一种用于SUP99M/SUPTC标记的CYSANNEXINV药盒及其配制方法与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103159842 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103159842 A *CN103159842A* (21)申请号 201310087314.5 (22)申请日 2013.03.18 C07K 14/47(2006.01) C07K 1/13(2006.01) A61K 51/08(2006.01) A61K 103/10(2006.01) (71)申请人 江苏省原子医学研究所 地址 214063 江苏省无锡市钱荣路 20 号 申请人 江苏靶标生物医药研究所有限公司 (72)发明人 陆春雄 蒋泉福 俞惠新 华子春 胡敏进 季宇 (74)专利代。

2、理机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 11250 代理人 张杰 (54) 发明名称 一种用于 99mTc标记的Cys-Annexin V药盒及 其配制方法与应用 (57) 摘要 本发明属于单光子发射计算机断层 （SPECT） 显像技术领域， 具体涉及一种用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V药盒， 及配制方法以及其在检测细 胞凋亡方面的应用。 本发明所述的药盒， 每支药盒 的配方为 ： Cys-Annexin V25-150g、 乙二胺四乙 酸盐 0.5-6mg、 亚锡盐 5-40g、 及 0.1mmol pH 缓 冲剂。 本发明所述的药盒， 对Cys-Annexin V进。

3、行 99mTc 标记时， 操作简单， 标记率稳定并大于 95%， 且标记产物与反应中可能出现的杂质能够明显区 分， 相对于现有技术中的标记方法具有明显的优 势。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103159842 A CN 103159842 A *CN103159842A* 1/1 页 2 1. 一种用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 其特征在于， 每支所述药盒配方包括 ： Cys-Annexin V 。

4、25-150g ； 乙二胺四乙酸盐 0.5-6mg ； 亚锡盐 5-40g ； pH 缓冲剂调 pH6.0-8.0。 2. 根据权利要求 1 所述的用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 其特征在于 ： 所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸钠或乙二胺四乙酸钾。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 其特征在于 ： 所述亚锡盐为氯化亚锡、 氟化亚锡、 酒石酸亚锡、 溴化亚锡或柠檬酸亚锡中的一种或几 种的混合物。 4. 根据权利要求 3 所述的用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 其特征在于 ：。

5、 所述 pH 缓冲剂为磷酸盐、 柠檬酸盐、 铵盐、 醋酸盐、 碳酸盐、 硼酸盐、 巴比妥盐、 邻苯二 甲酸盐的一种或几种的混合物。 5.一种配制权利要求1-4任一所述的用于 99mTc标记的Cys-Annexin V药盒的方法， 其 特征在于 ： 称取 pH 缓冲剂 10mmol， 溶于 90mL 蒸馏水中， 加入 50-600mg 的乙二胺四乙酸盐， 再加入 2mg/mL 的亚锡盐溶液 0.25-2mL， 最后加入 5mg/mL 的 Cys-Annexin V 溶液 0.5-3mL， 混合均匀并补加蒸馏水至总体积为 100mL， 按 1.0mL/ 瓶分装于 10mL 规格的西林瓶中， 并将 。

6、所述西林瓶冷冻干燥至其内部物质呈白色粉末状， 即得所述 Cys-Annexin V 药盒。 6.根据权利要求5所述的配制用于 99mTc标记的Cys-Annexin V药盒的方法， 其特征在 于， 所述冷冻干燥步骤是通过梯度控制冷冻干燥温度对所述西林瓶进行冷冻干燥实现的。 7. 根据权利要求 5 或 6 所述的配制用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒的方法， 其特 征在于， 所述冷冻干燥步骤是具体条件为 ： 控制所述冷冻温度为 -40， 冷冻 4h ； 并抽真空 使真空压力达到 1-2Pa， 再冷冻 2h ； 将温度调节至 -20， 冷冻 3h ； 再将温度调节至 -10。

7、， 冷冻 13h ； 随后将温度调节至 10， 干燥 2h ； 再将温度调节至 25， 干燥 4h， 压盖后即得所 述 Cys-Annexin V 药盒。 8. 根据权利要求 5 或 6 或 7 所述的配制用于 99mTc 标记的 Cys-AnnexinV 药盒的方法， 其特征在于 ： 以浓度为 1% 的稀盐酸溶解所述亚锡盐。 9. 一种 99mTc 标记 Cys-Annexin V 的方法， 其特征在于 ： 向权利要求 1-4 任一所 述的药盒中加入新淋洗的 Na99mTcO4溶液， 置 35-37水浴反应 15min， 即得标记产物 99mTc-Cys-Annexin V。 10. 一种标。

