《组织再生材料的制作方法和组织再生材料.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织再生材料的制作方法和组织再生材料.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103157142 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103157142 A *CN103157142A* (21)申请号 201210528469.3 (22)申请日 2012.12.10 2011-275555 2011.12.16 JP A61L 27/56(2006.01) A61L 27/38(2006.01) C12N 5/00(2006.01) (71)申请人 株式会社 GC 地址 日本东京都 (72)发明人 山中克之 山本克史 坂井裕大 重光勇介 (74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限 责任公司 11219 代理人 金龙河 穆。
2、德骏 (54) 发明名称 组织再生材料的制作方法和组织再生材料 (57) 摘要 本发明提供一种组织再生材料的制作方法 和组织再生材料。本发明的制作方法， 使多孔质 体 (11) 的底面与保持板 (1) 的表面接触， 所述保 持板是对于水的接触角为 590的树脂板或玻 璃板， 所述多孔质体由细胞密度为 51061108 个 细 胞 /ml 的 细 胞 悬 液 (12) 充 满， 厚 度 为 2100mm， 具有 孔 径 为 1803500m、 平均 孔 径 为 3502000m 的连通的小孔结构， 气孔率为 6095%， 压缩强度为 0.05lMPa， 并且由生物体吸 收性高分子材料构成 ； 然。
3、后， 在从重力方向观察 时保持板在多孔质体的上侧且保持板的重量不施 加于多孔质体的状态下在气体中静止来在多孔质 体中接种细胞。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103157142 A CN 103157142 A *CN103157142A* 1/1 页 2 1. 一种组织再生材料的制作方法， 其中， 使多孔质体的底面与保持板的表面接触， 所 述保持板是对于水的接触角为 1590的树脂板或玻璃板， 所述多孔质体。
4、由细胞密度为 51061108个细胞 /ml 的细胞悬液充满， 厚度为 2100mm， 具有孔径为 1803500m、 平 均孔径为 3502000m 的连通的小孔结构， 气孔率为 6095%， 压缩强度为 0.05lMPa， 并且 由生物体吸收性高分子材料构成 ； 然后， 在从重力方向观察时所述保持板在所述多孔质体的上侧并且所述保持板的重量 不施加于所述多孔质体的状态下在气体中静止来接种细胞。 2. 一种组织再生材料， 其中， 在多孔质体中以 51061108个细胞 /ml 的浓度接种有 细胞， 所述多孔质体的厚度为 2100mm， 具有孔径为 1803500m、 平均孔径为 3502000。
5、m 的连通的小孔结构， 气孔率为 6095%， 压缩强度为 0.051MPa， 并且由生物体吸收性高分子 材料构成。 3. 如权利要求 2 所述的组织再生材料， 其中， 所述多孔质体的气孔率为 8090%。 4. 如权利要求 2 或 3 所述的组织再生材料， 其中， 所述多孔质体的所述平均孔径为 5401200m。 5. 如权利要求 24 中任一项所述的组织再生材料， 其中， 所述多孔质体中将会相接触 地配置到保持板上的表面即底面的面积为 05200cm2。 权 利 要 求 书 CN 103157142 A 2 1/7 页 3 组织再生材料的制作方法和组织再生材料 技术领域 0001 本发明涉。
