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1、(10)申请公布号 CN 103159850 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103159850 A *CN103159850A* (21)申请号 201310100839.8 (22)申请日 2013.03.26 C07K 14/695(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 深圳翰宇药业股份有限公司 地址 518057 广东省深圳市南山区高新技术 工业园中区翰宇生物医药园办公大楼 四层 (72)发明人 潘俊锋 覃亮政 刘建 马。
2、亚平 袁建成 (74)专利代理机构 深圳市深佳知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 44285 代理人 唐华明 (54) 发明名称 替可克肽的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及多肽合成领域， 特别涉及替可克 肽的制备方法。该方法通过取第一固相载体与 Pro 偶联获得固相载体 -Pro， 再逐步偶联氨基酸， 获得第一多肽 - 第一固相载体， 第一多肽的序列 如 SEQ ID No.1 所示 ； 取第二固相载体与氨基酸 偶联， 获得第二多肽 - 第二固相载体， 第二多肽的 序列如SEQ ID No.2所示 ； 取第二多肽-第二固相 载体经第一裂解， 获得第二多肽， 经第一纯化后， 与第一多肽 。
3、- 第一固相载体偶联， 经第二裂解、 第 二纯化、 冻干， 即得。该方法操作简单， 反应时间 短， 收率高， D-Ser 消旋杂质少， 易于纯化。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103159850 A CN 103159850 A *CN103159850A* 1/1 页 2 1. 一种替可克肽的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 步骤 1、 取第一固相载体与 Pro 偶联获得固相载体 -。
4、Pro， 再逐步偶联氨基酸， 获得第一 多肽 - 第一固相载体， 所述第一多肽的序列如 SEQ ID No.1 所示 ； 步骤 2、 取第二固相载体与氨基酸偶联， 获得第二多肽 - 第二固相载体， 所述第二多肽 的序列如 SEQ ID No.2 所示 ； 步骤 3、 取所述第二多肽 - 第二固相载体经第一裂解， 获得第二多肽， 经第一纯化后， 与 所述第一多肽 - 第一固相载体偶联， 经第二裂解、 第二纯化、 冻干， 即得。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤1所述第一固相载体与Pro偶联 采用的有机碱为 DIPEA、 NMM、 TEA、 或 HOBt/DIPCDI/DMA。
5、P 体系。 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 2 所述第二偶联的体系为 PyBOP/HOBt/DIPEA、 HOAt/DIPCDI、 HOBt/DIPCDI、 HATU/HOAt/DIPEA、 TBTU/HOBt/DIPEA、 HBTU/HOBt/DIPEA。 4. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述第一裂解的裂解液包括 TFE 和 DCM。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤3中所述第一纯化具体为取第一 多肽与极性溶剂混合后加入惰性溶剂析晶。 6. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征在于， 所述极性溶剂选自甲醇、 四。
6、氢呋喃、 乙酸乙酯和二氯甲烷 ； 所述的惰性溶剂包括乙醚、 正己烷、 石油醚或甲基叔丁基醚。 7. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 3 中所述偶联的体系为 PyBOP/ HOBt/DIPEA、 HOAt/DIPCDI、 HOBt/DIPCDI、 HATU/HOAt/DIPEA、 TBTU/HOBt/DIPEA、 HBTU/HOBt/ DIPEA。 8. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 3 中所述偶联的溶剂为 DCM、 DMF、 NMP、 DMSO 中的一种或两者以上的混合溶液。 9.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤3中所述第二裂。
7、解采用的裂解液 包括 TFA、 PhSMe、 TIS、 EDT 和 H2O。 10. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 3 中所述第二裂解采用的裂解 液中 TFA、 PhSMe、 TIS、 EDT 和 H2O 的体积比为 85 90:0 4:1 4 ： 2 4 ： 1 5。 权 利 要 求 书 CN 103159850 A 2 1/11 页 3 替可克肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及多肽合成领域， 特别涉及替可克肽的制备方法。 背景技术 0002 替可克肽 (Tetracosactide) 为人工合成的 24 肽促皮质素类似物， 氨基酸的排列 顺序和天然促皮质。
8、素 ( 人、 牛、 猪 ) 氨基端 24 个氨基酸相同， 与天然 ACTH 具有相同的生理 活性。 最突出的特点是一般情况下不会产生抗体反应， 无严重副作用， 特别适用于对于天然 猪促皮质素有过敏反应或无效的患者。 能诱导肾上腺增生， 刺激肾上腺皮质激素， 尤其是氢 化可的松 （皮质醇） 和某些盐皮质激素如皮质酮的分泌， 也能刺激雄激素的分泌， 但作用较 弱。对醛固酮的分泌几无影响。半衰期为 3 小时。2008 年 FDA 批准诺华的替可克肽用于肾 上腺皮质功能减退症的诊断。目前 Randboud University 正在研究其对特发膜性肾病的治 疗作用。 0003 目前替可克肽的合成主要采。
9、用全液相合成方法进行。该方法步骤繁多， 合成起来 花费时间较长， 并且需要用到昂贵的催化剂和高压设备， 因此成本高、 杂质多和操作危险、 收率低等缺点。有报道采用 Z 保护策略逐个合成， 每步均采用氢化脱除保护基， 步骤长， 操 作繁琐以及成本高， 收率低。逐个偶联而导致的丝氨酸易消旋问题， 在纯化过程中难以纯 化。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明提供一种替可克肽的制备方法。该方法操作简单， 反应时间短， 收率高， D-Ser 消旋杂质少， 易于纯化。 0005 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案 ： 0006 本发明提供了一种替可克肽的制备方法， 包括如下步骤 ： 000。
