一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103157106 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103157106 A *CN103157106A* (21)申请号 201210578183.6 (22)申请日 2012.12.27 CCTCC NO ： C2012178 2012.11.14 CCTCC NO ： V201250 2012.11.14 CCTCC NO:C2012180 2012.11.14 A61K 39/23(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12N 7/02(2006.01) (71)申请人 瑞普 （保定） 生物药业有限公司 地址 07100。

2、1 河北省保定市工业园区腾飞路 793 号 (72)发明人 郑朝朝 李晓艳 刘涛 刘超 郁宏伟 李建丽 杨保收 梁武 柳珊 (74)专利代理机构 石家庄冀科专利商标事务所 有限公司 13108 代理人 李羡民 郭绍华 (54) 发明名称 一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法 (57) 摘要 一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 属 于生物技术领域。所述方法包括以下步骤 ： a. 制 苗用细胞的培养 ； b. 病毒接种与培养 ； c. 病毒液 收获 ； d. 病毒液灭活 ； e. 疫苗制备。本发明对制 苗用种毒及细胞进行了筛选， 加强了病毒与细胞 的匹配性 ； 采用激流灌注式生物反应器培养体系 提。

3、高了病毒的增殖滴度及收获量 ； 对于乳化工艺 的改进提升了免疫效果 ； 而且整个生产工艺不涉 及其他生物安全和公共卫生问题， 适合于大规模 生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103157106 A CN 103157106 A *CN103157106A* 1/2 页 2 1. 一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 它利用激流灌注式生物反 应器为培养系统， 所述激流灌注式生物反应器包括第一。

4、蠕动泵 （1） 、 第二蠕动泵 （2） ， 第一 硅胶管 （3） 、 第二硅胶管 （4） 、 激流罐 （5） 、 灌注袋 （6） 、 有孔硅胶管 （7） 和聚酯纤维纸片载体 （8） ； 所述灌注袋 （6） 为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋， 两个灌注袋结构与功能完全 相同， 以相同的方式与激流罐 （5） 连接， 通过外源泵实现物质交换 ； 灭活疫苗的制备按以下步骤进行 ： a. 制苗用细胞的培养 将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液的混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注 袋 （6） ， 使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体 （8） 上， 接种密度为每克载体接种 0.8 1.2107 个细胞， 设定设备。

5、参数 ： 温度 T1 ： 37.5 38、 T2 ： 43 46、 T3 ： 35.5 37， pH ： 7.2 7.8， DO ： 30% 70%、 振荡速度 40 55r/min， 空气流量 100ml/min 1000ml/min， 启动细胞 培养程序， 进行细胞培养， 得到制苗用细胞 ； b. 病毒接种与培养 当细胞单日耗糖趋于平稳时， 表明细胞达到接毒要求， 排空反应器内液体， 将猪细小病 毒种毒接种制苗用细胞， 设定设备参数 ： 温度T1 ： 3538、 T2 ： 3740、 T3 ： 3436， pH ： 7.37.8， DO ： 30%70%， 振荡速度3550r/min， 空。

6、气流量400 ml/min4000ml/min， 启动病毒培养程序， 扩增培养猪细小病毒 ； c. 病毒液收获 病毒培养 40 42h 后， 收获激流罐 （5） 与灌注袋 （6） 内的病毒液， 将灌注袋 （6） 反复冻 融 2 3 次后收获上清液， 混合后 -20保存备用 ； 检测病毒液效价和血凝价 ； d. 病毒液灭活 收获的病毒液中加入灭活剂， 灭活病毒 ； e. 疫苗制备 灭活的病毒液加入佐剂， 乳化制备成猪细小病毒病灭活疫苗。 2. 根据权利要求 1 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 a 中， 种子细胞为猪肾细胞 IBRS-2 或猪睾丸传代细胞 ST， 均为经。

7、过有限稀释法克隆纯化筛选的 细胞， 应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化， 扩大培养建立单克隆化细胞库， 通过血 凝和 TCID50筛选猪细小病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。 3. 根据权利要求 2 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 a 中， 细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液， 当残糖量低于 2g/L 时， 流加补充细胞 生长液， 流加量以培养液残糖量不低于 1g/L 为准， 当培养液体积达到有效培养体积时， 进 行换液。 4. 根据权利要求 3 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 a 中， 逐日增大空气流量， 每 24 时增。