6、及向多孔质的支撑体(多孔质体)导入细胞悬液来进行接种的组织再生 材料的制作方法和组织再生材料。 背景技术 0002 组织工程领域中正使用在具有连通的多孔质结构的支撑体即多孔质体中接种有 细胞的组织再生材料。 重要的是， 在多孔质体中， 直至中心部以三维连通的方式存在用于培 养细胞的小孔。 0003 实际上， 难以使细胞、 培养液、 培养液中混合有细胞的溶液 ( 以下有时称为 “细胞 悬液” ) 完全渗透到多孔质体的小孔中， 仅仅向多孔质体中滴加细胞悬液或者将多孔质体浸 渍到细胞悬液中， 细胞悬液也不会进入到多孔质体的中心部。 0004 对此， 专利文献 1 中， 例如如权利要求 8 中记载的那。
7、样， 提出了一种通过使多孔质 体沉入细胞悬液中并置于减压或真空下而使细胞悬液渗透到多孔质体中的方法。 0005 专利文献 2、 3 中公开了通过使多孔质体中预先含有水并同时将该水与细胞悬液 交替而将细胞悬液导入多孔质体中的方法。 0006 专利文献 4 中， 为了使形成在多孔质体中的孔较大而使细胞悬液容易进入并且即 使为这样较大的孔也能使细胞悬液保留在多孔质体内， 公开了一种向细胞悬液中添加胶 原、 明胶等增稠成分的方法。 由此， 认为能够在多孔质体中导入细胞悬液并使其保留在多孔 质体中。 0007 专利文献 1 ： 日本特表 2006-508717 号公报 0008 专利文献 2 ： 日本特。
8、开 2007-181459 号公报 0009 专利文献 3 ： 日本特开 2009-195682 号公报 0010 专利文献 4 ： 日本特开 2003-038635 号公报 0011 但是， 对于专利文献 1 记载的技术而言， 即使利用负压， 实际上也难以使细胞悬液 渗透到整个多孔质体中， 因此， 需要利用激光等形成使细胞悬液渗透的路径。另外， 利用负 压而使压力发生较大变化对于细胞而言未必是理想的状态。 0012 对于专利文献 2、 3 公开的技术而言， 虽然能够在整个多孔质体中接种细胞， 但是， 一部分细胞悬液会流出， 因此， 存在导入的细胞的数量不准确的缺点。 0013 特别是对于专利。
9、文献 13 记载的技术而言， 存在如下问题 ： 多孔质体的小孔较小， 从而使以水作为主要成分的细胞悬液无法充分地渗透至多孔质体的中心部。因此， 如果使 用具有较大孔(孔径180m3500m、 平均孔径350m2000m)的小孔结构的多孔质体， 则能够使细胞悬液容易地渗透至中心。 但是， 在这种较大孔径的情况下， 细胞悬液容易从多 孔质体中通过， 从而使细胞悬液难以保留在多孔质体内。 0014 对此， 根据专利文献 4 记载的技术， 虽然能够使细胞悬液容易渗透至多孔质体的 中心， 但是， 增稠成分会残留在多孔质体中， 因此， 存在难以更换新的培养液的问题。 说 明 书 CN 103157142 。
10、A 3 2/7 页 4 发明内容 0015 因此， 本发明的课题在于提供一种组织再生材料的制作方法， 其能够稳定且不浪 费地向具有较大的孔(孔径180m3500m、 平均孔径350m2000m)、 即不易使细胞悬 液保留在多孔质体内的小孔的多孔质体中导入细胞悬液从而接种细胞。此外， 本发明提供 组织再生材料。 0016 以下， 对本发明进行说明。在此， 为了便于理解， 将附图中所附的参考标号用括号 括起而一并进行记载， 但本发明并不限定于此。 0017 第一发明为一种组织再生材料的制作方法， 其中， 使多孔质体 (11) 的底面与保持 板 (1) 的表面接触， 所述保持板 （1） 是对于水的接。