10、7 步骤 1、 取第一固相载体与 Pro 偶联获得固相载体 -Pro， 再逐步偶联氨基酸， 获得 第一多肽 - 第一固相载体， 第一多肽的序列如 SEQ ID No.1 所示 ； 0008 步骤 2、 取第二固相载体与氨基酸偶联， 获得第二多肽 - 第二固相载体， 第二多肽 的序列如 SEQ ID No.2 所示 ； 0009 步骤 3、 取第二多肽 - 第二固相载体经第一裂解， 获得第二多肽， 经第一纯化后， 与 第一多肽 - 第一固相载体偶联， 经第二裂解、 第二纯化、 冻干， 即得。 0010 第一多肽 - 第一固相载体具体为 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc。
11、)-Lys(Boc)- Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Lys(Bo c)-Val-Tyr-Pro- 树脂。 0011 第二多肽 - 第二固相载体具体为 Boc-Ser(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)- Met-Glu(OtBu)-His(Trt)-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-G ly-2-CTC。 0012 在本发明的一些实施例中， 步骤 1 第一固相载体与 Pro 偶联采用的有机碱为 DIPEA、 NMM、 TEA、 或 HOBt/DIPCDI/DMAP 体系。 0013 具体的， Fmoc-Pro-OH 与 2-CTC。
12、 树脂反应， 采用的有机碱为 DIPEA， NMM， TEA ； 说 明 书 CN 103159850 A 3 2/11 页 4 Fmoc-Pro-OH 与王树脂反应采用的是 HOBt/DIPCDI/DMAP 体系 0014 在本发明的一些实施例中， 步骤 2 中第二偶联的体系为 PyBOP/HOBt/DIPEA、 HOAt/ DIPCDI、 HOBt/DIPCDI、 HATU/HOAt/DIPEA、 TBTU/HOBt/DIPEA、 HBTU/HOBt/DIPEA。 0015 作为优选， 步骤 2 中第二偶联的体系为 TBTU/HOBt/DIPEA。 0016 在本发明的一些实施例中， 第一。
13、裂解的裂解液包括 TFE 和 DCM。 0017 作为优选， 步骤 2 中第二偶联的体系为 TFE 与 DCM 的体积比为 1 ： 4。 0018 在本发明的一些实施例中， 步骤 3 中第一纯化具体为取第一多肽与极性溶剂混合 后加入惰性溶剂析晶。 0019 作为优选， 极性溶剂选自甲醇、 四氢呋喃、 乙酸乙酯和二氯甲烷。 0020 作为优选， 惰性溶剂包括乙醚、 正己烷、 石油醚或甲基叔丁基醚。 0021 在本发明的一些实施例中， 步骤 3 中偶联的体系为 PyBOP/HOBt/DIPEA、 HOAt/ DIPCDI、 HOBt/DIPCDI、 HATU/HOAt/DIPEA、 TBTU/HO。
14、Bt/DIPEA、 HBTU/HOBt/DIPEA。 0022 作为优选， 步骤 3 中偶联的体系为 HOAt/DIPCDI。 0023 在本发明的一些实施例中， 步骤 3 中偶联的溶剂为 DCM、 DMF、 NMP、 DMSO 中的一种 或两者以上的混合溶液。 0024 在本发明的一些实施例中， 步骤 3 中第二裂解采用的裂解液包括 TFA、 PhSMe、 TIS、 EDT 和 H2O。 0025 作为优选， 步骤 3 中第二裂解采用的裂解液中 TFA、 PhSMe、 TIS、 EDT 和 H2O 的体积 比为 85 90:0 4:1 4 ： 2 4 ： 1 5。 0026 作为优选， 纯化。
15、为反相高效液相色谱纯化。 0027 在本发明的一些实施例中， 第二固相载体为 2-CTC 树脂。作为优选， 树脂的替代度 为 0.4-1.0mmol/g。 0028 本发明提供一种替可克肽的制备方法。本发明通过取第一固相载体与 Pro 偶联 获得固相载体 -Pro， 再逐步偶联氨基酸， 获得第一多肽 - 第一固相载体， 第一多肽的序列如 SEQ ID No.1 所示 ； 取第二固相载体与氨基酸偶联， 获得第二多肽 - 第二固相载体， 第二多 肽的序列如 SEQ ID No.2 所示 ； 取第二多肽 - 第二固相载体经第一裂解， 获得第二多肽， 经 第一纯化后， 与第一多肽 - 第一固相载体偶联。
16、， 经第二裂解、 第二纯化、 冻干， 即得。该方法 操作简单， 反应时间短， 收率高， D-Ser 消旋杂质少， 易于纯化。 附图说明 0029 图 1 示实施例 18 制得的替可克肽粗肽的 HPLC 图谱 ； 0030 图 2 示对比例制得的替可克肽粗肽的 HPLC 图谱。 具体实施方式 0031 本发明公开了一种替可克肽的制备方法， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围。
17、内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 说 明 书 CN 103159850 A 4 3/11 页 5 0032 本发明提供的替可克肽的制备方法中所用原料均可由市场购得。 0033 说 明 书 CN 103159850 A 5 4/11 页 6 0034 0035 下面结合实施例， 进一步阐述本发明 ： 0036 实施例 1 ： 序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 0037 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)。
18、-Val-Tyr(tBu)-Pro-2-CTC 肽树脂的合成 0038 称取替代度为 0.4mmol/g 的 2-CTC 树脂 50g（20mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 13.5gFmoc-Pro-OH（40mmol） 用 20mlDMF 溶 解， 冰水浴下加入 14.1ml DIPEA（80mmol） 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2 小时后， 加入 15ml 无水甲醇封闭 0.5 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收缩 抽干， 得到 Fmoc-Pro-2-CTC。
19、 树脂 52.4g， 检测替代度为 0.21mmol/g 0039 称取替代度为 0.21mmol/g 的 Fmoc-Pro-CTC 树脂 50g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱 保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g 和 2.97gHOBt， 用 50mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI3.42ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 。
20、反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色 透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0040 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Val-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)。