8、记蛋白， 其特征在于， 为权利要求 9 所述的标记方法得到的标记产物。 11.一种权利要求1-4任一所述的用于 99mTc标记的Cys-Annexin V药盒在检测细胞凋 亡中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103159842 A 2 1/7 页 3 一种用于 99mTc标记的Cys-Annexin V药盒及其配制方法与 应用 技术领域 0001 本发明属于单光子发射计算机断层 （SPECT） 显像技术领域， 具体涉及一种用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 及配制方法以及其在检测细胞凋亡方面的应用。 背景技术 0002 细胞凋亡 （Apoptosis） 又称程序性。

9、细胞死亡 （Programmed Cell Death， PCD） ， 是细 胞生命周期中的重要组成部分， 是不同于坏死和意外死亡的由基因调控的细胞主动性死亡 过程。 细胞凋亡涉及一系列生物分子及细胞形态学的改变， 其中， 细胞膜脂质双层中的磷脂 酰丝氨酸 （PS） 由膜内层翻转至外层， 暴露于细胞表面， 是细胞凋亡早期事件， 发生在凋亡细 胞形态学改变之前， 也是凋亡级联反应的初始事件， 作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志， 从而进一步引起胞浆的皱缩、 染色质的浓集及核内 DNA 降解等。因此， 外翻的 PS 是目前研 究最多并最有希望和应用前景的凋亡检测靶点， 可早期检测凋亡， 具有较高的时。

10、效性， 国内 外常利用同 PS 特异性结合的药物来检测细胞凋亡。 0003 膜联蛋白 V（Annexin V， 又称 Annexin A5 和 AnxA5） 是一种人体内源性蛋白， 属 于 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族， 最早是从胎盘中分离出来， 具有一些抗凝固及抗炎的作 用， 曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示， Annexin V 是由位于人的第四条染色 体 4q26-q28 上的 Annexin V 基因编码， 含有 319 各氨基酸， 包括 70-80 个氨基酸重复单元， 分子量约为 35kD。研究证实 Annexin V 能与 PS 特异性结合， 亲和力高达 10-9mol。

11、/L。因此， 以放射性核素标记 Annexin V 作为显像剂进行体内凋亡显像， 实现细胞凋亡的活体无创显 像， 以实时监测体内凋亡的发生， 成为监测活体细胞凋亡领域的研究重点， 并已取得了较大 进展。 0004 Annexin V 类显像剂的合成关键是放射性核素的标记， 既要获得较高的放射化学 纯度， 同时又不能损伤Annexin V的结合活性。 目前， 以 99mTc标记Annexin V研究最多，99mTc 的优点在于半衰期为 6h， 可以及时显像， 又使病人受的剂量较小， 而且可以由 Mo/Tc 发生器 方便的获得。 然而， 99mTc直接标记Annexin V比较困难， 标记率低， 。

12、且在标记过程中会产生一 些变性蛋白， 造成肝脏的放射性摄取增加。 因此， Annexin V的 99mTc标记以间接标记为主， 常 用的双功能鳌合剂有 N-1- 亚氨基 -4- 巯基丁基 （Imino） 、 乙二胺半胱氨酸 （EC） 、 二硫二氮 （N2S2、 又称 BTAP） 等， 以肼基烟酰胺 （HYNIC） 最为多见， 标记得到的 99mTc-HYNIC-Annexin V 比活度较高， 放射化学纯度大于 90%， 并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估。但是这 些间接标记方法过程比较复杂， 对技术条件要求严格， 产物需纯化， 尤其是不易制成药盒， 临床使用受到一定限制。 0005 最新。

13、的研究表明， Annexin V 在基因重组表达中经结构修饰后可有利于用 99mTc 直 接进行标记。Annexin V 的三维结构显示， 其 N- 端和 C- 端都位于分子膜结合点的对面， 因 此在重组过程中对 Annexin V 的修饰并不影响重组蛋白在 Escherichia colli 的表达或 折叠， 也不改变其与膜 PS 结合的亲合性。如国外学者 Tait JF 等在 N- 端添加了 7 个氨基 说 明 书 CN 103159842 A 3 2/7 页 4 酸， 其中含 1-2 个半胱氨酸残基， 得到的三种突变体， 分别命名为 ： Annexin V-116， Annexin V-。