11、触角为 1590的树脂板或玻璃板， 所 述多孔质体 （11） 由细胞密度为 51061108个细胞 /ml 的细胞悬液 (12) 充满， 厚度为 2100mm， 具有孔径为 1803500m、 平均孔径为 3502000m 的连通的小孔结构， 气孔率为 6095%， 压缩强度为 0.05lMPa， 并且由生物体吸收性高分子材料构成 ； 然后， 在从重力方 向观察时保持板在多孔质体的上侧并且保持板的重量不施加于多孔质体的状态下在气体 中静止来接种细胞。 0018 第二发明为一种组织再生材料 (10)， 其中， 在多孔质体 (11) 中以 51061108 个细胞 /ml 的浓度接种有细胞 (13。
12、)， 所述多孔质体的厚度为 2100mm， 具有孔径为 1803500m、 平均孔径为 3502000m 的连通的小孔结构， 气孔率为 6095%， 压缩强度为 0.051MPa， 并且由生物体吸收性高分子材料构成。 0019 第三发明为如第二发明所述的组织再生材料 (10)， 其中， 多孔质体 (11) 的气孔率 为 8090%。 0020 第四发明为如第二发明或第三发明所述的组织再生材料 (10)， 其中， 多孔质体 (11) 的平均孔径为 5401200m。 0021 第五发明为如第二发明至第四发明中任一项所述的组织再生材料 (10)， 其中， 多 孔质体 (11) 中将会相接触地配置到。
13、保持板 (1) 上的表面即底面的面积为 0.5200cm2。 0022 发明效果 0023 根据本发明， 能够向具有较大的孔、 即不易使细胞悬液保留在其内侧的小孔的多 孔质体中导入细胞悬液， 并且能够稳定且不浪费地在该多孔质体中接种细胞。 附图说明 0024 图 1 是对组织再生材料的制作方法 S10 的步骤进行说明的图。 0025 图 2 是对组织再生材料的制作方法 S10 的步骤进行说明的另一图。 0026 图 3 是表示多孔质体的另一实施方式例的图。 0027 图 4 是对组织再生材料的制作方法 S20 的步骤进行说明的图。 0028 图 5 是对组织再生材料的制作方法 S20 的步骤进。
14、行说明的另一图。 0029 标号说明 0030 1 保持板 0031 2 预载置板 0032 10 组织再生材料 0033 11 多孔质体 说 明 书 CN 103157142 A 4 3/7 页 5 0034 12 细胞悬液 具体实施方式 0035 通过接下来进行说明的具体实施方式来明确本发明的上述作用和优势。以下， 基 于附图所示的实施方式对本发明进行说明。但是， 本发明并不限定于这些实施方式。 0036 图 1、 图 2 是对一个实施方式的组织再生材料的制作方法 S10( 以下有时记为 “制 作方法 S10” ) 进行说明的图。图 1、 图 2 是表示制作方法 S10 的步骤中的情形的图。
15、。在此， 组织再生材料 10 是指接种有细胞的多孔质体 11。 0037 制作方法 S10 具有载置步骤 S11、 细胞悬液导入步骤 S12 和翻转步骤 S13。 0038 如图 1(a) 所示， 载置步骤 S11 为在保持板 1 上载置多孔质体 11 的步骤。 0039 在此， 保持板 1 优选为对于水的接触角为 15 90的树脂板或玻璃板。对于这 种保持板 1 而言， 可以通过将以往作为对细胞进行静置培养的容器使用的培养皿、 烧瓶、 多 孔板等中使用的玻璃材料或聚苯乙烯、 聚乙烯、 聚对苯二甲酸乙二醇酯等树脂材料加工成 板状后使用。 这些材料的疏水性高， 因此， 优选根据需要预先通过电晕、。
