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1、(10)申请公布号 CN 103154015 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103154015 A *CN103154015A* (21)申请号 201180024420.8 (22)申请日 2011.03.29 61/318,417 2010.03.29 US C07H 21/00(2006.01) C12P 19/34(2006.01) (71)申请人 韩建 地址 美国阿拉巴马州 (72)发明人 韩建 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 张国梁 (54) 发明名称 用于提高检测 B 细胞免疫球蛋白基因重组的 方法 (57) 摘要 。
2、公开了一种产生引物以增加 PCR 产物的产量 的方法， 所述 PCR 产物表示来自人或动物的样品 中存在的多种遗传重组事件和抗体。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.16 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/030398 2011.03.29 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/123473 EN 2011.10.06 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103154015 。
3、A CN 103154015 A *CN103154015A* 1/1 页 2 1. 用于增加扩增产物数量的方法， 所述扩增产物来自人或动物样品的重组免疫球蛋白 序列的引物产生的扩增， 所述方法包括向用于所述引物产生的扩增的至少一个引物中， 在 所述引物序列的 3 末端， 5 末端， 或 3 末端和 5 末端二者处， 引入约 2 至约 5 个随机产生 的核苷酸。 2. 权利要求 1 的方法， 其中所述随机产生的核苷酸引入至所述引物序列的 3 末端中。 3. 权利要求 1 的方法， 其中 3 个随机产生的核苷酸在所述引物序列的 3 末端， 5 末端， 或 3 末端和 5 末端二者处引入至所述引物。
4、序列中。 4. 权利要求 1 的方法， 其中 3 个随机产生的核苷酸引入至所述引物序列的 3 末端中。 权 利 要 求 书 CN 103154015 A 2 1/4 页 3 用于提高检测 B 细胞免疫球蛋白基因重组的方法 0001 本申请要求 2010 年 3 月 29 日提交的美国临时专利申请号 61/318,417 的优先权。 发明领域 0002 本发明涉及用于识别和量化 B 细胞免疫球蛋白基因重组的方法。更具体地， 本发 明涉及设计用于增加来自免疫球蛋白cDNA和/或RNA的PCR-扩增产物数量的引物的方法。 0003 发明背景 0004 当考虑科学研究的 “停滞地带” 时， 免疫学已经。
5、成为了身体及其在健康和疾病时的 状态的研究的主要部分。科学家不断地发现身体的天然防御系统和疾病之间的联系， 这曾 经被认为与免疫学无关。免疫系统的细胞提供炎性应答的最显著部分， 且炎症可以与不同 疾病， 如心血管病、 肾病、 糖尿病、 关节炎、 和癌症有关。 炎性应答必须小心地平衡， 并且当该 平衡得不到维持时， 可以导致由免疫缺陷引起的疾病， 或者在型谱另一端导致 “自身免疫疾 病” 诸如系统性红斑狼疮 (SLE)、 风湿性关节炎 (RA) 和结节病。 0005 Anthony Fauci 博士， M.D.， 美国国家变态反应和传染病学院 (UnitedStates National Ins。
