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1、(10)申请公布号 CN 103160493 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103160493 A *CN103160493A* (21)申请号 201110422779.2 (22)申请日 2011.12.16 C12N 15/01(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 张震宇 刘合栋 (54) 发明名称 一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方 法 (57) 摘要 一种快速。
2、消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方 法， 主要用于将大肠杆菌中的抗生素抗性质粒快 速有效地从大肠杆菌中消除掉。通过采用将大肠 杆菌进行电击的方法获得消除抗生素抗性质粒的 大肠杆菌， 并采用特殊的电击缓冲液促进抗生素 抗性质粒的消除， 提高质粒消除率。细胞处于电 场中时， 电压达到某一临界值， 细胞膜局部被击 穿， 形成瞬时的孔洞， 孔径大小可以使质粒从细胞 中排出， 电击结束后， 损伤的细胞膜又可以自我修 复 ； 电击缓冲液的碱金属通过与细胞膜结合从而 促进细胞膜的击穿， 使得胞内质粒更容易泄露出 来。最终的质粒消除率可达到 93。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图。
3、 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103160493 A CN 103160493 A *CN103160493A* 1/1 页 2 1. 一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法， 其特征在于 ： 将大肠杆菌进行电击 后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌， 并采用特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的 消除， 电击缓冲液的碱金属可促进细胞膜的击穿， 使得胞内质粒更容易泄露出来， 提高质粒 消除率。 2. 如权利要求 1 所述的将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌， 其步骤如下 ： 。
4、A、 制备感受态细胞 ： (1) 从 LB 平板上挑取含抗生素抗性质粒的大肠杆菌单菌落， 接种到含有 5ml 的 LBG 培 养基中培养过夜 ； (2) 在无菌条件下， 将细菌转移至预冷、 无菌 1.5ml 的离心管中 ； (3)4000g 离心 10min 回收菌体， 该步骤在 4下进行 ； (4) 用 1ml 预冷的 15甘油重悬细胞沉淀 ； (5)4以 4000g 离心 10min 后弃掉液体， 回收菌体 ； (6) 重复步骤 4、 步骤 5 各一次 ； (7) 最后将菌体重悬于原体积 1/10 的 10甘油中， 并分装至 1.5ml 离心管中， 每管 90l， 并冷冻保存， 备用 ； 。
5、B、 电击消除 ： (1) 将感受态细胞置于冰上融化后， 加入 10l 特殊电击缓冲液后混匀， 并置于冰上放 置 10min ； (2) 将感受态细胞全部转移至 1mm 的电击杯中， 1.8KV/5ms 电击一次 ； (3) 电击后立即加入 1ml 的 SOC 培养基 (2 (W/V) 蛋白胨， 0.5 (W/V) 酵母抽提物， 0.05 (W/V) 氯化钠， 2.5mM 氯化钾， 10mM 氯化镁， 20mM 葡萄糖 )， 37温育 30min ； (4) 将感受态细胞分别涂布至 LBG 平板和卡那霉素抗性平板中 ； (5) 将平板倒置后于 37培养， 24h 后 LBG 平板和卡那霉素抗性。
6、平板均长出单菌落 ； C、 挑取质粒消除菌 ： (1) 用灭菌的牙签， 将 LBG 平板上长出的菌落， 分别接种到 LBG 固体平板和卡那霉素抗 性平板中的相应位置， 过夜培养 ： (2) 将在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出， 再分别接种到 LBG 固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置， 过夜培养 ； (3) 挑出只在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落 ； (4) 挑出单菌落后， 提取质粒， 琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消除 ； 3. 如权利要求 1 所述的采用特殊的电击缓冲液， 该电击缓冲液配方为 ： KCl 0.5M CaCl2 0.15M。
7、 MgCl2 0.25M K+、 Ca2+、 Mg2+这几种带正电荷配体， 均可与带负电荷的细胞膜结合， 从而促进细胞膜的 击穿， 使得胞内质粒更容易泄露出来， 可提高质粒消除率。 权 利 要 求 书 CN 103160493 A 2 1/5 页 3 一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物遗传学相关领域。 技术背景 0002 质粒是独立于染色体外具有独立复制能力的且对细菌生存非必需的小型共价闭 合环状双链 DNA 分子， 普遍存在于细菌细胞内。由于在提取基因组时易受到质粒 DNA 的干 扰， 消除质粒后就能得到纯度较高的基因组， 这对于研究细菌的遗传学和。