16、 射线、 氩射线等的 等离子体处理等化学方法对要使多孔质体 11 接触的表面导入极性基团来提高亲水性， 从 而使对于水的接触角达到 15 90。另外， 可以在所要接触的表面上形成陶瓷被膜。优 选所要接触的表面是平滑的， 但也可以设置有高度为数百微米的凹槽或条状突起等。 0040 多孔质体 11 由生物体吸收性高分子材料形成， 并且厚度 ( 在载置于保持板 1 上的 状态下的上下方向的尺寸 ) 为 2mm100mm， 优选为 2.1mm70mm。多孔质体 11 具有孔径为 180m3500m、 平均孔径为 350m2000m 的连通的小孔结构， 气孔率为 60%95%。另 外， 以多孔质体 11。
17、 的压缩强度达到 0.05MPa1MPa 的方式构成。需要说明的是， 本发明中的 多孔质体的孔的孔径是指在不考虑小于 10m 这样的仅使液体通过的微小气孔的情况下 在整个多孔质体中 10m 以上的气孔的 80% 以上为孔径 180m3500m。需要说明的是， 在此，“气孔率” 为由相同体积的多孔质体的重量相对于所使用的生物体吸收性高分子材料 的原料块的重量计算得到的值。 0041 在此， 气孔率小于60%时， 细胞培养的效率降低， 而超过95%时， 多孔质体的强度降 低。因此， 气孔率进一步优选为 80%90%。另外， 孔径小于 180m 时， 难以使细胞自由通过， 从而无法将细胞充分地接种到。
18、多孔质体的内部。另一方面， 孔径大于 3500m 时， 多孔质体 的强度降低。 0042 另外， 平均孔径优选为 540m1200m。 0043 关于上述压缩强度， 压缩强度低于 0.05MPa 时， 多孔质体会因添加细胞悬液时的 表面张力、 培养细胞时受到的来自细胞悬液的细胞的伸展应力而产生收缩。 另一方面， 制作 超过 1MPa 的多孔质体在技术上来说较困难。需要说明的是， 在此，“压缩强度” 是指将直径 10mm 高度 2mm 的圆柱形试验体以 1mm/ 分钟的十字头速度压缩时的压缩断裂强度。 0044 关于多孔质体的厚度， 由于是以使细胞悬液充分地渗透至多孔质体的中心部作为 目的， 因。
19、此， 使用厚度小于 2mm 的多孔质体的必要性较小。另一方面， 超过 100mm 时， 难以导 入细胞或者难以进行长时间培养。 0045 对于上述多孔质体的形状而言， 如图 1、 图 2 所示基本上为立方体， 此外也优选半 圆形或穹顶形， 但只要能够如后所述经过翻转步骤 S13 后在从重力方向观察时上述保持板 说 明 书 CN 103157142 A 5 4/7 页 6 1 在上侧并且保持板 1 的重量不施加于多孔质体的状态下在气体中静止来接种细胞则没有 特别限定。例如如图 3 所示可以为圆板状。 0046 优选为此时的多孔质体的底面积 ( 与保持板 1 相接触的表面的面积 ) 相对于厚度 具。
20、有充分大小的面积的形状。具体而言， 在多孔质体的体积 1cm350000cm3的范围内， 底面 积优选为 0.5cm2200cm2。小于 0.5cm2或超过 200cm2时， 难以在悬挂于保持板上的状态下 进行接种。需要说明的是， 可以在多孔质体的生物体吸收性高分子材料内分散粉末状磷酸 钙， 例如羟基磷灰石或 - 三磷酸钙。 0047 构成多孔质体的材料为生物体吸收性高分子材料， 只要能够在体内维持其形态一 定时间则可以没有特别限定地使用。可以例示例如选自以往使用的聚乙醇酸、 聚乳酸、 乳 酸 - 乙醇酸共聚物、 聚 - 己内酯、 乳酸 - 己内酯共聚物、 聚氨基酸、 聚原酸酯以及它们 的共聚。
21、物中的至少一种。其中， 从被美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准为对人体无害的 高分子及其实际效果的方面出发， 最优选聚乙醇酸、 聚乳酸、 乳酸 - 乙醇酸共聚物。生物体 吸收性高分子材料的重均分子量优选为 50002000000， 更优选为 10000500000。 0048 多孔质体的制作方法没有特别限定， 可以列举例如下述制作方法 ： 在将生物体吸 收性高分子材料溶解于有机溶剂中而成的溶液中， 大致均匀地混合不溶于该有机溶剂、 并 且能够用不溶解生物体吸收性高分子材料的液体溶解的、 粒径为 100m2000m 的粒状 物质， 并对其进行冷冻。 然后， 进行干燥而除去有机溶剂， 由此制。