8、加 100ml/min 1000ml/min。 5. 根据权利要求 4 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 b 中， 猪细小病毒种毒是经过蚀斑法纯化筛选的优良种毒。 6. 根据权利要求 5 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 b 中， 病毒接种前将种毒混于细胞维持液中， 种毒与细胞维持液按 V/V 为 1% 3% 混合， 病毒接种 时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中， 无需吸附， 直接启动病毒培养程序扩增 权 利 要 求 书 CN 103157106 A 2 2/2 页 3 培养病毒。 7. 根据权利要求 6 所述的制备猪细小病毒病灭活疫。

9、苗的方法， 其特征在于， 步骤 b 中， 病毒培养 12h 时开始持续流加补充含 n 倍浓缩 DMEM 液和 200g/L 葡萄糖， 流加速度以培养 液残糖量不低于 1g/L 为准 ； 所述 n 等于 25。 8. 根据权利要求 7 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 所述 n 倍 浓缩 DMEM 液配制方法为 ： 1 份 DMEM 干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成 1DMEM 液后， 再加入 （n-1） 份无 Na-DMEM 干粉培养基， 溶解即成 ； 所述 n 等于 25。 9. 根据权利要求 8 所述的制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 其特征在于， 步骤 。

10、e 中， 灭活的病毒液中按 V/V 6 13% 加入吐温 -80 制备成水相， 在进口白油中按 V/V 7 11% 加入司本-80制备成油相， 将水相与油相按V/V 1 ： 2比例混合后乳化， 制备成猪细小病毒病 灭活疫苗。 权 利 要 求 书 CN 103157106 A 3 1/9 页 4 一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 属生物技术领域。 背景技术 0002 猪细小病毒病(Porcineparvo viurs， PPV)是因感染猪细小病毒所致， 可引起猪的 繁殖障碍， 主要表现为怀孕母猪发生流产。

11、、 死产、 胎儿和胚胎的感染和死亡， 而母体通常并 不表现临床症状。 在世界各地的猪群中， 该病毒普遍存在， 在大多数猪场一般呈地方性流行 或散发， 而且很难根除给养猪业造成巨大的经济损失。PPV 的感染尚无有效的治疗方法， 因 此， 该病的预防免疫就显得更为重要。 0003 公认使用疫苗是预防猪细小病毒病、 提高母猪繁殖率的有效方法。目前 PPV 疫苗 主要包括灭活疫苗、 弱毒疫苗、 基因工程亚单位疫苗、 基因工程活病毒载体疫苗等， 其中灭 活疫苗具有安全性好、 成本低、 产生抗体时间长、 不需要低温保存的优点， 被广泛应用。 0004 目前中国生物制品行业生产猪细小病毒大多是采用贴壁依赖性。

12、细胞， 如猪睾丸传 代细胞 ST、 猪肾细胞 PK-15、 猪肾细胞 IBRS-2， 多采用传统转瓶培养或静置培养， 该工艺虽 已沿袭数年， 但难以摆脱效价不稳定， 批间差异大， 病毒滴度低等弊病， 极大地限制了猪细 小病毒病灭活疫苗的质量与产量。 近几年， 随着兽用疫苗行业的发展， 生物反应器被广泛关 注， 利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势。 0005 生物反应器作为一种新型工具， 能有效提高细胞产量， 稳定疫苗批间差异， 也被应 用于规模化生产猪细小病毒疫苗。专利 应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗 （专 利号 ZL 201010282134.9） 中公布了一种。

13、应用搅拌式生物反应器生产猪细小病毒的方法。 专利 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法 （专利号 ZL 201010277502.0） 中公布了一种 应用美国 NBS 公司生产的生物反应器生产培养细胞进而生产猪细小病毒病灭活疫苗的方 法， 其培养体积达到了 40L。但是， 应用激流灌注式生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗 的方法未见报道。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种利用激流灌注式生 物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法。 0007 本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。 0008 一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 它利用激流灌注式生物反应器为。

14、培养系 统， 所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、 第二蠕动泵， 第一硅胶管、 第二硅胶管、 激 流罐、 灌注袋、 有孔硅胶管和聚酯纤维纸片载体 ； 所述灌注袋为内含聚酯纤维纸片载体的细 胞培养袋， 两个灌注袋结构与功能完全相同， 以相同的方式与激流罐连接， 通过外源泵实现 物质交换 ； 灭活疫苗的制备按以下步骤进行 ： 说 明 书 CN 103157106 A 4 2/9 页 5 a. 制苗用细胞的培养 将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液的混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注 袋 （6） ， 使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体 （8） 上， 接种密度为每克载体接种 0.8 1.2107 个细胞。