8、分子生物学有重 要意义 ； 同时， 人们在研究带有质粒的菌株时， 总希望得到相应的质粒消除菌， 完全消除质 粒的细菌与质粒存在的原始菌株比较， 可以观察研究质粒的遗传学功能， 完全消除质粒的 细菌还可以作为基因工程菌， 广泛应用于分子生物学研究。 虽然某些质粒可自然丢失， 但频 率很低， 仅为10-210-8， 而绝大多数质粒需要借助物理、 化学方法处理来提高质粒消除率。 0003 目前， 质粒消除的方法有化学处理法、 物理法和高温处理法以及外源质粒替换消 除法。常用的化学处理试剂有十二烷基硫酸钠、 吖啶橙、 溴化乙锭、 库马霉素、 新生霉素、 利 福平等提高质粒消除率。Hohn 等利用吖啶橙。
9、来消除大肠杆菌细胞的 F 质粒， 吖啶橙通过 迅速抑制质粒的复制而达到质粒消除目的， 但吖啶橙仅对大肠杆菌有效。库马霉素和新生 霉素可抑制大肠杆菌细胞内的 DNA 回旋酶活性， 而 DNA 回旋酶可催化超螺旋形成双链闭合 环状的 DNA， Novick 等人报道利用库马霉素可有效地消除金黄色葡萄球菌青霉素酶质粒。 Danilevskaya 等人发现库马霉素对大肠杆菌来源质粒如 pBR322、 pMB9 的消除均有较好效 果 ； 另外将温度提高 5-7可达到消除质粒的目的， Carlton 等将细胞在高温条件培养至对 数期后期， 再稀释后转接至新鲜的培养基中高温重新培养至对数期后期， 经多次稀释。
10、高温 培养， 部分细胞的质粒消失。 利用质粒的不相容性原理， 将亲缘关系密切的质粒转化到细胞 内， 由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中， 使得细胞在增值过程中将其中 一个质粒丢失， 也可达到消除目标质粒的目的。 0004 还有一种新的方法即电击法， 也可有效地消除质粒。当细胞处于电场中时， 电位 差达到某一临界值， 细胞膜局部就会被击穿， 形成瞬时的孔洞可以使质粒从细胞中排出， 待 电场消失后， 损伤的细胞膜又可以自我修复。因此电击法可用于消除细菌中的质粒， 同时， 电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素， 碱金属离子通过与细胞 膜结合从而促进细胞膜的击穿， 使得。
11、胞内质粒更容易泄露出来。电击法有比常规质粒消除 法如溴化乙锭、 高温培养法等处理法效果好， 而且还有质粒消除率高、 操作简单等优点。虽 然国外有报道利用电击法消除大肠杆菌质粒， 但是该报道并未考虑到电击缓冲液对质粒消 除的作用， 而且消除率比较低。 本专利通过在电击前加入电击缓冲液， 并采用优化的电击条 件， 提高了质粒消除率， 而且准确率高， 菌株更稳定。用电击结合特殊电击缓冲液的方法快 速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒， 国内外还没未见相关报道。本专利提供的方法可快速有 效地消除大肠杆菌看抗生素抗性质粒。 发明内容 说 明 书 CN 103160493 A 3 2/5 页 4 0005 针对目。
12、前现有的大肠杆菌消除质粒方法需要使用大量有毒的化学试剂如溴化乙 锭、 吖啶橙等， 或者需要经过多次传代， 才能够有效消除质粒， 而且化学法和高温诱导法消 除率均比较低。利用细胞处于电场中时， 当电位差达到某一临界值， 细胞膜局部被击穿， 形 成瞬时的孔洞， 孔径大小可以使大分子质粒从细胞中排出， 因此， 电击法可用于消除细菌中 的质粒。电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素， 碱金属离子通 过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿， 使得胞内质粒更容易泄露出来。 0006 本发明的目的在于提供一种快速有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法。 该方 法经济有效、 方便快速， 而且消除率。
13、高。即 0007 本发明提供一种将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的 方法。 0008 本发明提供一种特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除。 0009 一种将人肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法， 其步骤 如下 ： 0010 A、 制备感受态细胞 ： 0011 (1) 从 LB 平板上挑取含抗生素抗性质粒 pK19mobsacB(Schafer A， Tauch A， Jager W， et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia c。
14、oli plasmids pK18 and pK19 ： selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene， 1994， 145(1) ： 69-73) 的 大 肠 杆菌单菌落， 例如大肠杆菌 SCS110、 JM109、 DH5 菌株单菌落 (Stratagene， Heidelberg， Germany)， 接种到含有 5ml 的 LBG 培养基中培养过夜 ； 0012 (2) 在无菌条件下， 将细菌转移至预冷、 无菌 1.5ml 的离心管中 ； 0013 (3)4000g。