14、117和Annexin V-118， 国内学者华子春教授等在Annexin V的N端添加10个连续的组氨 酸， 命名为 His10-Annexin V， 这些重组的 Annexin V 变体与膜的结合活性跟天然 Annexin V 的相一致， 并且与 99mTc-HYNIC-Annexin V 有比较相似的生物分布。这些表明对 Annexin V 的蛋白质工程改造是可行的。 0006 中国专利 CN102690345A 又进一步公开了一种在大肠杆菌中克隆、 表达并纯化得 到的新的 Annexin V 变体， 该变体仅在天然 Annexin V 的 C- 末端添加了 1 个半胱氨酸 （Cys-A。

15、nnexin V） 。实验结果显示， 在 SP 柱纯化时， 相对于单独的 Annexin V， Cys-Annexin V 与 SP 柱结合得更为牢固， 需要用更高的离子强度才能被洗脱下来， 这从一个侧面说 明 Cys-Annexin V 比 Annexin V 具有更强的金属离子结合能力。而采用直接标记法对 Cys-Annexin V 进行 99mTc 标记的实验也证实99mTc-Cys-Annexin V 具有与 Cys-Annexin V 相近似的性能， 并且标记率高达 95% 左右。 0007 但申请人在研究中发现， 该专利文献中记载的以现有技术中 99mTc 标记的方法对 Cys-A。

16、nnexin V进行标记时， 得到的标记产物 99mTc-Cys-Annexin V与其他放射性杂质 （如原 料 Na99mTcO4和副产物 99mTc 胶体等） 很难区分开， 影响后续的研究及利用。 发明内容 0008 为此， 本发明所要解决的技术问题在于现有技术中 99mTc 标记 Cys-Annexin V 的 方法中标记产物与放射性杂质难以分离的问题， 进而提供一种步骤简单、 标记率高、 可用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 变体的药盒 ； 0009 进一步的， 本发明还提供了上述药盒的配制方法以及其在检测细胞凋亡方面的应 用。 0010 为解决上述技术问题， 本发明。

17、所述用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒， 其特征 在于， 每支所述配方包括 ： 0011 Cys-Annexin V 25-150g ； 0012 乙二胺四乙酸盐 0.5-6mg ； 0013 亚锡盐 5-40g ； 0014 pH 缓冲剂调 pH6.0-8.0。 0015 所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸钠或乙二胺四乙酸钾。 0016 所述亚锡盐为氯化亚锡、 氟化亚锡、 酒石酸亚锡、 溴化亚锡或柠檬酸亚锡中的一种 或几种的混合物。 0017 所述 pH 缓冲剂缓冲剂为磷酸盐、 柠檬酸盐、 铵盐、 醋酸盐、 碳酸盐、 硼酸盐、 巴比妥 盐、 邻苯二甲酸盐的一种或几种的混。

18、合物。 0018 本发明还提供了一种配制上述的用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒的方法， 本 发明所述的配制方法可以按照各组分的含量直接溶解混合配制成 1ml 的反应体系， 直接注 入 10ml 西林瓶中再进行冷冻干燥至粉末态。但是鉴于反应体系越小溶液配制精确度越难 控制的问题， 本发明所述的配制方法选择以100ml反应体系为配制单位， 即配制100瓶所述 药盒的反应体系， 再进行分装的方式。 0019 100 瓶 Cys-Annexin V 药盒的制备方法如下， 称取 pH 缓冲剂 10mmol， 溶于 90mL 说 明 书 CN 103159842 A 4 3/7 。

19、页 5 蒸馏水中， 加入 50-600mg 的乙二胺四乙酸盐， 再加入 2mg/mL 的亚锡盐溶液 0.25-2mL， 最后 加入 5mg/mL 的 Cys-Annexin V 溶液 0.5-3mL， 再补加蒸馏水至药液总体积为 100mL， 再按 1.0mL/ 瓶分装于 10mL 规格的西林瓶中， 冷冻干燥后即得 Cys-Annexin V 药盒。 0020 进一步的， 所述冷冻干燥步骤是通过梯度控制冷冻干燥温度对所述西林瓶进行冷 冻干燥实现的。 0021 优选的， 所述冷冻干燥步骤是具体条件为 ： 控制所述冷冻温度为 -40， 冷冻 4h ； 并抽真空使真空压力达到 1-2Pa， 再冷冻 。