15、， 设定设备参数 ： 温度 T1 ： 37.5 38、 T2 ： 43 46、 T3 ： 35.5 37， pH ： 7.2 7.8， DO ： 30% 70%、 振荡速度 40 55r/min， 空气流量 100ml/min 1000ml/min， 启动细胞 培养程序， 进行细胞培养， 得到制苗用细胞 ； b. 病毒接种与培养 当细胞单日耗糖趋于平稳时， 表明细胞达到接毒要求， 排空反应器内液体， 将猪细小病 毒种毒接种制苗用细胞， 设定设备参数 ： 温度T1 ： 3538、 T2 ： 3740、 T3 ： 3436， pH ： 7.37.8， DO ： 30%70%， 振荡速度3550r/。

16、min， 空气流量400 ml/min4000ml/min， 启动病毒培养程序， 扩增培养猪细小病毒 ； c. 病毒液收获 病毒培养 40 42h 后， 收获激流罐 （5） 与灌注袋 （6） 内的病毒液， 将灌注袋 （6） 反复冻 融 2 3 次后收获上清液， 混合后 -20保存备用 ； 检测病毒液效价和血凝价 ； d. 病毒液灭活 收获的病毒液中加入灭活剂， 灭活病毒 ； e. 疫苗制备 灭活的病毒液加入佐剂， 乳化制备成猪细小病毒病灭活疫苗。 0009 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤 a 中， 种子细胞为猪肾细胞 IBRS-2 或猪睾丸传代细胞 ST， 均为经过有限稀释法克隆纯。

17、化筛选的细胞， 应用有限稀释法将待筛 选细胞进行单克隆化， 扩大培养建立单克隆化细胞库， 通过血凝和 TCID50筛选猪细小病毒 疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。 0010 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤 a 中， 细胞培养过程中采用阶段流 加方式补充细胞生长液， 当残糖量低于 2g/L 时， 流加补充细胞生长液， 流加量以培养液残 糖量不低于 1g/L 为准， 当培养液体积达到有效培养体积时， 进行换液。 0011 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤a中， 逐日增大空气流量， 每24时增 加 100ml/min 1000ml/min。 0012 上述制备猪细小病毒病灭活疫。

18、苗的方法， 步骤 b 中， 猪细小病毒种毒是经过蚀斑 法纯化筛选的优良种毒。 0013 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤 b 中， 病毒接种前将种毒混于细胞 维持液中， 种毒与细胞维持液按 V/V 为 1% 3% 混合， 病毒接种时将混有病毒液的细胞维持 液泵入反应器系统中， 无需吸附， 直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。 0014 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤b中， 病毒培养12h时开始持续流加 补充含 n 倍浓缩 DMEM 液和 200g/L 葡萄糖， 流加速度以培养液残糖量不低于 1g/L 为准 ； 所 述 n 等于 25。 0015 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗。

19、的方法， 所述 n 倍浓缩 DMEM 液配制方法为 ： 1 份 DMEM 干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成 1DMEM 液后， 再加入 （n-1） 份 无 Na-DMEM 干粉培养基， 溶解即成 ； 所述 n 等于 25。 0016 上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法， 步骤 e 中， 灭活的病毒液中按 V/V 6 说 明 书 CN 103157106 A 5 3/9 页 6 13% 加入吐温 -80 制备成水相， 在进口白油中按 V/V 7 11% 加入司本 -80 制备成油相， 将 水相与油相按 V/V 1 ： 2 比例混合后乳化， 制备成猪细小病毒病灭活疫苗。 0017 与。

20、现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 1. 在本发明中， 制苗用细胞经过纯化筛选， 提高了细胞对病毒的敏感性， 保证了种子细 胞的状态均一， 减小批次间差异， 确保生产工艺参数和产品质量的稳定。 0018 2. 在本发明中， 与常规激流灌注式生物反应器培养系统相比， 增加了一个灌注袋， 有效增大了细胞贴壁面积， 细胞数量增加近一倍， 大幅提高病毒液产量。 0019 3. 本发明细胞培养过程中逐日增大空气流量， 加快系统内气体循环， 有利于培养 液内 CO2的溢出， 减少 NaHCO3的使用量。 0020 4. 本发明接种的猪细小病毒经蚀斑法纯化筛选， 该毒株增殖能力强， 免疫原性好， 既。