6、titute of Allergy and Infectious Disease， NIAID) 院长， 由于提出 “定 义处于健康和疾病的人免疫系统状态是人免疫学研究的主要目标” (NIH 新闻 (NIH News)， 2010 年 3 月 8 日， http:/www.nih.gov.news/health/mar2010/niaid-08a.htm) 而被引证。 NIAID 的的科学家认识到 “目前用于检查处于血液中的免疫细胞混合物中基因表达差异的 方法没有考虑即使在健康个体中存在广泛范围的各自细胞类型比例的变化” (Mark Davis 博士， NIH 新闻 (NIH News)， 2。
7、010 年 3 月 8 日 )。他们团队关于该问题的方法是一种分析 通过使用微阵列技术获得的分子数据的新型数学方法微阵列细胞特异的显著性分析 (csSAM) 0006 由 B 细胞提供的抗体应答在免疫系统针对攻击的应答中产生显著程度的多样性。 通过抗原的攻击， B细胞转移至B细胞滤泡并构建生发中心(GCs)。 重排的免疫球蛋白基因， 本身作为显著的多样性来源， 进一步通过恒定区的类型 - 转换重组和高变区的体细胞高突 变来修饰。这些区域中的突变率已经估计比自发遗传突变的高约 106倍。 0007 需要更灵敏的检测 B 细胞多样性的方法， 以提供对处于健康和疾病的免疫系统状 态的更好的理解。 0。
8、008 发明概述 0009 本发明涉及用于提高免疫球蛋白重组区 PCR 扩增和增加可检测重组分子数量的 方法， 所述方法包括将约 3 至约 5 个随机产生的核苷酸添加至用于 PCR 扩增一个或多个免 疫球蛋白可变区的至少一个引物的 3 末端， 5 末端， 或 3 和 5 末端二者。 0010 附图简述 0011 图 1 图示来自人患者的 B 细胞群的免疫球蛋白可变区的 PCR 扩增结果。泳道 1-3 图示使用对照引物 ( 在 3 末端无随机产生的核苷酸序列 ) 的 PCR 产物的相对产量， 且 4-6 图示使用实验引物 ( 在 3 末端具有随机产生的核苷酸序列 ) 的扩增序列的相对数量。泳 道。
9、 1 表示来自正常个体 RNA 的扩增产物。泳道 2 来自 CLL 患者， 且泳道 3 是空白， 作为阴性 说 明 书 CN 103154015 A 3 2/4 页 4 对照。泳道 4 表示来自由正常个体分离的 RNA 的扩增产物， 泳道 5 来自 CLL 患者， 且泳道 6 是阴性对照。扩增条件相同。向引物添加 3 随机产生的核苷酸， 如通过泳道 1、 2、 4 和 5 中 条带之间的强度差别所示， 产生显著更多的扩增产物。 0012 图 2 图示多个靶标的测序结果， 所述靶标用于检测来自不同个体的重排。检测这 些重排及其相对频率、 缺乏某些序列等可以提供关于免疫系统状态及其在健康和疾病中作。
10、 用的有价值信息。 0013 详述 0014 本发明人已经开发了用于提高免疫球蛋白重组区PCR扩增和增加来自人和/或动 物的 B 细胞群样品的可检测重组分子数量的新方法。本发明包括将约 3 至约 5 个随机产生 的核苷酸添加至用于 PCR 扩增一个或多个免疫球蛋白可变区的至少一个引物的 3 末端， 5 末端， 或 3 和 5 末端二者。所述方法与利用在一个末端或两个末端无随机产生的核苷酸 的引物的扩增反应相比， 提供增多数量的扩增产物。 0015 在生发中心中， B 细胞通过体细胞高突变来修饰重排的免疫球蛋白基因。该高突 变提供另外的多样性和抗原结合特异性。它还在免疫球蛋白重链和轻链基因的 V。
11、 区中和附 近引入突变。近期改善了引物设计， 因为开发了计算机程序来协助设计更容易与这些序列 结合的简并引物。 然而， 为了检测表示抗体分子重组的真实群的重组， 本发明人已经发现可 检测的分子数量可以通过使用下述引物而增加， 所述引物在高变区接合处结合并考虑该区 中序列的高变性质。 0016 本发明提供用于扩增来自人或动物血液样品的 RNA 和 / 或 cDNA 的方法。然而， 样 品还可以获自人或动物体的骨髓或其他 B 细胞源。 “重组免疫球蛋白序列” 表示体内已经发 生的不同遗传重排， 其导致不同的多样性抗体。 0017 扩增可以通过本领域中技术人员已知的多种方法进行， 并且其可以通过使用。
