人RHBDD1基因的用途及其相关药物.pdf

本发明公开了人RHBDD1基因的用途及其相关药物。本发明公开了人RHBDD1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人RHBDD1基因小分子干扰RNA、人RHBDD1基因干扰核酸构建体、人RHBDD1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人RHBDD1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中RHBDD1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

权利要求书人RHBDD1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为其肿瘤细胞的增殖与人RHBDD1基因的表达相关的任一种肿瘤。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自：肝癌、舌鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。
一种分离的人RHBDD1基因小分子干扰RNA靶标片段，其序列为SEQ ID NO：1‑33中任意一条序列。
一种人RHBDD1基因小分子干扰RNA，能够特异性沉默人RHBDD1基因的表达，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1‑33之任一的序列作为特异性沉默人RHBDD1基因表达的靶点序列。
如权利要求4所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO：1‑33中之任一序列编码的RNA。
如权利要求6所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15‑27个核苷酸。
如权利要求6所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段中间由茎环片段分隔。
如权利要求8所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
如权利要求4所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO：34。
一种人RHBDD1基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求5‑10任一权利要求所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达人RHBDD1基因小分子干扰RNA。
如权利要求11所述人RHBDD1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人RHBDD1基因干扰核酸构建体为人RHBDD1基因干扰慢病毒载体。
如权利要求12所述人RHBDD1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自：pLKO.1‑puro、pLKO.1‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑CMV‑Neo、pLKO.1‑Neo、pLKO.1‑Neo‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagCFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagYFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagRFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagFP635、pLKO.1‑puro‑UbC‑TurboGFP、pLKO.1‑puro‑UbC‑TagFP635、pLKO‑puro‑IPTG‑1xLacO、pLKO‑puro‑IPTG‑3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV‑G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK‑iT‑DEST、pLenti6‑GW/U6‑laminshrna、pcDNA1.2/V5‑GW/lacZ、pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑DEST、pGCSIL‑GFP或pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑GW/lacZ中的任一。
一种人RHBDD1基因干扰慢病毒，由权利要求11‑13任一权利要求所述人RHBDD1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求5‑10任一权利要求所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA或权利要求14所述人RHBDD1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
如权利要求15所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗肿瘤，所述的肿瘤为其肿瘤细胞的增殖与人RHBDD1基因的表达相关的任一种肿瘤。
如权利要求16所述药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤，选自肝癌、舌鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌之任一。

说明书人RHBDD1基因的用途及其相关药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人RHBDD1基因的用途及其相关药物。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物进化中一项保守的防御机制，于1998年首先发现(Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，Mello CC.Potent and specific genetic interference by double‑stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature.1998；391(6669)：806‑11.)。其本质是由双链RNA介导的与之同源的mRNA特异性降解，进而抑制相应基因表达的过程。由于其基因抑制效果确切，具有级联式放大效应和高穿透性等特点，因而在恶性肿瘤的研究中具有很好的应用前景(Angaji SA，Hedayati SS，Poor RH，Madani S，Poor SS，Panahi S.Application of RNA interference in treating human diseases.J Genet.2010；89(4)：527‑37.)。研究表明，长度为21‑23nt的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(Tuschl T，Zamore PD，Sharp PA，Bartel DP.RNAi：double‑stranded RNA directs the ATP‑dependent cleavage of mRNA at 21to 23 nucleotide intervals.Cell 2000；101：25‑33.)。因此，通过适当的技术生产特异性的siRNA并使其能有效地作用于靶基因的mRNA，即能实现基因沉默的目的。
将外源性DNA导入真核细胞并进行转录和表达的方式主要包括非病毒载体系统的细胞转染和以病毒为载体的细胞感染方式。慢病毒载体是在人免疫缺陷病毒(HIV‑I)基础上改造成的病毒载体系统，能高效的将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒介导的基因表达或RNAi作用持续且稳定，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，随细胞基因组的分裂而分裂，并能有效感染并整合到非分裂细胞中。鉴于慢病毒载体介导的外源基因可以在动物体内实现长期稳定的表达，同时不引起明显的免疫反应，慢病毒载体已经成为研究基因功能的强有力的工具(Herold MJ，van den Brandt J，Seibler J，Reichardt HM.Inducible and reversible gene silencing by stable integration of an shRNA‑encoding lentivirus in transgenic rats.Proc Natl Acad Sci U S A.2008Nov 25；105(47)：18507‑12.)。
Rhomboid家族包含多种膜蛋白，是一类丝氨酸蛋白酶，在原核生物和真核生物之间广泛保守，发挥着重要的调节功能(Koonin EV，Makarova KS，Rogozin IB，Davidovic L，Letellier MC，Pellegrini L.The rhomboids：a nearly ubiquitous family of intramembrane serine proteases that probably evolved by multiple ancient horizontal gene transfers.Genome Biol.2003；4(3)：R19.)。目前，对果蝇Rhomboid蛋白酶的作用已经研究的比较深入。果蝇Rhomboids1‑3具有调节EGF受体信号，控制生长和发育的功能(Lee JR，Urban S，Garvey CF，Freeman M.Regulated intracellular ligand transport and proteolysis control EGF signal activation in Drosophila.Cell.2001；107(2)：161‑71.Urban S，Lee JR，Freeman M.Drosophila rhomboid‑1defines a family of putative intramembrane serine proteases.Cell.2001；107(2)：173‑82.)。果蝇Rhomboid 7被发现与精子发生有关(McQuibban GA，Lee JR，Zheng L，Juusola M，Freeman M.Normal mitochondrial dynamics requires rhomboid‑7and affects Drosophila lifespan and neuronal function.Curr Biol.2006；16(10)：982‑9.)。酵母的Rhomboid蛋白酶被发现在线粒体膜重塑中发挥重要功能(McQuibban GA，Saurya S，Freeman M.Mitochondrial membrane remodelling regulated by a conserved rhomboid protease.Nature.2003；423(6939)：537‑41.)。