21、增加了半成品毒液的滴度， 又提升了成品疫苗的免疫效果。 0021 5.本发明中， 猪细小病毒接种时采用同步接种法， 无需吸附， 简化操作， 节省人力。 0022 6. 本发明使用的浓缩营养液， 可以倍增多种氨基酸含量， 为病毒繁殖提供了充足 的营养， 有利于提高病毒产量。 0023 7. 本发明所采用乳化工艺参数为经过筛选摸索的优化方案， 能保证成品疫苗的最 佳乳化粒径， 有利于抗原的提早释放及长期稳定释放， 提升疫苗的免疫效果。 附图说明 0024 图 1 为 激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成示意图 ； 图 2 为本发明的工艺路线图 ； 图 3 两种乳化工艺稳定性对比 （其中， A 为。

22、本发明乳化工艺， 8000r/min 离心 20 分钟， 无 水相析出 ； B 为常规乳化工艺， 8000r/min 离心 20 分钟， 管底析出的水相约 0.2ml） ； 图 4 为两种乳化工艺制备的疫苗 HI 抗体水平曲线图。 0025 附图或文字中各标号 （或符号） 清单为 ： 1. 第一蠕动泵 （灌注出液泵） ， 2. 第二蠕动 泵 （灌注进液泵） ， 3.第一硅胶管， 4.第二硅胶管， 5.激流罐， 6.灌注袋， 7.有孔硅胶管， 8.聚 酯纤维纸片载体 ； T1 为激流罐内液体温度， T2 为激流罐加热膜的温度， T3 为灌注袋外环境温度， pH 为激 流罐内液体 pH 值， DO。

23、 为激流罐内液体溶氧率， 振荡速度为激流罐的振荡速度， 空气流量为 激流罐内空气流通量。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明， 其中各实施例仅用于说明本 发明而并非限定本发明的专利保护范围。 0027 实施例 1 有限稀释法克隆纯化筛选制苗用细胞 （猪肾细胞 IBRS-2） 猪肾细胞 IBRS-2 购自中国兽医药品监察所。 0028 猪细小病毒疫苗株为猪细小病毒 RP2 株， 其经蚀斑法纯化筛选， 于 2012 年 11 月 14 日保藏在中国典型培养物保藏中心， 培养物名称 ： 猪细小病毒 RP2 株 （Porcine parvovirus， PPV） ， 。

24、保藏号为CCTCC NO ： V201250保藏地址为 中国武汉大学。 所述病毒为本 领域常见病毒， 故对其特征描述略去。 说 明 书 CN 103157106 A 6 4/9 页 7 0029 细胞生长液的配方为体积百分含量为 90% 高糖 DMEM 液， 10% 新生牛血清， 调整 PH 值为 7.4 ； 细胞维持液为体积百分含量为 96% 高糖 DMEM 液， 4% 新生牛血清， 调整 PH 值为 7.4 ； A. 单克隆细胞株制备 a. 细胞悬液的制备 细胞瓶中培养猪肾细胞 IBRS-2， 待细胞长满为致密的单层、 轮廓清晰时， 用 0.025% 胰 酶进行消化， 制成细胞悬液。 00。

25、30 b. 细胞的有限稀释 对所制备的IBRS-2细胞悬液进行细胞计数， 加入无血清的DMEM培养液稀释细胞悬液， 使得细胞密度约为 1.0105个 /ml ； 用无血清 DMEM 培养液将稀释后的 IBRS-2 细胞悬液 10 倍梯度稀释至 103个 /ml， 再用细胞生长液 10 倍梯度稀释到 101个 /ml， 即每 0.1ml 1 个细 胞。 0031 c. 细胞的克隆培养 将上述稀释好的细胞悬液加入 96 孔细胞培养板中， 0.1ml/ 孔， 显微镜下观察， 弃去非 单一细胞并且细胞状态不佳的细胞孔， 置于 37， 5% CO2培养， 每天观察细胞生长状态并及 时换液， 待细胞增殖为。

26、克隆群落， 选取生长状态良好的细胞孔， 用 0.025% 胰酶进行消化， 制 成悬液， 重复上述克隆方法 12 次， 直至筛选出单克隆生长孔。 0032 d. 单克隆化细胞株的扩大培养 选取单克隆生长孔， 用 0.025% 胰酶消化， 以小牛血清中和， 以细胞生长液重悬， 转移至 24孔细胞培养板进行扩大培养， 当细胞增殖到汇合度约为80%时， 用0.025%胰酶消化， 加入 细胞生长液， 接种于细胞培养瓶中扩大培养， 培养 610 瓶， 进行单克隆细胞的冻存及细胞 库的建立。 0033 B. 猪细小病毒高适应性细胞株的筛选 a. IBRS-2 单克隆细胞株的消化铺板 将长满单层的 IBRS-。