22、作含有粒状物质的、 具有孔 径为 5m50m 的小孔结构的多孔质生物体吸收性高分子。然后， 将该多孔质生物体吸收 性高分子用磨机等粉碎后， 利用不溶解生物体吸收性高分子的液体溶解粒状物质而除去， 然后， 过筛而得到平均粒径为 100m3000m 的生物体吸收性颗粒状多孔物质， 将上述生 物体吸收性颗粒状多孔物质装入到预定形状的容器内， 进行加压加热。 0049 接下来对制作方法S10进行说明。 通过载置步骤S11， 形成保持板1的表面上载置 有多孔质体 11 的状态， 接着， 在细胞悬液导入步骤 S12 中， 如图 1(b) 所示， 通过例如滴加或 注入等方法向多孔质体 11 中导入细胞悬液 。
23、12。由此， 如图 2(a) 所示， 形成细胞悬液 12 渗 透到多孔质体 11 内并且多孔质体 11 由细胞悬液 12 完全充满的状态。此时， 相对于多孔质 体 11 的体积， 细胞悬液 12 的量过多时， 存在后述的翻转步骤 S13 难以进行或者培养的效率 降低的趋势， 因此， 优选导入可浸透整个多孔质体11且不从多孔质体11中过量漏出的量的 细胞悬液。 0050 导入的细胞悬液的细胞密度为 5106个细胞 /ml1108个细胞 /ml。另外， 被培 养的细胞可以自由地使用各种细胞。 可以使用例如 ： 表皮细胞、 角质形成细胞、 脂肪细胞、 肝 细胞、 神经细胞、 神经胶质细胞、 星形胶质。
24、细胞、 上皮细胞、 乳房表皮细胞、 胰岛细胞、 内皮细 胞、 间质细胞、 真皮成纤维细胞、 间皮细胞、 造骨细胞、 平滑肌细胞、 横纹肌细胞、 韧带成纤维 细胞、 跟腱成纤维细胞和软骨细胞、 骨髓细胞、 成骨细胞、 牙胚细胞、 牙周膜细胞、 牙髓细胞、 成体干细胞或 ES 细胞等。 0051 接着， 通过翻转步骤S13， 从图2(a)所示的状态翻转至保持板1在上且含有细胞悬 液 12 的多孔质体 11 在下而形成图 2(b) 所示的状态。即， 在从重力方向观察时保持板 1 在 多孔质体 11 的上侧并且保持板 1 的重量不施加于多孔质体 11 的状态下在气体中静止。在 该状态下维持静止， 使导。
25、入的细胞贴附到多孔质体 11 的孔的内壁上而完成接种， 从而形成 组织再生材料10。 为了使细胞贴附到多孔质体上而在气体中静止的时间根据多孔质体的材 说 明 书 CN 103157142 A 6 5/7 页 7 质、 细胞的种类而不同， 一般为 20 分钟 300 分钟。 0052 根据如上所述的制作方法 S10， 由于多孔质体 11 具有较大的孔， 因此能够使细胞 悬液适度地渗透至多孔质体 11 的内部。而且， 通过如上所述在从重力方向观察时保持板 1 在多孔质体 11 的上侧并且保持板 1 的重量不施加于多孔质体 11 的状态下在气体中静止， 能够最终以细胞悬液 12 不从多孔质体 11 。
26、中漏出的方式保持细胞悬液。于是， 能够稳定且 不浪费地导入细胞悬液 12 而将细胞接种到多孔质体中。之后， 接种有细胞的多孔质体即组 织再生材料 10 可以通过现有的方法来进行细胞培养。 0053 另外， 为了实现上述制作方法， 优选使用如上所述的接种有细胞悬液的多孔质体。 由此， 能够制成可实现上述效果的组织再生材料。 0054 图 4、 图 5 是对另一实施方式的组织再生材料的制作方法 S20( 以下有时记为 “制 作方法 S20” ) 进行说明的图。图 4、 图 5 是表示制作方法 S20 的步骤中的情形的图。需要 说明的是， 本实施方式中， 对与上述实施方式中已说明的部分共通的部分标记。