20、2h ； 将温度调节至 -20， 冷冻 3h ； 再将温度调节 至 -10， 冷冻 13h ； 随后将温度调节至 10， 干燥 2h ； 再将温度调节至 25， 干燥 4h， 压盖 后即得所述 Cys-Annexin V 药盒。 0022 配制得到的每支药盒中含25-150g Cys-Annexin V， 5-40g的亚锡盐， 0.5-6mg 的乙二胺四乙酸盐。药盒加 1mL 蒸馏水后， 粉末溶解后， 整个体系的 pH 值范围为 6.0-8.0。 0023 本发明选择将所述亚锡盐溶解于浓度为 1% 的稀盐酸中， 再加入反应体系中反应。 0024 本发明还提供了一种 99mTc 标记 Cys-A。

21、nnexin V 药盒的方法， 即向上述的药盒中加 入新淋洗的 Na99mTcO4溶液， 置35-37水浴反应15min即得标记产物 99mTc-Cys-Annexin V。 0025 进一步的， 所述 Na99mTcO4溶液的加入体积为 1ml。 0026 所述 Na99mTcO4溶液可采用现有技术中本领域技术人员熟知的任意方法得到。 0027 采用本发明所述的药盒进行标记， 不仅标记率较高， 而且检测发现各个可能存在 的标记杂质及标记产物之间能得到较好的分离， 所述检测步骤以 HPLC 方法进行， 所述纯化 步骤采用 HPLC 法， 具体条件包括 ： 选用 TSKGEL 凝胶柱， 以浓度为。

22、 0.05M、 pH7.0 的磷酸缓冲 液为流动相， 流速为 0.8mL/min, 紫外检测波长为 278nm， 所述 99mTc-Cys-Annexin V 的保留 时间为 9.8min。 0028 本发明还提供了一种标记蛋白， 即由上述的药盒和标记方法得到的标记产物。 0029 以及一种上述用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 药盒在检测细胞凋亡中的应用。 0030 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点 ： 0031 1、 本发明所述的用于 99mTc 标记的 Cys-Annexin V 的药盒， 首次实现了通过配体交 换法进行对 Cys-Annexin V 进行冻。

23、干药盒直接 99mTc 标记， 不仅操作简单， 而且标记率较高 （达到 95% 以上） ， 并且通过 HPLC 法检测显示， 标记产物 99mTc-Cys-annexin V 与标记反应中 可能存在的其他放射性杂质 （如原料Na99mTcO4和副产物 99mTc胶体等） 明显区分开， 有利于今 后在临床的推广使用 ； 0032 2、 本发明所述的方法步骤简单易行， 且标记结果直观准确， 同时由于标记效率高 达 95% 以上， 无需特定纯化提取步骤即可直接使用， 因此易于制备药盒， 解决了现有技术中 其他直接标记方法存在的标记产物与杂质易混淆的问题 ； 0033 3、 采用本发明所述的药盒标记得。

24、到的标记蛋白与Cys-annexin V具有相近似的性 能， 标记后的 99mTc-Cys-annexin V 可作为显像剂应用于检测细胞的凋亡状况， 而大鼠肝脏 凋亡实验证明， 本发明所述的标记蛋白可直观反映出细胞的凋亡情况， 且显像结果与原位 末端标记法检测细胞凋亡的结果相一致， 结果准确， 本发明所述的药盒可应用于细胞凋亡 的检测。 附图说明 说 明 书 CN 103159842 A 5 4/7 页 6 0034 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解， 下面根据本发明的具体实施例并结合 附图， 对本发明作进一步详细的说明， 其中 0035 图 1 为本发明标记前体 Cys-Annexin。