27、2 单克隆细胞株用 0.025% 胰酶消化并计数， 每株单克隆细胞铺 24 孔细胞培养板， 设复孔， 30000 个细胞 / 孔。置于 37， 5% CO2下培养 24h。 0034 b. IBRS-2 单克隆细胞株接种猪细小病毒 弃去 24 孔细胞培养板中的细胞生长液， 加入 0.1M PBS， 0.8ml/ 孔， 吹洗 23 遍后， 按 V:V 0.1% 接种量接种猪细小病毒疫苗株， 1.0ml/ 孔， 置于 37， 5% CO2培养， 72h 后 -20 反复 3 次冻融， 并收获病毒液。 0035 c. IBRS-2 单克隆细胞株培养猪细小病毒疫苗株的血凝滴度测定 在 96 孔血凝板中。

28、， 从第 1 孔至 12 孔加入生理盐水 25l/ 孔， 取收获病毒液 25l， 从 第 1 孔起， 依次做 2 倍梯度倍比稀释， 至最后一个倍数孔， 最后一个倍数孔中弃去 25l 液 体 ； 每孔加入 1% 豚鼠红血球 25l， 并设不加病毒液的红细胞对照孔， 振荡后， 置室温下 30 40min， 观察结果。方法参照 中华人民共和国兽用生物制品规程 二年版。 0036 d. 猪细小病毒疫苗株感染 IBRS-2 单克隆细胞株的 TCID50检测 按常规方法将收获的病毒液用无血清DMEM 10倍梯度倍比稀释， 稀释度为10-110-10， 稀释好的病毒液依次对应的加入到 96 孔细胞培养板中，。

29、 每一稀释度接种一纵排， 共 8 个复 说 明 书 CN 103157106 A 7 5/9 页 8 孔， 每孔 100l 病毒液， 其中 96 孔细胞板的最后两纵排作为对照， 不加病毒液， 只加无血 清 DMEM， 每孔 100l。然后向每孔加入细胞数为 2105个 /ml 的细胞悬液 100l。置于 37， 5% CO2培养 5d， 5d 后观察细胞病变， 结果计算按照 Reed-Muench 法。 0037 C. 结果 a. IBRS-2 单克隆细胞株的培养及猪细小病毒疫苗株高适应性 IBRS-2 单克隆细胞株 的筛选。 0038 通过有限稀释法扩大培养获得 IBRS-2 单克隆细胞株 。

30、58 株。液氮冷冻保存， 每株 单克隆细胞冻存 5 支， 每支 1.5ml， 密度约为 5106个 /ml。 0039 通过猪细小病毒疫苗株感染IBRS-2单克隆细胞株72h后的血凝滴度检测， 筛选出 2 株 IBRS-2 单克隆细胞 ： 第 16 株和第 34 株， 在 58 株中血凝滴度最高， 分别为 1 2048 和 1 4096。由此， 筛选获得第 16 株和第 34 株为猪细小病毒疫苗株高适应性 IBRS-2 单克隆 细胞株， 并分别标号为 I16 和 I34。 0040 b. 猪细小病毒疫苗株感染 IBRS-2 单克隆细胞株的 TCID50滴度 通过TCID50方法检测猪细小病毒疫。

31、苗株感染I16和I34单克隆细胞株的TCID50结果分 别为107.5 TCID50/ml和107.7 TCID50/ml。 与猪细小病毒疫苗株感染普通IBRS-2细胞的TCID50 （106.5107.0TCID50/ml） 相比， 提高约 10 倍。由此可见， 筛选获得的 IBRS-2 单克隆细胞株感 染猪细小病毒疫苗株的 TCID50 滴度有明显提高。 0041 I34号猪肾细胞IBRS-2于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心， 保 藏号为 CCTCC NO ： C2012178， 保藏地址为 中国武汉大学 ； 所述细胞较常见， 其特征描述省 略。 0042 应用同样的方。