12、商 购试剂盒而简化。用于扩增来自单个样品的多个靶标的方法已经记述在， 例如， 美国专 利申请公开号 20070141575 中， 其描述了称为 TEM-PCR 的方法， 和美国专利申请公开号 20090253183， 其描述了称为 ARM-PCR 的方法。 0018 例如， 在 ARM-PCR 法的第一步骤中， 使用高浓度、 靶标特异性、 嵌套引物进行靶标 特异性第一扩增程序。引物基于它们结合已知免疫球蛋白重链可变区序列 (IgHV) 的潜力 来选择。如前所述， 存在许多计算机程序来协助选择引物， 并且对于本领域中技术人员而 言， 引物选择由于本领域中已知的某些原则而变得简单。可以使用靶标特异。
13、性引物来扩增 一种或多种 ( 且优选多个 ) 靶核酸。嵌套引物浓度可以通常为 5-50pmol。所选择的引物被 另外的核苷酸 “标记” ， 从而提供不特异于靶核酸的另外的序列， 以使得使用这样的引物的 靶核酸扩增还向由此生成扩增子中引入关于共同引物的结合位点， 所述共同引物， 与靶标 特异性引物不同， 可以用于进一步扩增无关的靶核酸扩增子。扩增进行约 10-15 个循环， 终 止反应， 并且由反应混合物中拯救由此产生的扩增子， 以在第二靶标不依赖性扩增程序中 使用， 所述程序包括通过共同引物启动聚合酶链反应， 所述共同引物以相对不加选择的方 式， 提供由靶标特异性反应中拯救的多种扩增子表示的无。
14、关核苷酸序列的扩增。 0019 进行扩增子拯救， 从而最小化或消除第一反应的引物， 同时提供在使用共同引物 的第二扩增中使用的扩增子。扩增子拯救可以以不同方式进行。例如， 可以进行来自完成 的第一扩增反应的小规模取样， 以提供用于第二扩增的扩增子。 当进行小规模取样时， 其提 说 明 书 CN 103154015 A 4 3/4 页 5 供足够数量的用于第二扩增的扩增子， 同时显著减少 ( 即， 稀释 ) 第一扩增引物的剩余数 量。扩增子拯救还可以通过以下步骤来进行 ： 去除第一扩增反应系统内容物的主要部分和 向剩余的内容物添加共同引物以及对于利用所述共同引物进行第二扩增所必需的酶、 核苷 酸。
15、、 缓冲液、 和 / 或其他试剂， 从而在第二反应系统中扩增拯救的扩增子。还可以利用分离 技术来自拯救扩增子。这样的技术可以依赖于引物和扩增子之间的大小差异， 已经连接于 扩增子、 引物或二者的标签， 或本领域中技术人员已知的其他方法。一段分离， 全部拯救的 扩增子或部分拯救的扩增子可以用于第二扩增中。 0020 在 ARM-PCR 中， 第二扩增使用新鲜缓冲液、 核苷酸、 和共同引物进行。选择共同引 物， 以提供拯救的扩增子的有效扩增， 从而在第二扩增结束时提供显著数量的那些扩增子 的拷贝。 0021 通过将反应分为第一、 靶标特异性引物驱动的扩增和第二、 靶标不依赖性共同引 物驱动的扩增，。
16、 所述方法通过使用靶标特异性引物提供特异性， 从而仅扩增由特定靶标表 示的核酸的种类和数量、 和通过使用嵌套引物、 高浓度靶标特异性引物和使用共同引物获 得的灵敏度， 从而以较高拷贝数提供非特异性 ( 靶标不依赖性 ) 扩增。此外， 在第一扩增中 使用高浓度引物， 及随后的扩增子拯救特别是当通过以下步骤分离一部分第一扩增进 行扩增子拯救时 ： 通过去除所述部分和将其置于新的反应系统中或通过去除第一扩增的主 要部分和向其添加必需的试剂以形成用于第二、 靶标不依赖性扩增的第二反应系统以 使其适合于自动操作。不仅这些步骤可以在相对封闭的限制污染可能性的反应系统中进 行， 而且由所述方法提供的第一扩增。