27、相同标号并 省略说明。 0055 制作方法 S20 具有预载置步骤 S21、 细胞悬液导入步骤 S22、 夹持步骤 S23 和保持 步骤 S24。 0056 预载置步骤 S21 为在拒水性高的板状构件即预载置板 2 上载置多孔质体 11 的步 骤。预载置板 2 优选为对于水的接触角大于 90的树脂板或玻璃板。 0057 细胞悬液导入步骤 S22 与上述细胞悬液导入步骤 S12 一样， 向多孔质体 11 导入细 胞悬液 12。由此， 如图 4(b) 所示， 形成细胞悬液 12 渗透而充满整个多孔质体 11 的状态。 0058 如图 5(a) 所示， 夹持步骤 S23 为以将由细胞悬液充满的多孔质。
28、体 11 夹在保持板 1 与预载置板 2 之间的方式使多孔质体 11 与保持板 1 的表面相接触的步骤。 0059 如图 5(b) 所示， 保持步骤 S24 为将与多孔质体 11 相接触的保持板 1 向上提起而 使多孔质体 11 保持在保持板 1 侧并从预载置板 2 上脱离的步骤。由此， 多孔质体 11 与上 述实施方式同样地在从重力方向观察时保持板 1 在多孔质体 11 的上侧并且保持板 1 的重 量不施加于多孔质体 11 的状态下在气体中静止。在该状态下维持静止， 使导入的细胞贴附 到多孔质体 11 的内壁上而完成接种， 从而形成组织再生材料 10。 0060 在此， 预载置板2由具有拒水。
29、性的板构成， 保持板1由具有亲水性的板构成， 因此， 能够适当进行由细胞悬液充满的多孔质体的如上所述的保持、 脱离。 0061 实施例 0062 以下， 通过实施例对本发明更具体地进行说明， 但本发明并不受这些实施例的限 定。 0063 0064 移植细胞 A ： 从人髂骨骨髓液中提取的间质干细胞 0065 将从人髂骨骨髓液中提取的细胞用 10%FBS、 DMEM 培养基混悬， 然后， 以有核细胞 数为 1105个细胞 /10cm 直径的培养皿进行接种。在 37下、 在 5% 二氧化碳存在下进行 培养。在第 3 天更换培养基， 并除去非贴壁细胞 ( 造血系细胞 )。之后， 每 3 天更换一次培。
30、 养基。从第 5 天开始以 3ng/m1 向培养基中添加 bFGF。10 天左右增殖至大致铺满的程度。 将上述培养皿用胰蛋白酶 (0.05%) EDTA(0.2mM) 孵育 5 分钟， 分离出细胞。用 Coulter 计数仪(Z1， 库尔特公司制造)计测细胞数， 以5000个细胞/cm2的密度接种细胞。 说 明 书 CN 103157142 A 7 6/7 页 8 重复该操作， 使用从达到大致铺满 ( ) 的程度的第二代传代培养皿中得到 的第三代细胞。 0066 移植细胞 B ： 从人颚骨骨髓液中提取的间质干细胞 0067 将从人颚骨骨髓液中提取的细胞用 10%FBS、 DMEM 培养基混悬，。
31、 然后， 以有核细胞 数为 1105个细胞 /10cm 直径的培养皿进行接种。在 37下、 在 5% 二氧化碳存在下进行 培养。在第 3 天更换培养基， 并除去非贴壁细胞 ( 造血系细胞 )。之后， 每 3 天更换一次培 养基。从第 5 天开始以 3ng/m1 向培养基中添加 bFGF。10 天左右增殖至大致铺满的程度。 将上述培养皿用胰蛋白酶 (0.05%) EDTA(0.2mM) 孵育 5 分钟， 分离出细胞。用 Coulter 计数仪(Z1， 库尔特公司制造)计测细胞数， 以5000个细胞/cm2的密度接种细胞。 重复该操作， 重复该操作， 使用从达到大致铺满()的程度的第二代传代培 养。