32、法纯化筛选出一株猪睾丸传代细胞ST， 于2012年11月14日保藏在 中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCC NO ： C2012180， 保藏地址为 中国武汉大学 ； 所 述细胞较常见， 其特征描述省略。 0043 实施例 2 AP20C 型激流灌注式生物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗 本实施例中所用的 AP20C 型激流灌注式生物反应器， 灌注袋 6 体积为 8L（两个灌注袋 的体积均为 4L） ， 激流罐 5 体积为 13L， 灌注袋 6 内含有 300g 聚酯纤维纸片载体 8（两灌注 袋各含 150g 载体） ； 理论有效培养体积为 21L。 0044 细胞同实施例 1 中菌种。

33、保藏的猪肾细胞 IBRS-2 ； 种毒同实施例 1 中猪细小病毒 RP2 株 ； 细胞生长液的配方为体积百分含量 92% 高糖 DMEM 液， 8% 新生牛血清， 调整 PH 值为 7.4 ； 细胞维持液为体积百分含量 98% 高糖 DMEM 液， 2% 新生牛血清， 调整 PH 值为 7.5 ； 无 Na-DMEM 干粉培养基为不含有 NaCl 和酚红的高糖 DMEM 培养基， 由 Invitrogen Corporation 生产销售。 0045 A、 准备工作 ： 检验系统气密性， 校准电极， PBS 处理纸片载体 8， 连接灌注袋 6 与激流罐 5， 用细胞生 长液浸泡纸片载体 8， 。

34、平衡系统。 0046 B、 制备工作， 具体步骤如下 ： a. 制苗用细胞的复苏与前期培养 说 明 书 CN 103157106 A 8 6/9 页 9 从液氮罐中取出冻存的 IBRS-2 细胞复苏后， 用细胞生长液于 37培养， 长成良好单层 后消化转至 10L 转瓶中培养、 备用。 0047 b. 制苗用细胞在生物反应器中的接种、 培养 取 8 个长满单层细胞的转瓶， 用 0.025% 胰酶消化细胞， 制备细胞悬液 10L （含细胞和细 胞生长液） ， 细胞总数约 3.3109个。 0048 细胞接种采用两步接种法， 第一步 ： 两灌注袋中各从下部打入细胞悬液 4.0L， 静 置吸附 1h。

35、 ； 第二步 ： 将两灌注袋中的液体各打出 1L， 再从两灌注袋上部深层管各打入 1L 剩 余细胞悬液， 静置吸附0.5h ； 同时在激流罐5内补充5L细胞生长液预热 ； 细胞接种密度为 ： 每克载体接种 1.1107个细胞。 0049 吸附过程完成后， 设置设备参数如下 ： T1:37.5， T2:44， T3:36.5， PH:7.3， DO:4070%， 振荡速度45r/min， 循环速度400ml/min， 空气流量100ml/min。 启动细胞培养 程序， 进行细胞培养。逐日增大空气流量， 每 24 时增加 100ml/min。细胞生长液循环灌注速 度随培养时间的增加逐渐增大， 使硅。

36、胶管 3、 硅胶管 4 内液体颜色保持基本一致。 0050 每日取样 2 次测残糖量， 计算单日耗糖量， 细胞培养 48h 培养液残糖量低于 2g/L， 开始流加补充细胞生长液， 流加速度为 11ml/min ； 细胞培养 60h 时， 泵出培养液 13L， 补入细胞生长液 4L 后流加补充细胞生长液， 流加速 度为 11ml/min。 0051 细胞培养72h时， 培养液体积接近有效体积21L， 将培养液全部打出， 换入20L新鲜 细胞生长液继续培养。 0052 c. 猪细小病毒接种制苗用细胞， 继续培养 细胞接种后第 4 日 （96h） 单日耗糖量达到 3.42g/L/24h， 且趋于平稳。

37、， 确定细胞密度达 到了接毒要求。 排空反应器内液体， 将含细胞维持液14L和病毒液420ml （血凝价为1:4096， 效价为 107.7TCID50/ml） 的种毒悬液打入系统中， 设置设备参数如下 ： T1 ： 37， T2 ： 39， T3 ： 36， pH ： 7.5， DO ： 40 70%， 振荡速度 45r/min， 循环速度 500ml/min， 空气流量 400 ml/ min， 启动病毒培养程序开始培养。 0053 病毒接种 12h 后开始流加补充 200g/L 葡萄糖和 3 倍浓缩 DMEM 液 （1 份 DMEM 干粉 培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成 1D。

