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1、(10)申请公布号 CN 103159854 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103159854 A *CN103159854A* (21)申请号 201310072939.4 (22)申请日 2013.03.07 C07K 17/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 郑晓冬 殷赟 沙莎 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (54) 发明名称 抗体与微珠连接方法 (57) 摘要 本发明公开了一种抗体与微珠连接方法， 包 括抗体与核苷酸交联， 核苷。
2、酸与微珠结合， 核苷酸 互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体 的修饰与脱盐、 核苷酸的修饰与脱盐、 修饰后抗体 与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功 能基团为核苷酸和抗体作修饰， 通过醛基与氨基 使其结合形成腙键结合。 在本发明中， 核苷酸与微 珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上 修饰的生物素特异性吸附完成的 ； 核苷酸互补链 杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成 ； 通过 Cy3 标记的二抗等在特定温度条件下孵育鉴 定微珠上反应是否成功。 本发明以寡核苷酸作为 “支撑臂” ， 将抗体与磁珠表面隔开一定距离， 有利 于避免抗体遭结构破坏， 保护抗体活性。 (51)Int。
3、.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103159854 A CN 103159854 A *CN103159854A* 1/1 页 2 1. 抗体与微珠连接方法， 其特征是包括以下步骤 ： 1） 、 抗体与核苷酸交联 ： A、 抗体的修饰与脱盐 ： 25 100g 免疫球蛋白稀释成浓度为 2 8mg/mL 后与 SANH 均匀混合后， 于 20 30 的摇床中孵育修饰 2 6 小时， SANH 与免疫球蛋白的摩尔比为 1。
4、0 70 ： 1 ； 将所得的抗体修饰产物经洗涤、 离心过滤， 以除去多余的 SANH ； 得脱盐后的抗体修饰 产物 ； B、 核苷酸的修饰与脱盐 ： 用 pH 7.0 7.6 的磷酸缓冲液将核苷酸稀释至 6 12 mg/mL， 加入 SFB 均匀混合， 于 20 30 的摇床中孵育修饰 2 6 小时， SFB 与核苷酸的摩尔比为 10 70 ： 1 ； 将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、 离心、 过滤， 以除去多余的 SFB ； 得脱盐后的核苷酸 修饰产物 ； C、 修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化 将脱盐后的抗体修饰产物和脱盐后的核苷酸修饰产物按照 1:812 的摩尔比均匀混 合， 于 2 8 。
5、充分反应 8 24 小时， 将所得的交联后产物经洗涤、 离心、 过滤， 除去游离寡核苷酸并进行脱盐 ； 得纯化后的 抗体核苷酸交联体 ； 2） 、 抗体核苷酸交联体与微珠作用 ： 微珠先经洗涤液洗涤， 然后静置 ； 将 1 910-11 mol biotin 修饰的核苷酸加入 5 15 l 的 Neutravidin 包被的磁 珠， 于 20 30 的摇床孵育 10 30 分钟， 接着用洗涤液洗涤 ； 随后加入上述 51010-13 mol 纯化后的抗体核苷酸交联体， 在 6SSPE 缓冲液 （pH 6.0） 条件下于 20 30 的摇 床孵育 1 4 小时， 再用洗涤液洗涤 ； 得微珠体系 。
6、； 所述洗涤液为将 BSA 用 PBS 溶液 （pH 7.4） 稀释至质量浓度为 0.10.5 % 而得 。 2. 根据权利要求 1 所述的抗体与微珠连接方法， 其特征是 ： 将所得的微珠体系进行如下步骤 ： 在 Cy3 标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系， 在 20 30 条件下摇床孵育 1 4 小时 ； 接着用 PBS（pH 7.4） 洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白， 最后用荧光显微 镜观察结果。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的抗体与微珠连接方法， 其特征是 ： 所述步骤 1） A 中 ： 摇床的转速为 50 150 转 / 分 ； 用 pH 8 的 0.1 mM 的 ED。