15、 离心 10min 回收菌体， 该步骤在 4下进行 ； 0014 (4) 用 1ml 预冷的 15甘油重悬细胞沉淀 ； 0015 (5)4以 4000g 离心 10min 后弃掉液体， 回收菌体 ； 0016 (6) 重复步骤 4、 步骤 5 各一次 ； 0017 (7) 最后将菌体重悬于原体积 1/10 的 10甘油中， 并分装至 1.5ml 离心管中， 每 管 90l， 并冷冻保存， 备用 ； 0018 B、 电击消除 ： 0019 (1) 将感受态细胞置于冰上融化后， 加入 10l 特殊电击缓冲液后混匀， 并置于冰 上放置 10min ； 0020 (2) 将感受态细胞全部转移至 1mm。
16、 的电击杯中， 1.8KV/5ms 电击一次 ； 0021 (3) 电击后立即加入 1ml 的 SOC 培养基， 37温育 30min ； 0022 (4) 将感受态细胞分别涂布至 LBG 平板和卡那霉素抗性平板中 ； 0023 (5) 将平板倒置后于 37培养， 24h 后 LBG 平板和卡那霉素抗性平板均长出单菌 落 ； 0024 C、 挑取质粒消除菌 ： 0025 (1) 用灭菌的牙签， 将 LBG 平板上长出的菌落， 分别接种到 LBG 固体平板和卡那霉 素抗性平板中的相应位置， 过夜培养 ； 0026 (2) 将在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出， 再分别接。
17、 说 明 书 CN 103160493 A 4 3/5 页 5 种到 LBG 固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置， 过夜培养 ； 0027 (3) 挑出只在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落 ； 0028 (4) 挑出单菌落后， 提取质粒。质粒提取方法参见分子克隆中碱裂解方法 (Sambrook J， Fritsch EF， Maniatis T.Molecular Cloning ： A laboratory manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press.New York， 1989.)， 琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消 除 。
18、； 0029 所述的大肠杆菌包括大肠杆菌 SCS110、 JM109、 DH5。可消除的抗生素抗性质粒 包括以大肠杆菌为宿主的质粒 pK19mobsacB。 0030 本发明提供一种特殊的电击缓冲液促进质粒消除， 该电击缓冲液配方为 ： 0031 KCl 0.5M 0032 CaCl2 0.15M 0033 MgCl2 0.25M 0034 K+、 Ca2+、 Mg2+这几种带正电荷配体， 均可与带负电荷的细胞膜结合， 从而促进细胞 膜的击穿， 使得胞内质粒更容易泄露出来。 0035 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果 ： 0036 (1) 本发明提供一种将大肠杆菌进行电击后获得消除抗。
19、生素抗性质粒的大肠杆菌 的方法， 目前大肠杆菌消除质粒方法需要使用大量有毒的化学试剂如溴化乙锭、 吖啶橙等， 或者需要经过多次传代， 才能够有效消除质粒， 不仅耗时长， 而且化学法和高温诱导法消除 率均比较低。电击法有比常规质粒消除法效果好， 而且还有质粒消除率高、 操作简单等优 点。 0037 (2) 本发明提高一种特殊的电击缓冲液， 电击缓冲液的碱金属离子浓度是影响电 击效率的一个重要因素， 碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿， 使得胞内 质粒更容易泄露出来。利用电击缓冲液可进一步提高质粒消除率。 附图说明 0038 图 1 为碱裂解法分别抽提大肠杆菌 SCS110、 JM10。
20、9、 DH5 菌株质粒 pK19mobsacB 和消除质粒后的的大肠杆菌 SCS110、 JM109、 DH5 菌株的 1琼脂糖凝胶电泳图。 0039 M ： Lambda DNA/HindIIIMarker ； 0040 1 ： 从大肠杆菌 SCS110 提取后并经 EcoRI 酶切后的 pK19mobsacB ； 0041 2 ： 从人肠杆菌 JM109 提取后并经 EcoRI 酶切后的 pK19mobsacB ； 0042 3 ： 从大肠杆菌 DH5 提取后并经 EcoRI 酶切后的 pK19mobsacB ； 0043 4 ： 消除质粒后的大肠杆菌 SCS110 ； 0044 5 ： 。
21、消除质粒后的大肠杆菌 JM109 ； 0045 6 ： 消除质粒后的大肠杆菌 DH5 ； 具体实施方式 0046 实施例 1 ： 0047 大肠杆菌 SCS110、 JM109、 DH5 含有抗生素抗性质粒 pK19mobsacB， 属于革兰氏阴 性菌， 因pK19mobsacB质粒上有一个卡那霉素抗性基因， 含有pK19mobsacB质粒的大肠杆菌 说 明 书 CN 103160493 A 5 4/5 页 6 SCS110、 JM109、 DH5 均可在含卡那霉素的抗性平板上生长。 0048 一种将人肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法， 其步骤 如下 ： 0049 A、 。