17、、 扩增子拯救、 和第二扩增的组合产生一种在小于 2 小 时期间内进行的关于来自多个样品的多个靶标的特异性、 灵敏检测方法。 0022 ARM-PCR 和 TEM-PCR 方法二者均已经被本发明人用于扩增多个靶序列， 并且当与 本发明的方法组合时， 用于生成增加免疫球蛋白 RNA 和 / 或 cDNA 序列样品中可检测靶标 数量的引物。作为举例， 通过在引物序列的 3 末端添加 3 个随机产生的核苷酸， 而使得 ARM-PCR 和 TEM-PCR 方法二者更有效地扩增来自 B 细胞样品的多个靶标。这为检测另外的 可以具有高突变的靶标提供至少 64 种不同的可能性， 如果使用无随机产生的末端的引。
18、物， 则所述靶标不可检测， 因为引物错配将导致靶标与所述错配的结合减少和扩增缺乏。 0023 其他用于扩增多个靶标的方法也可以与本发明的方法一起使用， 并且提供 ARM-PCR 和 TEM-PCR 方法作为本发明人已经成功地用于实现扩增多个靶标的所需方法的实 例。 0024 与高通量测序共同存在的一个主要问题是引物二聚体干扰扩增并且非常难以去 除。通过使用 40 个碱基对长度的正向和反向引物， 二聚体可以有 80 个碱基对那么长。由 常规方法产生的产物可以有 150-250 碱基对那么短。使用发明方法提供的新的引物设计， 以及与向外移动所述引物以扩增和测序较长插入步骤的组合， PCR 产物超过。
19、 350bp， 这使得 更容易将产物与二聚体分开。 0025 本发明的方法有效用于生成更有效扩增以前难以检测的抗体序列的引物。 这使其 更容易扩增获自任何单一个体的样品中存在的多种序列， 从而更容易确定哪种重排可以以 较高频率存在， 哪种可以完全不存在等。以前， 这是更困难的， 其归因于某些克隆难以检测 的事实， 这归因于由导致那些克隆产生的高突变所引起的引物的错配配对。 0026 随机产生的核苷酸可以在 5 末端， 3 末端， 或两个末端， 添加至引物序列， 尽管在 说 明 书 CN 103154015 A 5 4/4 页 6 本发明人使用 Ig 分子和 ARM-PCR/TEM-PCR 的经。
20、验中， 它们在添加至 3 末端时最有效。随 机产生的核苷酸还可以包括在多核苷酸引物 3 或 5 末端的约 2- 约 5 个核苷酸。关于 3 末端处的 3 个随机产生的核苷酸的结果已经在扩增和检测来自人血液的重组免疫球蛋白 序列中提供突出的结果， 特别是当已经使用了 PCR 反应中使用的较高范围的退火温度时。 0027 本发明可以进一步通过以下实施例来描述 ： 实施例 0028 血液样品获自 Conversant Healthcare Systems， Inc.， Huntsville， 阿拉巴马州， 以用于图 1 中所示的扩增。为了使用 Qiagen 一步式 RT-PCR 试剂盒 (Qiage。
21、n， Carlsbad， 加 利福尼亚)的第一扩增反应， 利用Qiagen试剂盒提取mRNA。 向样品中添加反转录酶 ： 50， 40 分钟 (30 分钟， 最小 RT)， 从而在 95最初 PCR 激活 15 分钟。进行富集循环 ： 94， 30 秒 63， 2 分钟 72， 30 秒， 进行 15 次循环。94， 30 秒 72， 2 分钟的 2- 步循环进行 15 次循环， 在 72最终延长 10 分钟。在使用 Qiagen 多元 PCR 试剂盒的第二扩增反应中， 最初 PCR 激活在 95进行 15 分钟， 随后是 3- 步循环 ： 94， 30 秒 55， 30 秒 72， 30 秒， 进行 40 次循环， 在 72最终延长 5 分钟。还加入来自 Promega 的重组核糖核 酸酶抑制剂。 说 明 书 CN 103154015 A 6 1/2 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103154015 A 7 2/2 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 103154015 A 8 。