7、TA 溶液进 行洗涤 ； 所述步骤 1） B 中 ： 摇床的转速为 50 150 转 / 分 ； 用 pH 8 的 0.1 mM 的 EDTA 溶液洗 涤 ； 所述步骤 1） C 中 ： 将所得的交联后产物用 pH 8 的 0.1 mM 的 EDTA 溶液洗涤。 权 利 要 求 书 CN 103159854 A 2 1/7 页 3 抗体与微珠连接方法 技术领域 0001 本发明涉及一种抗体与微珠连接方法。 背景技术 0002 自 1979 年将聚苯乙烯微珠成功磁化并与抗体连接后， 即成为一种效果极佳的分 离方法， 引发了生物分离技术上的一次革命。该方法具有以下优点 ：（1） 分离速度快、 效率。
8、 高、 可重复性好 ；（2） 操作简单、 不需要昂贵的仪器设备 ；（3） 比表面积大， 可提高检测灵敏 度 ；（4） 不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。 0003 随着科学技术的发展以及纳米技术的推广， 纳米材料已在生命科学研究领域发挥 了重要作用。磁性纳米微珠作为一种新型的纳米技术， 已经成功应用于核酸提取、 废水处 理、 靶向药物、 食品安全检测等系统上， 并取得一定的进展。包被技术的进步能大大扩展磁 性微珠的应用范围。因此， 研究微珠表面的连接技术与方法， 将使其运用至更广阔的分离、 检测领域， 并将极大地提高检测灵敏度。 0004 食品安全事关广大人民群众的身体健康， 。
9、受到政府和老百姓的高度关注。近年来 食品质量问题十分突出， 非法使用违禁药物、 滥用抗生素， 超量超范围使用兽药等都对群众 身体健康造成了很大危害。 针对以上问题， 一方面要加强监管 ； 另一方面要开发特异性的快 速分离、 检测方法。对磁性微珠表面包被特异性的抗体将是一种较为简便且高效的检测方 面。包被方法多样， 较为常用的是将抗体直接通过基团作用固定至微珠表面。然而此种方 法灵敏度有限， 抗体在微珠上的非特异性吸附将大大降低其检测效果。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种能提高检测灵敏度的抗体与微珠连接方法。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种抗体与微珠连接方。
10、法， 包括以下步骤 ： 0007 1） 、 抗体与核苷酸交联 ： 0008 A、 抗体的修饰与脱盐 ： 0009 25 100g 免疫球蛋白 （Immunoglobulin， 简称 IgG） 稀释成浓度为 2 8mg/mL 后与 SANH（Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone） 均匀混合后， 于 20 30的摇床中孵育修饰 2 6 小时， SANH 与免疫球蛋白的摩尔比为 10 70 ： 1 ； 0010 将所得的抗体修饰产物经洗涤、 离心过滤， 以除去多余的 SANH ； 得脱盐后的抗体 修饰产物 ； 测 IgG 的蛋白浓度。
11、， 待用 （目的是 ： 计算修饰、 脱盐步骤后抗体的回收率， 避免因 为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。 ） 0011 B、 核苷酸的修饰与脱盐 ： 0012 用 pH7.0 7.6 的磷酸缓冲液将核苷酸 （寡核苷酸） 稀释至 6 12mg/mL， 加入 SFB （Succinimidyl 4-formylbenzoate） 均匀混合， 于2030的摇床中孵育修饰26小时， SFB 与核苷酸 （寡核苷酸） 的摩尔比为 10 70 ： 1 ； 0013 备注说明 ： 上述核苷酸序列为 GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA（5 3 ） ， 3 端 说 明 书 CN 1031。