22、制备感受态细胞 ： 0050 (1) 从 LB 平板上挑取含抗生素抗性质粒 pk19mobsacB(Schafer A， Tauch A， Jager W， et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 ： selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene， 1994， 145(1) ： 69-73) 的。
23、大肠杆菌单 菌落， 例如大肠杆菌 SCS110 菌株单菌落 (Stratagene， Heidelberg， Germany)， 接种到含有 5ml 的 LBG 培养基中培养过夜 ； 0051 (2) 在无菌条件下， 将细菌转移至预冷、 无菌 1.5ml 的离心管中 ； 0052 (3)4000g 离心 10min 回收菌体， 该步骤在 4下进行 ； 0053 (4) 用 1ml 预冷的 15甘油重悬细胞沉淀 ； 0054 (5)4以 4000g 离心 10min 后弃掉液体， 回收菌体 ； 0055 (6) 重复步骤 4、 步骤 5 各一次 ； 0056 (7) 最后将菌体重悬于原体积 1/。
24、10 的 10甘油中， 并分装至 1.5ml 离心管中， 每 管 90l， 并冷冻保存， 备用 ； 0057 B、 电击消除 ： 0058 (1) 将感受态细胞置于冰上融化后， 加入 10 特殊电击缓冲液后混匀， 并置于冰 上放置 10min ； 0059 (2) 将感受态细胞全部转移至 1mm 的电击杯中， 1.8KV/5ms 电击一次 ； 0060 (3) 电击后立即加入 1ml 的 SOC 培养基， 37温育 30min ； 0061 (4) 将感受态细胞分别涂布至 LBG 平板和卡那霉素抗性平板中 ； 0062 (5) 将平板倒置后于 37培养， 24h 后 LBG 平板和卡那霉素抗性。
25、平板均长出单菌 落 ； 0063 C、 挑取质粒消除菌 ： 0064 (1) 用灭菌的牙签， 将 LBG 平板上长出的菌落， 分别接种到 LBG 固体平板和卡那霉 素抗性平板中的相应位置， 过夜培养 ； 0065 (2) 将在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出， 再分别接 种到 LBG 固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置， 过夜培养 ； 0066 (3) 挑出只在 LBG 平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落 ； 0067 (4) 挑出单菌落后， 提取质粒。质粒提取方法参见分子克隆中碱裂解方法 (Sambrook J， Fritsch EF， Maniat。
26、is T.Molecular Cloning ： A laboratory manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press.New York， 1989.)， 琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消 除 ； 0068 所述的大肠杆菌包括大肠杆菌系列菌 ： 大肠杆菌 SCS110、 大肠杆菌 JM109、 大肠杆 菌DH5。 可消除的质粒包括广泛的以大肠杆菌为宿主的pK19mobsacB等含有pBR322复制 起始位点的质粒。 0069 结果如下 ： 说 明 书 CN 103160493 A 6 5/5 页 7 0070 将带有外源质粒pK19mobsacB的感受态。
27、大肠杆菌SCS110、 大肠杆菌JM109、 大肠杆 菌 DH5 分别和特殊电击缓冲液混合后电击， 经过电激后恢复培养 30 分钟， 涂卡那霉素平 板和 LBG 平板上， 37培养 24h 后， 大肠杆菌 SCS110 卡那霉素平板上长出 37 个单菌落， LBG 平板上长出 454 个单菌落， 质粒消除率达到 91.9 ； 大肠杆菌 JM109 卡那霉素平板上长出 54 个单菌落， LBG 平板上长出 597 个单菌落， 质粒消除率达到 91。大肠杆菌 DH5 卡那 霉素平板上长出 31 个单菌落， LBG 平板上长出 447 个单菌落， 质粒消除率达到 93。 0071 挑出只在 LBG 。
28、平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落， 碱裂解法提 取质粒， 以观察该菌株是否含有质粒， 质粒的琼脂糖电泳图如图 1， 泳道 M 为 Lambda DNA/ HindIII Marker ； 泳道 1 为从大肠杆菌 SCS110 提取后并经 EcoR I 酶切后的 pK19mobsacB ； 泳道2为从大肠杆菌JM109提取后并经EcoR I酶切后的pK19mobsacB ； 泳道3为从大肠杆菌 DH5提取后并经EcoR I酶切后的pK19mobsacB ； 泳道4为消除质粒后的大肠杆菌SCS110 ； 泳道 5 为消除质粒后的大肠杆菌 JM109 ； 泳道 6 为消除质粒后的大肠杆菌 DH5 ； 从图中可 以看出， 大肠杆菌 SCS110、 JM109、 DH5 质粒均完全消除。 说 明 书 CN 103160493 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103160493 A 8 。