38、MEM 液后， 再加入 2 份无 Na-DMEM 干 粉培养基， 溶解而成） ， 3 倍浓缩 DMEM 液流加速度为 3.14ml/min， 200g/L 葡萄糖流加速度为 0.1ml/min。 0054 d. 收获病毒液， 灭活病毒 病毒培养 41h 后， 收获激流罐 5 和灌注袋 6 内的病毒液， 灌注袋 6 冻融 3 次后收获上清 液， 将收获的全部病毒液混匀， 共得 20.9L 病毒液， 备用。 0055 收获的病毒液测定效价和血凝价， 每 1ml 含病毒 108.3TCID50， 对豚鼠红细胞凝集价 为 1 ： 4096。 0056 收获的 20.9L 病毒液内加入 21mL 二乙烯。

39、亚胺灭活剂， 37灭活 24h 终止。灭活完 成后取样进行灭活检验， 置于 4保存备用。 0057 e. 疫苗制备 灭活的病毒液中加入1.8L吐温-80制备成水相， 43L进口白油中按加入4L司本-80熬 制成油相， 将水相与油相按 V/V 1 ： 2 比例混合后乳化， 制备成猪小病毒病灭活疫苗。 说 明 书 CN 103157106 A 9 7/9 页 10 0058 f. 安全检验 仔猪安检 ： 用 4 6 周龄健康易感仔猪 （血清 HI 抗体效价应不高于 1 ： 8） 2 头， 各颈部 肌肉注射疫苗 4ml， 连续观察 21 日， 免疫后仔猪精神、 食欲无明显变化， 无异常临床反应， 仔。

40、 猪安检合格。 0059 乳鼠安检 ： 用 3 5 日龄乳鼠 5 只， 各皮下注射疫苗 0.1ml， 观察 10 日， 免疫后乳 鼠精神状态良好， 无异常反应， 乳鼠安检合格。以上试验证明疫苗安全性检验合格。 0060 g. 疫苗效力检验 选用 4 月龄 PPV 抗体阴性初产母猪 （血清 HI 抗体效价应不高于 1 8） 8 头， 同时设对 照 4 头， 每头颈部肌肉注射疫苗 2ml， 28 日后， 采血， 分离血清， 测定 HI 抗体。对照猪抗体均 为阴性， 免疫猪 HI 效价分别为 1 ： 4096、 1 4096、 1:4096、 1:2048。 0061 与转瓶工艺比较 ： 转瓶培养工。

41、艺每瓶收获体积1L， 病毒效价一般为107.0 TCID50/ml 左右 ； 本次实验病毒总产量与 400 个 10L 转瓶产量持平。 0062 实施例 3 AP200 型激流灌注式生物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗 本实施例中所用的激流灌注式生物反应器包括 AP20C 型和 AP200 型两种。 0063 AP20C 型激流灌注式生物反应器同实施例 2。 0064 AP200型灌注袋6体积为80L （两个灌注袋的体积均为40L） ， 激流罐5体积为130L， 灌注袋 6 内含有 3000g 聚酯纤维纸片载体 8（两灌注袋各含 1500g 载体） ； 理论有效培养体 积为 210L。 0065。

42、 制苗用细胞、 种毒均同实施例 2。 0066 A、 准备工作 ： 选用 AP20C 型和 AP200 型两种激流灌注式生物反应器， 做培养细胞前准备工作。 0067 B、 制备工作， 具体步骤如下 ： a. 制苗用细胞的培养 按照实施例 2 方法， 在 AP20C 型生物反应器内培养制苗用细胞 96h， 至细胞耗糖量增至 3.3g/L/24h 且趋于平稳时， 用 0.025% 胰酶消化一个灌注袋 6 内细胞， 制得细胞悬液 100L， 内含猪肾细胞 IBRS-2 约 2.91010个。将制得的细胞悬液分两步接种于 AP200 型生物反 应器灌注袋 6 内 ： 第一步 ： 两灌注袋中各从下部打。

43、入细胞悬液 40L， 静置吸附 1h ； 第二步 ： 将两灌注袋中的液体各打出 10L， 再从两灌注袋上部深层管各打入 10L 剩余细胞悬液， 静置 吸附 0.5h ； 同时在激流罐 5 内补充 50L 细胞生长液预热 ； 细胞接种密度为 ： 每克载体接种 0.97107个细胞。 0068 吸附过程完成后， 设置设备参数如下 ： T1:37.5， T2:43， T3:36.5， PH:7.3， DO:5070%， 振荡速度43r/min， 循环速度4000ml/min， 空气流量1000ml/min。 启动细胞培 养程序， 进行细胞培养。逐日增大空气流量， 每 24 时增加 1000ml/mi。