12、59854 A 3 2/7 页 4 修饰了氨基 ； 0014 将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、 离心、 过滤， 以除去多余的 SFB ； 得脱盐后的核 苷酸修饰产物 ； 测核苷酸浓度， 待用 （目的是计算修饰、 脱盐步骤后寡聚核苷酸的回收率， 避 免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。 ） 0015 C、 修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化 0016 将脱盐后的抗体修饰产物 （为修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物） 和脱盐后的核 苷酸修饰产物 （为修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物） 按照 1:8 12 的摩尔比均匀混合， 于 2 8充分反应 8 24 小时， 0017 将所得的交联后产物经洗涤、 离心。
13、、 过滤， 除去游离寡核苷酸并进行脱盐 ； 得纯化 后的抗体核苷酸交联体 ； 0018 在 350nm 下测定吸光值， 待用 （抗体和寡核苷酸的修饰基团在交联的过程中生成 稳定存在的腙键， 该腙键在350nm下有特异吸收峰 ； 因此测定350nm是否有明显吸收峰生成 是验证交联成功的有力证明 ； 通过测定 350nm 下特异吸收峰值， 可进一步计算出交联产物 的浓度） ； 0019 2） 、 抗体核苷酸交联体与微珠作用 ： 0020 微珠先经洗涤液洗涤， 然后静置 ； 0021 将 1 910-11mol biotin 修饰的核苷酸 （序列为 TCACA TTTGC CTGCA GAGAT T。
14、TCCC5 3 ,3 biotin 修饰） 加入 5 15l 的 Neutravidin 包被的磁珠， 于 20 30 的摇床孵育 10 30 分钟， 接着用洗涤液洗涤 ； 随后加入上述 5 1010-13mol 纯化后的抗 体核苷酸交联体， 在 6SSPE 缓冲液 （pH6.0） 条件下于 20 30的摇床孵育 1 4 小 时， 再用洗涤液洗涤 ； 得微珠体系 ； 0022 所述洗涤液为将 BSA 用 PBS 溶液 （pH7.4） 稀释至质量浓度为 0.1 0.5% 而得。 0023 备注说明 ： 0024 步骤A所得的脱盐后的抗体修饰产物和步骤B所得的脱盐后的核苷酸修饰产物分 别通过对硝基。
15、苯甲醛与 2- 肼吡啶二盐酸盐鉴定基团修饰是否成功 ； 方法为各取少量脱盐 后的抗体修饰产物或脱盐后的核苷酸修饰产物， 分别加入过量对硝基苯甲醛、 2- 肼吡啶二 盐酸盐， 避光孵育后， 测定产物基团在特定波长下的吸光值。当抗体鉴定产物在 390nm 下有 特异吸收峰， 则判定修饰成功 ； 当寡核苷酸鉴定产物在 350nm 下有特异吸收峰， 则判定为修 饰成功。 0025 作为本发明的抗体与微珠连接方法的改进 ： 0026 将所得的微珠体系进行如下步骤 ： 0027 在Cy3标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系， 在2030条件下摇床孵 育 1 4 小时 ； 接着用 PBS（pH7.4） 。
16、洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白， 最后用荧光显微 镜观察结果。 0028 备注说明 ： 在荧光显微镜下观察到荧光信号， 则证明抗体已成功通过寡核苷酸的 “联系” 连接到了磁珠的表面。 0029 作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进 ： 0030 Cy3 标记的荧光二抗与 PBS 缓冲液 （pH7.4） 的体积比为 ： 1:10 30。 0031 作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进 ： 说 明 书 CN 103159854 A 4 3/7 页 5 0032 步骤 1） A 中 ： 摇床的转速为 50 150 转 / 分 ； 用 pH8 的 0.1mM 的 EDTA 溶液进行 洗涤。
17、 ； 0033 步骤 1） B 中 ： 摇床的转速为 50 150 转 / 分 ； 用 pH8 的 0.1mM 的 EDTA 溶液洗涤 ； 0034 步骤 1） C 中 ： 将所得的交联后产物用 pH8 的 0.1mM 的 EDTA 溶液洗涤。 0035 在步骤 1） 的 A 中 ： 0036 孵育完后收集修饰产物， 将产物移入密理博的 YM-100（截留分子量大于 10000KDa 的生物分子） 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM 的 EDTA 溶液洗涤、 离心过滤 2 4 次， 除去多余的 SANH 修饰剂， 然后倒扣滤管离心， 收集脱盐后的修饰产物。测 IgG 的蛋白浓度， 待用。 。