脊椎动物的Rhomboid基因可分为三类：(1)活性的细胞Rhomboid，包括RHBDL2、RHBDL4和RHBDD1；(2)无活性的细胞Rhomboid，包括RHBDD5和RHBDD6；(3)线粒体Rhomboid，又称为PARL(Urban S.Rhomboid proteins：conserved membrane proteases with divergent biological functions.Genes Dev.2006；20(22)：3054‑68.)。这些蛋白酶参与重要的信号途径，比如，RHBDL2具有裂解血栓调节蛋白(thrombomodulin)和受体酪氨酸激酶配体(ephrin B3)的作用(Lohi O，Urban S，Freeman M.Diverse substrate recognition mechanisms for rhomboids；thrombomodulin is cleaved by Mammalian rhomboids.Curr Biol.2004；14(3)：236‑41.Pascall JC，Brown KD.Intramembrane cleavage of ephrinB3 by the human rhomboid family protease，RHBDL2.Biochem Biophys Res Commun.2004Apr23；317(1)：244‑52.)。线粒体内膜PARL与细胞凋亡相关(Gottlieb E.OPA1 and PARL keep a lid on apoptosis.Cell.2006；126(1)：27‑9.Cipolat S，Rudka T，Hartmann D，Costa V，Serneels L，Craessaerts K，Metzger K，Frezza C，Annaert W，D′Adamio L，Derks C，Dejaegere T，Pellegrini L，D′Hooge R，Scorrano L，De Strooper B.Mitochondrial rhomboid PARL regulates cytochrome c release during apoptosis via OPA1‑dependent cristae remodeling.Cell.2006；126(1)：163‑75.Hill RB，Pellegrini L.The PARL family of mitochondrial rhomboid proteases.Semin Cell Dev Biol.2010；21(6)：582‑92.)。
人RHBDD1基因(rhomboid domain containing 1)是一个新发现的Rhomboid家族成员，在睾丸中高表达，参与促凋亡蛋白BIK的裂解。在人胚肾细胞(HEK293T)中过表达或敲减RHBDD1基因，分别导致降低或增强的BIK介导的细胞凋亡。因此，RHBDD1作为一种丝氨酸蛋白酶调节BIK介导的细胞凋亡活性(Wang Y，Guan X，Fok KL，Li S，Zhang X，Miao S，Zong S，Koide SS，Chan HC，Wang L.A novel member of the Rhomboid family，RHBDD1，regulates BIK‑mediated apoptosis.Cell Mol Life Sci.2008；65(23)：3822‑9.)。人RHBDD1基因的同源基因，mRHBDD1和rRHBDD1也发现在小鼠和大鼠的卵巢组织中高表达。而且，发现mRHBDD1通过调节精子的凋亡而参与调节精子发生过程(Wang Y，Song W，Li S，Guan X，Miao S，Zong S，Koide SS，Wang L.GC‑1 mRHBDD 1knockdown spermatogonia cells lose their spermatogenic capacity in mouse seminiferous tubules.BMC Cell Biol.2009；10：25.)。然而，人RHBDD1基因是否与肿瘤细胞的凋亡有关以及在肿瘤发生和进展中的作用尚无文献报道。故人RHBDD1基因在肿瘤中作用还有待于进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于公开与人RHBDD1基因相关的治疗方法及药物。
本发明第一方面，公开了将人RHBDD1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人RHBDD1基因用于制备肿瘤诊断药物。
人RHBDD1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人RHBDD1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人RHBDD1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
所述将人RHBDD1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将人RHBDD1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人RHBDD1基因的表达水平。
所述将人RHBDD1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将人RHBDD1基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人RHBDD1基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人RHBDD1基因小分子干扰RNA即是以人RHBDD1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将RHBDD1基因作为作用对象。
所述将人RHBDD1基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人RHBDD1基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人RHBDD1基因的表达相关的任一种肿瘤，更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肝癌、舌鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌。
所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。
进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人RHBDD1基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人RHBDD1基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。
具体的，治疗时，将能有效降低人RHBDD1基因表达水平的物质给药于患者。
进一步的，所述的能有效降低人RHBDD1基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人RHBDD1基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)。该小分子干扰RNA(siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源RHBDD1基因的表达的作用。
进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1‑33之任一的序列作为特异性沉默人RHBDD1基因表达的靶点序列。
所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1‑33之任一的序列作为特异性沉默人RHBDD1基因表达的靶点序列是指：该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO：1‑33中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人RHBDD1基因的表达。
进一步的，所述能够特异性沉默人RHBDD1基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括：将编码所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体获得人RHBDD1基因干扰慢病毒载体，进而利用该人RHBDD1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。
人RHBDD1基因干扰慢病毒载体为将编码所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人RHBDD1基因小分子干扰RNA。