25、 V 的 HPLC 色谱图 ； 0036 图 2 为实施例 2 中标记蛋白 99mTc-Cys-Annexin V 的 HPLC 色谱图 ； 0037 图 3 为实施例 3 中 99mTc-EDTA 的 HPLC 色谱图 ； 0038 图 4 为实施例 4 中 99mTc 胶体的 HPLC 色谱图 ； 0039 图 5 为实施例 4 中 Na99mTcO4的 HPLC 色谱图 ; 0040 图 6 为实施例 5 中 99mTc-Cys-Annexin V 在正常小鼠体内的分布图 ； 0041 图 7 为实施例 5 中 99mTc-Cys-Annexin V 在正常小鼠体内的血药清除曲线 ； 0。

26、042 图 8 为实施例 6 中大鼠肝脏凋亡模型的 99mTc-Cys-Annexin V 显像图 ； 0043 图 9 为实施例 7 中原位末端标记法检测大鼠凋亡肝脏细胞的凋亡情况 ； 0044 图 10 为实施例实施例 8 中 Cys-Annexin V 的含量对标记率的影响 ； 0045 图 11 为实施例 9 中亚锡盐含量对标记率的影响 ； 0046 图 12 为实施例 10 中乙二胺四乙酸盐 （EDTA） 的含量对标记率的影响 ； 0047 图 13 为实施例 11 中反应液的 HPLC 图。 具体实施方式 0048 实施例 1 0049 本实施例所述药盒的具体配制过程如下 ： 称取。

27、磷酸二氢钠 1.9mmol， 磷酸氢二钠 8.1mmol， 溶于 90mL 蒸馏水中， 加入 150mg 乙二胺四乙酸钠， 加入 2.00mg/mL 的氯化亚锡稀 盐酸 （1% 盐酸） 溶液 1mL， 最后加入 5mg/mL 的 Cys-Annexin V 溶液 1.5mL， 混匀后无菌过滤， 再按 1.00mL/ 瓶分装于 10mL 西林瓶中， 将所述西林瓶放入冻干机中， 设置所述冻干机温度 为 -40， 进行冷冻 4h， 随后开启真空泵抽真空 （真空泵开启后， 整个过程均在抽真空状态 下完成， 直至药盒冻干完成） ， 使真空压力达到 1-2Pa， 再冷冻 2h， 将温度调节至 -20， 冷。

28、 冻 3h， 随后将温度调节至 -10， 冷冻 13h， 再将温度调节至 10， 干燥 2h， 再将温度调节至 25， 干燥 4h， 压盖后即得所需的冻干药盒， 药盒内物质呈白色粉末状固体。 0050 每支药盒含 75.0g Cys-Annexin V、 20.0g 的氯化亚锡和 1.50mg 的乙二胺四 乙酸钠， 药盒中加入 1mL 蒸馏水后 pH 值为 6.0-8.0。 0051 所述 Cys-Annexin V 由江苏靶标生物医药研究所有限公司提供。应用基因工程技 术利用大肠杆菌克隆、 表达并纯化， 在 Annexin V 的 C 端添加 1 个半胱氨酸， 用金属亲和层 析纯化， 重组制。

29、备 Cys-Annexin V。具体制备步骤及特征见中国专利 CN102690345A。 0052 实施例 2 0053 以 99mTc 标记 Cys-Annexin V 药盒的方法 0054 取实施例1中制备得到的药盒， 向所述的药盒中加入1ml新淋洗的Na99mTcO4溶液， 置 35-37水浴反应 15min， 得到标记产物 99mTc-Cys-Annexin V， 所述 Na99mTcO 4溶液由江苏 省原子医学研究所临床部核医学科提供， 放射量为 18.5-555MBq。 0055 采用HPLC法对所述标记产物进行检测， 采用TSK GEL凝胶柱 （SWG2000swxL） ， 以浓。

30、 度0.05M、 pH7.0的磷酸缓冲液为流动相， 流速0.8mL/min， 紫外检测波长278nm， 并设置有同 位素检测仪。同时以相同的检测条件检测未标记的 Cys-Annexin V。如图 1-2 所示， 测得 说 明 书 CN 103159842 A 6 5/7 页 7 99mTc-Cys-Annexin V 的保留时间 （t R） 为 9.8min， 与没有标记的 Cys-Annexin V 的保留时间 相一致。通过 HPLC 色谱图分析， 计算得到标记率为 98.5%。可见， 本发明所述的药盒不仅可 以实现用 99mTc 标记 Cys-Annexin V， 而且标记的效率较高。 0。