18、0037 在步骤 1） 的 B 中 ： 0038 孵育完后收集修饰产物， 将产物移入密理博的 YM-3（截留分子量大于 3000KDa 的 生物分子） 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM 的 EDTA 溶液洗涤、 离心过滤 2 4 次， 除去多余的 SFB 修饰剂， 然后倒扣滤管离心， 收集脱盐后的核苷酸修饰产物。测核苷酸浓度， 待用。 0039 在步骤 1） 的 C 中 ： 0040 由于交联后产物需要再次纯化， 交联完后收集交联后产物， 将产物移入密理博的 YM-100（截留分子量大于 10000KDa 的生物分子） 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM EDTA 溶液洗 涤、 离心。
19、过滤24次， 除去未交联的多余的核苷酸单体， 然后倒扣滤管离心， 收集纯化后交 联产物。在 350nm 下测定吸光值， 待用。 0041 在本发明中， 任意一种抗体均可被固定到微珠上 ； 与抗体交联的寡核苷酸长度一 般在 20-23 个碱基， 3 端修饰氨基， 从而能够通过本发明所述的方法与抗体交联。选用的磁 珠预先包被了抗生物素蛋白 ； 与磁珠表面连接的寡核苷酸必须与抗体交联的寡核苷酸对应 互补， 并在 3 端修饰有生物素， 从而能够如本发明的方法与磁珠表面连接。 0042 具体而言， 本发明开发了一种新型的抗体与微珠相连的方法， 成功的对抗体与核 苷酸进行交联， 并保持其良好活性。本发明的。
20、连接方法是将带有生物素 （biotion） 的互补 核苷酸链与包被有亲和素 （Neutravidin） 微珠连接后， 通过两条核苷酸链杂交的方式， 将抗 体 - 核苷酸交联体连接到微珠表面来完成抗体与微珠的相连， 最后以 Cy3 标记的二抗鉴定 是否连接成功。具体原理如图 1 所示。 0043 本发明的抗体与微珠交联方法 ： 包括抗体与核苷酸交联， 核苷酸与微珠结合， 核苷 酸互补链杂交等流程。 抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、 核苷酸的修饰与脱盐、 修 饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰， 通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中， 核苷。
21、酸与微珠的结合是由微珠上包 被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的 ； 核苷酸互补链杂交通过特定的 杂交液在一定温度条件下完成 ； 通过 Cy3 标记的二抗在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反 应是否成功。 0044 本发明的抗体与微珠连接方法， 具有如下优点 ： 0045 1、 寡核苷酸作为 “支撑臂” ， 将抗体与磁珠表面隔开一定距离， 有利于避免抗体遭 结构破坏， 保护抗体活性。 0046 2 解决了抗体固定于固相载体时的活性基团衍向问题。 0047 3、 提高抗体与其他物质反应的灵活性。 说 明 书 CN 103159854 A 5 4/7 页 6 附图说明 0048 下面结合。
22、附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0049 图 1 为抗体与微珠交联方法原理图。 0050 图 2 为抗体与微珠成功交联后荧光二抗鉴定图像。 具体实施方式 0051 实施例 1、 兔免疫球蛋白 (IgG) 与磁珠的连接 ： 0052 1） 、 兔免疫球蛋白 (IgG) 与核苷酸交联 0053 A、 兔免疫球蛋白 (IgG) 的修饰与脱盐 0054 将 50g 的兔免疫球蛋白 （Rabbit Immunoglobulin， 简称 Rabbit IgG） 用修饰缓 冲液 （100mM磷酸盐、 150mM氯化钠， pH7.2-7.4） 稀释成浓度为6mg/mL ； 然后用SANH溶液 （。
23、浓 度为 6.8910-2mol/L） 修饰， SANH 与 Rabbit IgG 的摩尔比为 60 ： 1。将 SANH 溶液与 Rabbit IgG 溶液均匀混合后， 放置于 25的摇床中， 以 100 转 / 分钟的转速孵育修饰 4 小时。孵育 完后将产物移入密理博的 YM-100 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM EDTA 溶液洗涤、 离心 （5000 转 / 分） 过滤 3 次， 以除去多余的 SANH 修饰剂， 然后倒扣滤管离心 （5000 转 / 分） ， 收集脱盐后 的抗体修饰产物。测 Rabbit IgG 的蛋白浓度为 2.44mg/mL， 待用。 0055 将以上步骤。