21、-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH。 0041 当 Fmoc-Lys(Boc)-OH 偶联结束后用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。得到序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 ： 0042 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)-V。
22、al-Tyr(tBu)-Pro-2-CTC 肽树脂， 待用。 0043 实施例 2 ： 序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 0044 H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-Tyr(tBu)-P ro-2-CTC 肽树脂的合成 0045 称取替代度为 0.7mmol/g 的 2-CTC 树脂 28.6g （20mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 13.5gFmoc-Pro-OH（40mmol） 用 40mlDMF 溶。
23、 解， 冰水浴下加入 14.1ml DIPEA（40mmol） 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2 小时后， 加入 15ml 无水甲醇封闭 0.5 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收缩 抽干， 得到 Fmoc-Pro-2-CTC 树脂 29.2g， 检测替代度为 0.405mmol/g。 0046 称取替代度为 0.405mmol/g 的 Fmoc-Pro-2-CTC25g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保 说 明 书 CN。
24、 103159850 A 6 5/11 页 7 护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g 和 2.97gHOBt， 用 50mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI3.42ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色 透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0047 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分。
25、钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Val-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH。 0048 当 Fmoc-Lys(Boc)-OH 偶联结束后用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 。
26、溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。得到序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 ： 0049 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro-2-CTC 肽树脂， 待用。 0050 实施例 3 ： 序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 0051 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(。
27、Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro-2-CTC 肽树脂的合成 0052 称取替代度为 1.0mmol/g 的 2-CTC 树脂 40g（40mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 27.1gFmoc-Pro-OH（80mmol） 用 70mlDMF 溶 解， 冰水浴下加入 28.2ml DIPEA（160mmol） 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2 小时后， 加入 30ml 无水甲醇封闭 0.5 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗。
28、 3 次， 甲醇收缩 抽干， 得到 Fmoc-Pro-2-CTC 树脂 43.6g， 检测替代度为 0.75mmol/g 0053 称取替代度为 0.75mmol/g 的 Fmoc-Pro-CTC 树脂 13.3g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 50ml， 脱保 护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g 和 2.97gHOBt， 用 50mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI3.4。
29、2ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色 透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0054 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Val-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
30、， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH。 0055 当 Fmoc-Lys(Boc)-OH 偶联结束后用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。得到序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 ： 0056 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(。
31、Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly 说 明 书 CN 103159850 A 7 6/11 页 8 s(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro-2-CTC 肽树脂， 待用。 0057 实施例 4 ： 序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 0058 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro- 王树脂的合成 0059 称取替代度为 0.41mmol/g 的王树脂 50g（20mmol） ， 加入到固相反应柱中。