44、n。细胞生长液循环灌 注速度随培养时间的增加逐渐增大， 使硅胶管 3、 硅胶管 4 内液体颜色保持基本一致。 0069 每日取样 2 次测残糖量， 计算单日耗糖量， 细胞培养 48h 培养液残糖量低于 2g/L， 开始流加补充细胞生长液， 流加速度为 105ml/min ； 细胞培养 60h 时， 泵出培养液 130L， 补入细胞生长液 30L 后流加补充细胞生长液， 流加 速度改为 115ml/min。 0070 细胞培养72h时， 培养液体积接近有效体积210L， 将培养液全部打出， 换入200L新 说 明 书 CN 103157106 A 10 8/9 页 11 鲜细胞生长液继续培养。 。

45、0071 b. 猪细小病毒接种制苗用细胞， 继续培养 细胞接种后第 4 日 （96h） 单日耗糖量达到 3.4g/L/24h， 且趋于平稳， 确定细胞密度达到 了接毒要求。排空反应器内液体， 将含细胞维持液 140L 和病毒液 4.2L（血凝价为 1:4096， 效价为 107.7TCID50/ml） 的种毒悬液打入系统中， 设置设备参数如下 ： T1 ： 37， T2 ： 39， T3 ： 36， pH ： 7.5， DO ： 50 70%， 振荡速度 45r/min， 循环速度 5000ml/min， 空气流量 4000 ml/ min， 启动病毒培养程序开始培养。 0072 病毒接种 1。

46、2h 后开始流加补充 200g/L 葡萄糖和 3 倍浓缩 DMEM 液， 流加速度为 32ml/min， 葡萄糖流加速度为 1ml/min。 0073 c. 收获病毒液， 灭活病毒 病毒培养 40h 后， 收获激流罐 5 和灌注袋 6 内的病毒液， 灌注袋 6 冻融 3 次后收获上清 液， 将收获的全部病毒液混匀， 共得 208L 病毒液， 备用。 0074 收获的病毒液测定效价和血凝价， 每 1ml 含病毒 108.2TCID50， 对豚鼠红细胞凝集价 为 1 ： 2048。 0075 收获的病毒液内加入灭活剂二乙烯亚胺208mL， 37灭活24h终止。 灭活完成后取 样进行灭活检验， 置于。

47、 4保存备用。 0076 d. 疫苗制备 灭活的 208L 病毒液中加入 17L 吐温 -80 制备成水相， 425L 进口白油中按加入 39L 司 本 -80 熬制成油相， 将水相与油相按 V/V 1 ： 2 比例混合后乳化， 制备成猪小病毒病灭活疫 苗。 0077 e. 安全检验 仔猪安检 ： 用 4 6 周龄健康易感仔猪 （血清 HI 抗体效价应不高于 1 8） 2 头， 各颈 部肌肉注射疫苗 4ml， 连续观察 21 日， 免疫后仔猪精神、 食欲无明显变化， 无异常临床反应， 仔猪安检合格。 0078 乳鼠安检 ： 用 3 5 日龄乳鼠 5 只， 各皮下注射疫苗 0.1ml， 观察 1。

48、0 日， 免疫后乳 鼠精神状态良好， 无异常反应， 乳鼠安检合格。以上试验证明疫苗安全性检验合格。 0079 f. 疫苗效力检验 选用 4 月龄 PPV 抗体阴性初产母猪 （血清 HI 抗体效价应不高于 1 8） 8 头， 同时设对 照 4 头， 每头颈部肌肉注射疫苗 2ml， 28 日后， 采血， 分离血清， 测定 HI 抗体。对照猪抗体均 为阴性， 免疫猪 HI 效价分别为 1 ： 4096、 1 4096、 1:2048、 1:2048。 0080 与转瓶工艺比较 ： 转瓶培养工艺每瓶收获体积1L， 病毒效价一般为107.0 TCID50/ml 左右 ； 本次实验病毒总产量与 3000 个 10L 转瓶产量持平。 0081 实施例 4 本发明乳化工艺与常规乳化工艺比较 某一批猪细小病毒液半成品， 其效价为 108.0TCID50/ml， 对豚鼠红细胞凝集价为 1 ： 4096。 0082 A. 本发明乳化工艺 a 水相制备 将 3.6L 吐温加入到 36.4L 猪细小病毒灭活毒液中， 搅拌均匀， 即为水 相 ； b 油相制备 将 7L 司班 -80 加入到 74L 进口白油中， 升高温度至 126， 加热 15min 说 明 书 CN 103157106 A 11 9/9 页。