32、皿中得到的第三代细胞。 0068 移植细胞 C ： 从人耳廓软骨中提取的软骨细胞 0069 用手术刀将人耳廓软骨细细切碎， 用胶原酶在 37下处理 30 分钟而得到细胞悬 液， 将该悬液用 10%FBS、 DMEM 培养基混悬， 然后， 以有核细胞数为 1105个细胞 /10cm 直径 的培养皿进行接种。在 37下、 在 5% 二氧化碳存在下进行培养。在第 3 天更换培养基， 并 除去非贴壁成分 ( 细胞组织片 )。之后， 每 3 天更换一次培养基。从第 5 天开始以 3ng/ m1 向培养基中添加 bFGF。10 天左右增殖至大致铺满的程度。将上述培养皿用胰蛋白酶 (0.05%) EDTA(。
33、0.2mM) 孵育 5 分钟， 分离出细胞。用 Coulter 计数仪 (Z1 ， 库尔 特公司制造 ) 计测细胞数， 以 5000 个细胞 /cm2的密度接种细胞。重复该操作， 使用从达到 大致铺满 ( ) 的程度的第二代传代培养皿中得到的第三代细胞。 0070 0071 多孔质体 A ： 聚乳酸乙醇酸共聚物 (PLGA) 块 0072 使分子量为 250000 的 DL- 乳酸 / 乙醇酸共聚物溶解在二烷中， 然后， 与粒径约 为 500m 的氯化钠混合， 并冷冻干燥， 粉碎并脱盐， 将由此得到粉末状材料压缩加热成形， 由此， 制作平均孔径为 540m、 气孔率为 90%、 压缩强度为 0。
34、.2MPa、 直径为 9mm 且厚度为 3mm 的由生物体吸收性合成高分子构成的块状多孔质体。 0073 多孔质体 B ： 聚乳酸乙醇酸共聚物 (PLGA) 块 0074 使分子量为 250000 的 DL- 乳酸 / 乙醇酸共聚物溶解在二烷中， 然后， 使粒径为 10m 的羟基磷灰石粉分散， 与粒径约为 500m 的氯化钠混合， 并冷冻干燥， 粉碎并脱盐， 将由此得到粉末状材料压缩加热成形， 由此， 制作平均孔径为 540m、 气孔率为 90%、 压缩 强度为0.2MPa、 直径为13mm且厚度为5mm的由生物体吸收性合成高分子和磷酸钙材料构成 的块状多孔质体。 0075 0076 使多孔质。
35、体 A 的圆盘状底面与玻璃板 ( 尺寸为 100mm100mm2mm， 相对于水的 接触角为 28 ) 的上表面接触而载置。将在软骨分化用培养液 (MEM、 葡萄糖 4.5mg/ml、 10-7M 地塞米松、 50g/ml 的抗坏血酸 -2- 磷酸、 10ng/ml 的 TGF-、 6.25g/ml 的胰岛素、 6.25g/ml 的转铁蛋白、 6.25ng/ml 的硒酸、 5.33g/ml 的亚油酸、 1.25mg/m1 的牛血清白 蛋白 ) 中以 2107个细胞 /m1 的密度混悬而得到的 0.19m1 的移植细胞 A 滴加到多孔质体 A 中来进行导入。在将玻璃板翻转而呈倒置的状态下， 在 。
36、37、 湿度为 100%、 5%CO2的条件 说 明 书 CN 103157142 A 8 7/7 页 9 下用 30 分钟使细胞贴附到材料上， 由此将细胞接种到多孔质体 A 上， 得到组织再生材料。 0077 然后， 装入到充满软骨分化用培养液的 50ml 离心管中， 在 37下每 3 天更换一次 培养基来培养 4 周， 制作了软骨组织再生用细胞移植体。 0078 0079 使 多 孔 质 体 B 的 圆 盘 状 底 面 与 等 离 子 体 处 理 聚 苯 乙 烯 板 ( 尺 寸 为 50mm50mm2mm， 相对于水的接触角为 71 ) 的上表面接触而载置。将在骨分化用培养 液 (MEM、。
37、 葡萄糖 4.5mg/ml、 10% 的 FBS、 10-7M 地塞米松、 50g/ml 的抗坏血酸 -2- 磷酸、 10mM 的 - 甘油磷酸 ) 中以 5107个细胞 /m1 的密度混悬而得到的 0.67ml 的移植细胞 B 滴加到多孔质体 B 中来进行导入。在将等离子体处理聚苯乙烯板翻转而呈倒置的状态下， 在 37、 湿度为 100%、 5%CO2的条件下用 100 分钟使细胞贴附到材料上， 由此将细胞接种到 多孔质体 B 上， 得到组织再生材料。 0080 然后， 装入到充满骨分化用培养液的 50ml 离心管中， 在 37下每 3 天更换一次培 养基来培养 2 周， 制作了骨组织再生用。