32、， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 13.5gFmoc-Pro-OH （40mmol） 用 20ml DMF 溶解， 冰 水浴下加入 6.84ml DIPCDI （44mmol） 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应五 分钟加入 DMAP0.48g， 反应 2 小时 ； 用 100ml 醋酐 ： 吡啶 =1 ： 1（摩尔比） 封闭液封闭 6 小时。 抽掉反应液， 用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Pro- 王树脂 53.1g， 检 测替代度为 0.32mmol/g。 0060 称取替代度为 。
33、0.32mmol/g 的 Fmoc-Pro- 王树脂 31.25g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 120ml， 脱 保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g 和 2.97gHOBt， 用 50mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI3.42ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色 透明， 则反应完全 ； 如果树脂显。
34、色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0061 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Val-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-。
35、OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH。 0062 当 Fmoc-Lys(Boc)-OH 偶联结束后用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。得到序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载 0063 体 :H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val -Lys(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro- 王树脂， 待用。 0064 实施例 5 ： 序。
36、列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 0065 H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Ly s(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro- 王树脂的合成 0066 称取替代度为 1.0mmol/g 的王树脂 30g （30mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗 涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 20.8gFmoc-Pro-OH（60mmol） 用 80ml DMF 溶解， 冰 水浴下加入 10.2ml DIPCDI（40mmol） 活化。
37、 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 五分钟加入 DMAP0.87g， 反应 2 小时 ； 用 100ml 醋酐 ： 吡啶 =1 ： 1（摩尔比） 封闭液封闭 6 小 时。抽掉反应液， 用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Pro- 王树脂， 检 测替代度为 0.68mmol/g。 0067 称取替代度为 0.0.68mmol/g 的 Fmoc-Pro- 王树脂 14.7g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 120ml， 脱 保护 5 和。
38、 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 说 明 书 CN 103159850 A 8 7/11 页 9 Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g 和 2.97gHOBt， 用 50mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI3.42ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色 透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0068 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V）溶液 100ml， 脱保护 5 和 1。
39、0 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Val-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH。 0069 当 Fmoc-Lys(Boc)-OH 偶联结束后用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:。
40、V） 溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。得到序列如 SEQ ID No.1 所示的第一多肽 - 第一固相载体 :H-Lys(Boc)-Pro-Val-G ly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-Tyr(tBu)-Pro- 王树 脂， 待用 ； 0070 实施例 6 ： 序列如 SEQ ID No.2 所示的第二多肽 0071 Boc-Ser(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-Met-Glu(OtBu)-His(T。
41、rt)-Phe-A rg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-OH 的制备 0072 称取替代度为 0.5mmol/g 的 2-CTC 树脂 40g（20mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 5.94gFmoc-Gly-OH（40mmol） 用 70mlDMF 溶 解， 冰水浴下加入 14.1ml DIPEA（80mmol） 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2 小时后， 加入 15ml 无水甲醇封闭 0.5 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次。 0073 加入 20% 哌啶 /DMF。
