纤维素预处理后， 即可得可溶性单糖而直接由微生物发酵。 由于这些原因， 半纤维素生物转化是不应该被忽视的。 利用半纤维素生产乙醇， 最终能提高 木质材料的整体利用效率。 本发明采用有机酸预处理结合发酵过程补允氮源的燃料乙醇生 产技术手段， 对提高我国燃料乙醇生产水平， 促进生物质能源产业的发展， 有重要的实际意 义。 发明内容 0004 本发明提供了一种来源于枫树半纤维素的乙醇及其制备方法。 该方法可在预处理 过程中显著降低单糖的损失， 缩短发酵时间， 提高乙醇产量。 0005 本发明技术方案如下 ： 0006 (1) 对枫树材料进行研磨， 过 0.5 毫米筛。并对原始材料进行。
8、成分分析， 包括纤维 素含量、 半纤维素含量和灰分 ； 0007 (2) 有机酸预处理方法降解枫树木质纤维材料 ： 以 0.5 v/v 草酸为液相， 固体浓 度 10 W/V， 25下预先浸泡 12 小时后， 160预处理 35 分钟。预处理后， 降温至 25， 真 空抽滤， 取上清 ； 0008 (3) 对预处理后的半纤维素水解液进行成分分析， 所需要分析的成分包括木糖含 量， 葡萄糖含量， 糠醛和羟甲基糠醛。 0009 (4) 用 2mol/LKOH 调整半纤维素水解液 pH 至 7.5， 添加酵母提取物 10g/L 和蛋白 胨 20g/L， 接入大肠杆菌 K011， 37进行半纤维乙醇发。
9、酵。 0010 (5) 检测发酵液中木糖含量， 葡萄糖含量和乙醇含量。 具体实施方式 说 明 书 CN 103146765 A 3 2/2 页 4 0011 本发明为一种提高生物质燃料乙醇产量的新方法， 主要由预处理和发酵两大步骤 组成。下面通过具体实施例对本发明进一步详细描述。制备方法如下 ： 0012 1 材料预处理 ： 0013 (1) 枫树材料进行研磨， 过 0.5mm 筛， 进行成分分析 ： 准确称取样品 0.5g， 至于 10ml 小烧杯， 加入 72硫酸 3.00ml， 搅拌均匀， 30水浴 1h。浓酸水解液转移至 100ml 玻 璃瓶中， 并稀释酸的浓度至 4。同时以糖回收标准。
10、液为内参， 同样稀酸浓度于玻璃瓶中密 封。同时置于高压灭菌锅内， 121下， 保温 45min。砂芯漏斗拙滤。取 5.00ml 滤液， 加入过 量 CaCO3调节 pH 值， 过滤取上清。由 HPLC 测定上清液中单糖含量。根据糖回收率折算后， 葡萄糖含量乘以系数 0.90 得纤维素含量， 木糖和阿拉伯糖含量之和乘以系数 0.88 得半纤 维素含量。滤后残渣， 蒸馏水洗涤至中性， 105烘干， 在 550下 4h 灰化， 得灰分含量 ； 0014 (2) 以研磨的枫树为材料， 以 0.5 v/v 草酸为液相， 固体浓度 10 W/V， 25下预 先浸泡12小时， 160预处理35分钟。 预处理。
11、后， 降温至25， 真空抽滤， 得枫树预处理液 ； 0015 (3) 对所得枫树预处理液加 4的硫酸。同时以糖回收材准液为内参， 同样稀酸浓 度， 于玻璃瓶中， 密封。置于高压灭菌锅内， 121下， 保温 45min。取 5.00ml 液体， 加入过量 CaCO3调节 pH 值， 过滤取上清。由 HPLC 测定上清液中单糖含量。比较原始成分中的木糖含 量与预处理液中所测得的木糖含量， 可知预处理果效。 0016 2 预处理液的发酵 ： 首先用 2mol/L KOH 调整半纤维素水解液 pH 至 7.5， 添加酵母 提取物 10g/L 和蛋白胨 20g/L， 按浓度 5g 菌株湿重 /L 接入大。
12、肠杆菌 K011， 37进行半纤维 乙醇发酵。用 HPLC 检测发酵液中木糖含量， 葡萄糖含量和乙醇含量， 可知半纤维素水解液 发酵效率。 0017 本发明在上述操作下， 24 小时内可得最大乙醇产量， 达到理论产值的 93.9， 乙 醇终浓度为 9.0g/L。 0018 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式上的限制， 虽 然本发明已以较佳实施例揭露如上， 然而并非用以限定本发明， 任何熟悉本专业的技术人 员， 在不脱离本发明技术方案的范围内， 当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例， 但凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质 对以上的实施例所作的任何简单修改、 等同变化与修饰， 均仍属于本发明技术方案的范围 内。 说 明 书 CN 103146765 A 4 。