24、所得的脱盐后的抗体修饰产物取少量， 通过与对硝基苯甲醛 (4-nitrobenzaldehyde) 反应鉴定基团修饰是否成功 （反应如下） ； 0056 0057 操作步骤 ： 0058 （1）设 置 反 应 组 和 对 照 组， 在 反 应 组 中 取 1L 修 饰 后 抗 体 溶 液， 加 入 5L4-nitrobenzaldehyde（0.5mM）混 合 ； 对 照 组 中 取 1L 空 白 修 饰 缓 冲 液， 加 入 5L4-nitrobenzaldehyde（0.5mM） 混合， 将两组均置于 37， 避光， 反应 30min。 0059 （2） 用 Nanodrop 进行 UV 。
25、测定， 以对照组作为 “blank” 后， 测定反应组的 UV 吸收光 谱， 得到 390nm 处吸收峰。如有特异吸收峰出现， 可判定为修饰成功。若没有特异吸收峰， 则无法判定是否修饰成功， 需要重新优化修饰方法。但在对某种特定的抗体样品 （Rabbit IgG 等） 修饰方法已经成熟且可重复操作时， 为节省样品可省略鉴定的步骤。 0060 备注说明 ： SANH， Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone， 即， 琥珀酰亚胺基 4- 肼基烟酸盐丙酮腙。购自美国 SoluLink 公司 S-HyNic（SANH） Kit 货号 (S。
26、-9002-2)。产品原为粉末状， 用 DMF（N,N-Dimethylformamide， N- 甲酰二甲胺） 溶剂溶 解为溶液。 0061 B、 核苷酸的修饰与脱盐 0062 核苷酸序列为 GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA （5 3 ） ， 3 端修饰了氨基。用 pH7.4 的 PBS 将核苷酸稀释至 10mg/mL， 然后用 SFB 溶液 （浓度为 8.09410-2mM） 修饰。SFB 与核苷酸之间的摩尔比为 60 ： 1。将 SFB 溶液与核苷酸溶液均匀混合后， 放置于 25的摇床 说 明 书 CN 103159854 A 6 5/7 页 7 中， 以 10。
27、0 转 / 分钟的转速孵育修饰 4 小时。孵育完将产物移入密理博的 YM-3 滤管里， 用 pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、 离心 （13000转/分） 过滤3次， 以除去多余的SFB修饰剂， 然后 倒扣滤管离心 （13000转/分） ， 收集脱盐后的核苷酸修饰产物， 测得核苷酸的浓度为3-4ug/ Ul3.42ug/uL ； 待用。 0063 将上述步骤所得的脱盐后的核苷酸修饰产物通过与 2- 肼吡啶二盐酸盐 （2-hydrazinopyridine） 鉴定基团修饰是否成功 （反应如下） ； 0064 0065 操作步骤 ： 0066 （1）设置反应组和对照组， 在反应组中取 1L 修。
28、饰后寡核苷酸溶液， 加入 5L2-hydrazinopyridine（0.5mM）混 合 ； 对 照 组 中 取 1L 空 白 修 饰 缓 冲 液， 加 入 5L2-hydrazinopyridine（0.5mM） 混合， 将两组均置于 37， 避光， 反应 30min。 0067 （2） 用 Nanodrop 进行 UV 测定， 以对照组作为 “blank” 后， 测定反应组的 UV 吸收光 谱， 得到 350nm 处吸收峰。如有特异吸收峰出现， 可判定为修饰成功。 0068 备注说明 ： SFB ： Succinimidyl 4-formylbenzoate， 即琥珀酰亚胺基 4- 甲酰基。
29、苯 甲酸酯。购自美国 SoluLink 公司 S-HyNic （SANH） Kit 货号 (S-9002-2)。产品原为粉末状， 用 DMF（N,N-Dimethylformamide， N- 甲酰二甲胺） 溶剂溶解为溶液。 0069 C、 修饰后兔免疫球蛋白 (IgG) 与核苷酸的交联与纯化 0070 将经脱盐后并鉴定修饰成功的抗体 （即经判定修饰成功的脱盐后的抗体修饰 产物） 与寡核苷酸 （经判定修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物） 以 1:10 摩尔比均匀混 合， 放置 4下充分反应 12 小时。其形成的基团在 350nm 波长下有明显的吸收峰， 测得 OD350=0.083， 证明交联成。