38、细胞移植体。 0081 0082 使多孔质体B的圆盘状底面与等离子体处理丙烯酸板(尺寸为50mm50mm2mm， 相对于水的接触角为 58 ) 的上表面接触而载置。将在软骨分化用培养液 (MEM、 葡萄糖 4.5mg/ml、 10-7M 地塞米松、 50g/ml 的抗坏血酸 -2- 磷酸、 10ng/ml 的 TGF-、 6.25g/ml 的胰岛素、 6.25g/ml的转铁蛋白、 6.25ng/ml的硒酸、 5.33g/ml的亚油酸、 1.25mg/m1的 牛血清白蛋白 ) 中以 2107个细胞 /m1 的密度混悬而得到的 0.67ml 的移植细胞 C 滴加到 多孔质体 B 中来进行导入。在将。
39、等离子体处理丙烯酸板翻转而呈倒置的状态下， 在 37、 湿度为100%、 5%CO2的条件下用30分钟使细胞贴附到材料上， 由此将细胞接种到多孔质体B 上， 得到组织再生材料。 0083 然后， 装入到充满软骨分化用培养液的 50ml 离心管中， 在 37下每 3 天更换一次 培养基来培养 4 周， 制作了软骨组织再生用细胞移植体。 0084 0085 将多孔质体A放置到拒水处理后的玻璃板(尺寸为50mm50mm2mm， 相对于水的 接触角为 114 ) 上。将在骨分化用培养液 (MEM、 葡萄糖 4.5mg/ml、 10% 的 FBS、 10-7M 地 塞米松、 50g/ml 的抗坏血酸 -。
40、2- 磷酸、 10mM 的 甘油磷酸 ) 中以 5107个细胞 /m1 的 密度混悬而得到的 0.19ml 的移植细胞 B 滴加到多孔质体 A 中来进行导入。自放置有多孔 质体A的玻璃板的上方平稳地放下等离子体处理聚苯乙烯板(尺寸为50mm50mm2mm， 相 对于水的接触角为 71 )， 从而以轻轻地夹持的方式使多孔质体 A 与等离子体处理聚苯乙 烯板面接触。将接触后的等离子体处理聚苯乙烯板慢慢向上提拉， 使多孔质体 A 保持在等 离子体处理聚苯乙烯板侧并从玻璃板上脱离。使多孔质体 A 在从重力方向观察时等离子体 处理聚苯乙烯板为上侧并且等离子体处理聚苯乙烯板的重量不施加于多孔质体 A 的状。
41、态 下在气体中静止， 并在倒置的状态下在 37、 湿度为 100%、 5%CO2的条件下用 100 分钟使细 胞贴附到材料上， 由此将细胞接种到多孔质体 A 上， 得到组织再生材料。 0086 然后， 装入到充满骨分化用培养液的 50ml 离心管中， 在 37下每 3 天更换一次培 养基来培养 2 周， 制作了骨组织再生用细胞移植体。 说 明 书 CN 103157142 A 9 1/5 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103157142 A 10 2/5 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 103157142 A 11 3/5 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103157142 A 12 4/5 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 103157142 A 13 5/5 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103157142 A 14 。