31、056 实施例 3 0057 按 照 实 施 例 1 中 所 述 的 方 法 配 制 所 述 药 盒， 其 区 别 仅 在 于 为 了 将 99mTc-Cys-Annexin V 与其他放射性杂质区分开来， 在配制所述药盒时不加入 Cys-Annexin V， 使得得到的药盒中不含有标记目标 Cys-Annexin V， 而其他配制及标记的操作不变， 得到 的标记产物主要是 99mTc-EDTA， 以实施例 2 中 HPLC 纯化的检测条件进行 HPLC 检测， 如图 3 所示， 99mTc-EDTA 的保留时间 （t R） 为 13.4min。 0058 实施例 4 0059 按 照 实 施。

32、 例 1 中 所 述 的 方 法 配 制 所 述 药 盒， 其 区 别 仅 在 于 为 了 将 99mTc-Cys-Annexin V 与其他放射性杂质区分开来， 在配制所述药盒时不加入 Cys-Annexin V 和乙二胺四乙酸钠， 使得得到的药盒中不含有标记目标 Cys-Annexin V 和乙二胺四乙酸 钠， 而其他配制及标记的操作不变， 得到的标记产物主要是 99mTc胶体， 以实施例2中HPLC纯 化的检测条件进行 HPLC 检测， 如图 4 所示， 99mTc 胶体的保留时间 （t R） 为 12.5min。 0060 以实施例2中HPLC纯化的检测条件进行HPLC检测， Na99。

33、mTcO4溶液的保留时间 （tR） 为 15.9min， 如图 5 所示。 0061 图1-5中说明 99mTc-Cys-Annexin V与其他放射性杂质 （如99mTc胶体，99mTc-EDTA和 Na99mTcO4） 能完全分开， 通过HPLC计算 99mTc-Cys-AnnexinV的标记率， 不仅可行且直观准确。 0062 实施例 5 0063 通过 99mTc-Cys-Annexin V在小鼠体内的生物分布， 说明该标记化合物的生物学分 布特点符合作为显像剂的要求。 0064 取 ICR 小鼠 35 只， 随机分为 7 组， 每组 5 只， 经尾静脉注射 0.2mL（3.7MBq）。

34、 实施 例 2 中所述药盒进行标记操作得到的标记产物 99mTc-Cys-Annexin V， 分别于注射后 5， 15， 30， 60， 120， 180， 240min 共 7 个时间点断头处死。取出血液， 脑、 心、 肝、 脾， 肺， 肾， 胃， 小肠， 膀胱， 肌肉和骨等脏器， 称重后用 计数仪测量放射性计数， 计算每克脏器百分注射剂量 率 （%ID/g， 每克脏器的放射性计数 / 注射入大鼠体内总放射性计数 100%） ， 如图 6 所示， 肾中摄取的放射性最高， 其次是膀胱， 肝脏和肺， 在脑中的摄取很低。用 DAS2.0 软件拟合， 分析 99mTc-Cys-AnnexinV 在。

35、正常小鼠体内的药代动力学曲线， 如图 7 所示， 符合二室模型 特征， 药代公式为 ： C=5.972e-0.123t+0.877e-0.005t， 分布相半衰期 （T1/2） 为 5.619min， 清除相 半衰期 （T1/2） 为 129.465min， 平均血浆清除率 （CL） 为 0.084L/min/kg， 药 - 时曲线下面积 （AUC0 值） 为 238.123%ID/g*min。 0065 实施例 6 0066 大鼠肝脏凋亡模型的 99mTc-Cys-Annexin V 显像 0067 选择SD大鼠4只 （卫生部核医学重点实验提供） ， 体重280-290g， 以5mg/kg的。

36、放线 菌酮剂量制备大鼠肝脏凋亡模型， 3 只大鼠分别经尾静脉注射放线菌酮溶液， 另 1 只大鼠注 射生理盐水作对照。3 小时后， 4 只大鼠分别经尾静脉注射 0.2mL（18.5MBq） 实施例 2 中标 记得到的 99mTc-Cys-AnnexinV， 注射显像剂后 3h 进行前、 后位静态平面显像， 能峰 140KeV， 能窗 20%， 图像矩阵 128128， 采集计数 1000K。如图 8 所示， 左侧为模型鼠， 箭头处为凋亡 说 明 书 CN 103159842 A 7 6/7 页 8 肝脏显像， 右侧为正常对照鼠， 在左侧模型鼠的前位静态平面显像图中可观察到肝脏部位 有明显的放射性。