42、 （V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗 涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc-Trp(Boc)-OH21.1g 和 5.94gHOBt， 用 90mlDMF溶解， 冰水浴下加入DIPCDI6.85ml活化5分钟， 加入到反应柱中， 室温反应2小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反 映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0074 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后，。
43、 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-His(Trt)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Met-OH。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测 树脂有颜色。 称取Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH39.5g和8.9gHOBt， 用100mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPCDI10.27ml 活化 5 分钟，。
44、 加入到反应柱中， 室温反应 2 小时， 反应终 点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色透明， 则反应完全 ； 如果树脂显色则继续反映 1 小 时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF（V:V） 溶液 100ml， 脱保 护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同 的方法偶联 Boc-Ser(Trt)-OH， 反应结束， DMF 洗 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收缩， 抽干， 得到第 二多肽 - 第二固相载体 ： 0075 Boc-Ser(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(。
45、Psi(Me,Me)pro)-Met-glu(OtBu)-His(Trt)-Phe-A rg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-2-CTC 肽树脂 79.4g。 说 明 书 CN 103159850 A 9 8/11 页 10 0076 将得到的第二多肽 - 第二固相载体 79.4g， 加入预先配置好的裂解液 TFE ： DCM=1 ： 4（V:V） 800ml， 室温裂解 2.5 小时， 过滤， 30ml DCM 洗涤， 合并滤液， 减压浓缩至 80ml， 滴加 到 800ml 无水乙醚析出白色固体， 离心抽干得到白色固体 38.1g， 收率 80.1%。HPLC 纯度为 89.2%。 0。
46、077 实施例 7 ： 序列如 SEQ ID No.2 所示的第二多肽 0078 Boc-Ser(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-Met-Glu(OtBu)-His(Trt)-Phe-A rg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-OH 的制备 0079 称取替代度为 0.5mmol/g 的 2-CTC 树脂 40g（20mmol） ， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 取 5.94gFmoc-Gly-OH（40mmol） 用 70ml DMF 溶 解， 冰水浴下加入 14.1ml DIPEA（80mmol）。
47、 活化 3 分钟后， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2 小时后， 加入 15ml 无水甲醇封闭 0.5 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗 3 次。 0080 加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗 涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。 称取Fmoc-Trp(Boc)-OH21.1g和5.94g HOBt， 用 90mlDMF溶解， 冰水浴下加入DIPCDI6.85ml活化5分钟， 加入到反应柱中， 室温反应2小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色透明， 则反应完全 ； 如果树脂。
48、显色则继续反 映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。 0081 加入 20% 哌啶 /DMF（V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检测树脂有颜色。采用相同的方法偶联 Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-His(Trt)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Met-OH。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液 100ml， 脱保护 5 和 10 分钟， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 采用茚三酮检 测树脂有颜。
49、色。称取 Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH39.5g， PyBOP20.8g 和 8.9g HOBt， 用 100mlDMF 溶解， 冰水浴下加入 DIPEA13.95ml 活化 5 分钟， 加入到反应柱中， 室温反 应 2 小时， 反应终点采用茚三酮检测来判断 （如果树脂无色透明， 则反应完全 ； 如果树脂显 色则继续反映 1 小时。下同） ， 反应结束后， 用 DMF 洗涤树脂 3 次。加入 20% 哌啶 /DMF （V:V） 溶液100ml， 脱保护5和10分钟， 反应结束后， 用DMF洗涤树脂6次， 采用茚三酮检测树脂有 颜色。采用相同的方法偶联 Boc-Ser(Trt)-OH， 反应结束， DMF 洗 3 次， DCM 洗 3 次， 甲醇收 缩， 抽干， 得到第二多肽 - 第二固相载体 ： 0082 Boc-Ser(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)p。