30、功。 0071 交联后产物需要再次纯化， 将其移入密理博的 YM-100 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM EDTA 溶液洗涤、 离心 （5000 转 / 分） 过滤 3 次， 以除去未交联的多余的核苷酸单体， 倒扣滤 管离心 （5000 转 / 分） 收集。产物在 350nm 下测定吸光值， 得到纯化后的交联产物浓度， 在 损失较少且体系体积保持一致的情况下， 纯化后的交联体浓度与纯化前的大致相同， 或稍 偏低 （在本实施例中为 1.28mg/mL） 。 0072 2） 、 抗体核苷酸交联体与微珠作用 ： 0073 A、 微珠与互补核苷酸的连接 0074 将 BSA 用 PBS 溶液 。
31、（pH7.4）稀释至质量浓度为 0.1 0.5% ； 以此为洗涤液对 Neutravidin 包被微珠进行洗涤 （共 3 次） ， 静置 20 分钟。将 210-11mol biotin 修饰的 核苷酸 （序列为 TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC5 3 ,3 biotin 修饰）加入 5l Neutravidin 包被的磁珠， 25摇床孵育 15 分钟， 用上述洗涤液洗涤 3 次， 得到核苷酸包被 的磁珠。 0075 备注 ： 微珠可通过市购的形式获得， 例如可购自 BioQ Technologies 公司的 UniQ 磁珠， 包被 Neutravidin， 直径 3。
32、00nm。 说 明 书 CN 103159854 A 7 6/7 页 8 0076 B、 抗体核苷酸交联体与微珠的连接 0077 取抗体 - 核苷酸交联体约 0.1l （即 8.510-13mol 的步骤 1 所得的纯化后交联产 物） 加入上述核苷酸包被的磁珠， 在6SSPE缓冲液 （pH6.0） 条件下摇床孵育2小时 （25） ， 用上述洗涤液洗涤 3 次。 0078 实验 1、 磁珠表面连接抗体对 Cy3 荧光标记二抗的捕获 0079 将 1l Cy3 荧光标记二抗以 PBS（pH7.4） 1 ： 20 稀释， 然后加入微珠体系 （即上述 步骤 “抗体核苷酸交联体与微珠作用” 所得的产物）。
33、 ， 在 25条件下摇床孵育 2 小时。然 后用 PBS（pH7.4） 洗涤， 目的是为了洗去未结合的荧光二抗。最后用荧光显微镜观察结果， 证实微珠表面的抗体成功捕获二抗。如图 2 所示 ： 0080 在 510-560 激发波长下用荧光显微镜 (Nikon,Inc) 观察， 视野中均匀分布有星点 状的亮点。此结果证明抗体成功连接到磁珠表面， 且能够捕获 Cy3 荧光标记二抗。 0081 实施例 2 转基因 Cry1Ac 蛋白单克隆抗体与磁珠表面的连接 0082 1） 、 转基因 Cry1Ac 蛋白单克隆抗体与核苷酸交联 0083 A、 抗体的修饰与脱盐 0084 取 50g 的转基因 Cry。
34、1Ac 蛋白单克隆抗体 （杭州宜康公司制备） ， 将浓度调整为 4mg/mL。 将 SANH 粉 末 （Succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone， 即， 琥珀酰亚胺基 4- 肼基烟酸盐丙酮腙。购自美国 SoluLink 公司 S-HyNic（SANH） Kit 货号 (S-9002-2)） 用 DMF（N,N-Dimethylformamide， N- 甲酰二甲胺） 溶剂溶解为溶液 （浓度为 6.8910-2mol/L） 修饰。取抗体 60 倍摩尔量的 SANH 溶液与抗体溶液混合， 放置于 25的 摇床中， 以 100 转 / 分。
35、钟的转速孵育修饰 4 小时。孵育完后将产物移入密理博的 YM-100 滤 管里面， 用 pH8 的 0.1mM EDTA 溶液洗涤、 离心 （5000 转 / 分） 过滤 3 次， 以除去多余的 SANH 修饰剂， 然后倒扣滤管离心 （5000 转 / 分） ， 收集脱盐后的抗体修饰产物， 约为 20L。测抗 体浓度为 2.68mg/mL， 待用。 0085 B、 核苷酸的修饰与脱盐 0086 核苷酸序列为 GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA （5 3 ） ， 3 端修饰了氨基。用 pH7.4 的 PBS 将核苷酸稀释至 10mg/mL。将 SFB 粉末 （Succin。
36、imidyl 4-formylbenzoate， 即琥珀酰亚胺基 4- 甲酰基苯甲酸酯。购自美国 SoluLink 公司 S-HyNic（SANH） Kit 货号 (S-9002-2)） 用 DMF（N,N-Dimethylformamide， N- 甲酰二甲胺） 溶剂溶解为溶液， 使浓度为 8.09410-2mM。SFB 与核苷酸之间的摩尔比为 60 ： 1。将 SFB 溶液与核苷酸溶液均匀混合 后， 放置于 25的摇床中， 以 100 转 / 分钟的转速孵育修饰 4 小时。孵育完将产物移入密理 博的 YM-3 滤管里， 用 pH8 的 0.1mM EDTA 溶液洗涤、 离心 （13000 。