37、浓聚。 0068 显像结束后， 大鼠处死， 立即取出肝脏， 一部分用福尔马林液固定， 另一部分用 计数仪测定放射性计数， 并称重， 计算每克脏器百分注射剂量率 （%ID/g） ， 模型鼠肝脏摄取 的放射性 （ID%/g） 是对照组的 2.83 倍。 0069 实施例 7 0070 大鼠凋亡肝脏的原位末端标记法 （TUNEL） 检测 0071 TUNEL 法用于单细胞水平凋亡免疫组化检验和量化分析， 其原理为标记 DNA 断裂 位， 详细步骤如下 ：（1） 大鼠肝脏样本经福尔马林液固定 24h 后， 石蜡包埋， 切片， 每片厚度 4-5m ；（2） 二甲苯脱蜡 30min， 梯度乙醇水化后 PB。

38、S 冲洗， 每次 1min，（3） 滴加蛋白酶 K， 37孵育 30min 后， PBS 洗涤 3 次，（4） 滴加 TUNEL 检测液 （购自碧云天生物技术研究所） ， 37避光孵育 1h， PBS 洗涤 3 次，（5） 用抗荧光淬灭封片液封片后， 100 倍荧光显微镜下观 察。如图 9 所示， 左侧为模型鼠， 右侧为对照组， 图中箭头所指为发荧光的凋亡小体， 模型鼠 的肝脏可见较多的发荧光的凋亡小体， 而对照组的肝脏中发荧光的凋亡小体就很少。这个 结果与本发明实施例 2 中所述药盒标记得到的 99mTc-Cys-Annexin V 的大鼠肝脏凋亡显像 的结果相一致， 说明 99mTc-Cy。

39、s-Annexin V标记化合物作为显像剂能够显示大鼠肝脏的凋亡 情况。 0072 下述各实施例研究各组分含量在一定范围内变化时对药盒标记率的影响情况。 0073 实施例 8 0074 保持其他组分含量按实施例 1 中的不变， 改变药盒中 Cys-Annexin V 的含量为 10-200g， 按实施例 2 的方法和测定标记率。结果如图 10 所示， Cys-Annexin V 的含量在 25-150g 范围内， 药盒标记率达到 90% 以上。 0075 实施例 9 0076 保持其他组分含量按实施例 1 中的不变， 改变药盒中氯化亚锡为溴化亚锡， 且其 含量为 1-100g， 按实施例 2 。

40、的方法测定标记率。结果如图 11 所示， 氯化亚锡的含量在 5-40g 范围内， 药盒标记率达到 90% 以上。 0077 实施例 10 0078 保持其他组分含量按实施例 1 中的不变， 改变药盒中乙二胺四乙酸盐为乙二胺四 乙酸钾， 且其含量为0.1-10mg， 按实施例2的方法标记和测定标记率。 结果如图12所示， 乙 二胺四乙酸钠的含量在 0.5-6mg 范围内， 药盒标记率达到 90% 以上。 0079 实施例 11 0080 以现有技术方法对 Cys-Annexin V 进行标记 ： 0081 取3.5mg氯化亚锡溶于10ml pH7.4的PBS缓冲液中制成3.5mg/ml的SnCl。

41、2备用。 室温下， 取 100L SnCl2溶液向其中加入 0.6g/L 的 Cys-Annexin V20L 进行反应。 向其中加入体积小于0.1ml， 放射量为185MBq的Na99mTcO4溶液， 然后滴入10mg/mL Vc10L 静止 30min 反应。以实施例 2 中所述 HPLC 的条件检测反应液， 结果如图 13 所示。可见， 以 现有技术中的方法进行Cys-Annexin V标记， 方法中存在的杂质很难与标记蛋白区分， 一方 面容易影响产物标记率的检测， 同时也使得产物的纯度受到影响。 0082 显然， 上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例， 而并非对实施方式的限定。 对 。

42、说 明 书 CN 103159842 A 8 7/7 页 9 于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。 说 明 书 CN 103159842 A 9 1/6 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 10 2/6 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 11 3/6 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 12 4/6 页 13 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 13 5/6 页 14 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 14 6/6 页 15 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 103159842 A 15 。