37、转 / 分） 过滤 3 次， 以除去 多余的 SFB 修饰剂， 然后倒扣滤管离心 （13000 转 / 分） ， 收集脱盐后的核苷酸修饰产物， 测 得核苷酸的浓度为 3.52ug/uL ； 待用。 0087 C、 修饰后转基因 Cry1Ac 蛋白单克隆抗体与核苷酸的交联与纯化 0088 将经脱盐后并鉴定修饰成功的抗体 （即经判定修饰成功的脱盐后的抗体修饰 产物） 与寡核苷酸 （经判定修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物） 以 1:10 摩尔比均匀混 合， 放置 4下充分反应 12 小时。其形成的基团在 350nm 波长下有明显的吸收峰， 测得 OD350=0.083， 证明交联成功。 0089 交。
38、联后产物需要再次纯化， 将其移入密理博的 YM-100 滤管里面， 用 pH8 的 0.1mM 说 明 书 CN 103159854 A 8 7/7 页 9 EDTA 溶液洗涤、 离心 （5000 转 / 分） 过滤 3 次， 以除去未交联的多余的核苷酸单体， 倒扣滤 管离心 （5000 转 / 分） 收集。产物在 350nm 下测定吸光值， 得到纯化后的交联产物浓度， 在 损失较少且体系体积保持一致的情况下， 纯化后的交联体浓度与纯化前的大致相同， 或稍 偏低 （在本实施例中为 1.46mg/mL） 。 0090 2） 、 抗体核苷酸交联体与微珠作用 ： 0091 A、 微珠与互补核苷酸的连。
39、接 0092 将 BSA 用 PBS 溶液 （pH7.4）稀释至质量浓度为 0.1 0.5% ； 以此为洗涤液对 Neutravidin 包被微珠进行洗涤 （共 3 次） ， 静置 20 分钟。将 210-11mol biotin 修饰的 核苷酸 （序列为 TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC5 3 ,3 biotin 修饰）加入 5l Neutravidin 包被的磁珠， 25摇床孵育 15 分钟， 用上述洗涤液洗涤 3 次， 得到核苷酸包被 的磁珠。 0093 B、 抗体核苷酸交联体与微珠的连接 0094 取抗体核苷酸交联体 0.1l（即 8.510-13mol 的步。
40、骤 1 所得的纯化后交联产 物） 加入上述核苷酸包被的磁珠中， 在 6SSPE 缓冲液 （pH6.0） 条件下摇床 （25） 孵育 2 小时， 用上述洗涤液洗涤 3 次。 0095 实验 2、 磁珠表面抗体对转基因蛋白 Cry1Ac 的检测 0096 1） 对转基因水稻进行转基因蛋白提取。 0097 将转基因检测样品经蛋白提取和纯化后得到样品检测液。 蛋白提取和纯化为公知 技术， 可参考发表于 浙江大学学报 （农业与生命科学版） 2001 年 02 期的 从转基因水稻 中提取 Bt 毒蛋白的方法与效率 。 0098 2） 磁珠对转基因蛋白的捕获 0099 将转基因蛋白溶液加入微珠体系 （即上述。
41、步骤得到的磁珠 - 抗体连接物） ， 在 25 条件下摇床孵育 1 小时。然后用 PBS（pH7.4） 洗涤， 目的是为了洗去未结合的转基因蛋白。 0100 3） 对转基因蛋白的检测 0101 将生物素标记的 Cry1Ac 兔多克隆抗体 （兔多克隆抗体由杭州宜康公司制备， 生物 素标记由上海友科生物公司制备） ， 加入磁珠体系， 在 25条件下摇床孵育 1 小时。然后用 PBS（pH7.4） 洗涤， 目的是为了洗去未结合的生物素标记 Cry1Ac 兔多克隆抗体。将 Cy3 标 记的链霉亲和素加入磁珠体系， 在 25条件下摇床孵育 30min， 用 PBS（pH7.4） 洗涤， 目的 是为了洗去。
42、未结合的 Cy3 标记的链霉亲和素。 0102 在 510-560 激发波长下用荧光显微镜 (Nikon,Inc) 观察， 视野中均匀分布有星点 状的亮点。此结果证明磁珠表面能够成功检测转基因蛋白。 0103 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103159854 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 103159854 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103159854 A 11 。