进一步的，所述的慢病毒载体可选自：pLKO.1‑puro、pLKO.1‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑CMV‑Neo、pLKO.1‑Neo、pLKO.1‑Neo‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagCFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagYFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagRFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagFP635、pLKO.1‑puro‑UbC‑TurboGFP、pLKO.1‑puro‑UbC‑TagFP635、pLKO‑puro‑IPTG‑1xLacO、pLKO‑puro‑IPTG‑3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV‑G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK‑iT‑DEST、pLenti6‑GW/U6‑laminshrna、pcDNA1.2/V5‑GW/lacZ、pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑DEST、pGCSIL‑GFP或pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑GW/lacZ中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以pGCSIL‑GFP为载体。
慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。
本发明第二方面，公开了一种分离的人RHBDD1基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO：1‑33中任意一条序列。
所述分离的人RHBDD1基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段可应用于人RHBDD1基因小分子干扰RNA的筛选与制备。
本发明第三方面，公开了一种人RHBDD1基因小分子干扰RNA(siRNA)，能够特异性沉默人RHBDD1基因的表达。
所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1‑33之任一的序列作为特异性沉默人RHBDD1基因表达的靶点序列。
进一步的，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO：1‑33中之任一序列编码的RNA。
所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。
所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15‑27个核苷酸；较佳的，长度均为19‑23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO：1‑33之任一。
所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以UUCAAGAGA为茎环。
如实施例列举的，所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO：34：GCUGGGAUUCUUGUUGGACUAUUCAAGAGAUAGUCCAACAAGAAUCCCAGC。
本发明第四方面，公开了一种人RHBDD1基因干扰核酸构建体，包含编码前述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人RHBDD1基因小分子干扰RNA。
所述的人RHBDD1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的，所述人RHBDD1基因干扰核酸构建体为人RHBDD1基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人RHBDD1基因小分子干扰RNA。
所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1‑puro、pLKO.1‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑CMV‑Neo、pLKO.1‑Neo、pLKO.1‑Neo‑CMV‑tGFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagCFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagYFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagRFP、pLKO.1‑puro‑CMV‑TagFP635、pLKO.1‑puro‑UbC‑TurboGFP、pLKO.1‑puro‑UbC‑TagFP635、pLKO‑puro‑IPTG‑1xLacO、pLKO‑puro‑IPTG‑3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV‑G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK‑iT‑DEST、pLenti6‑GW/U6‑laminshrna、pcDNA1.2/V5‑GW/lacZ、pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑DEST、pGCSIL‑GFP或pLenti6.2/N‑Lumio/V5‑GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL‑GFP为载体构建的人RHBDD1基因干扰核酸构建体，命名为pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA。
进一步的，编码所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO：1‑33中之任一序列及其互补序列。
本发明的人RHBDD1基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人RHBDD1基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人RHBDD1基因小分子干扰RNA。
当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人RHBDD1基因小分子干扰RNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第五方面，公开了一种人RHBDD1基因干扰慢病毒，由前述人RHBDD1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人RHBDD1基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人RHBDD1基因小分子干扰RNA或人RHBDD1基因干扰慢病毒。
进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％如前所述的人RHBDD1基因小分子干扰RNA或人RHBDD1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
综上所述，本发明设计了针对人RHBDD1基因的33个RNAi靶点序列，构建相应的RHBDD1 RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：21的RNAi载体pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA能够显著下调RHBDD1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具将针对RHBDD1基因的shRNA序列高效导人肝癌HepG2细胞、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞，降低RHBDD1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的RHBDD1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人RHBDD1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中RHBDD1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1表示pGCSIL‑GFP质粒DNA图谱
图2表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人肝癌HepG2、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞5天后，与对照慢病毒侵染组相比，RHBDD1 mRNA的表达水平显著降低。
图3表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞4天后，显著抑制细胞增殖。
图4表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人肝癌HepG2细胞5天后，显著抑制细胞增殖。
图5表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人肺癌95D细胞5天后，显著抑制细胞增殖。
图6表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人乳腺癌MCF‑7细胞5天后，显著抑制细胞增殖。
图7表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞5天后，显著抑制细胞增殖。
图8表示RHBDD1‑shRNA慢病毒侵染人胰腺癌Panc‑1细胞5天后，显著抑制细胞增殖。
图9使用RHBDD1抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果
a、b乳腺癌，d、c胰腺癌，e、f胃癌
具体实施方式
本发明基于Rhomboid家族相关的研究，认为RHBDD1作为一个新发现的Rhomboid家族成员可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。
本发明涉及了一组针对人RHBDD1基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人RHBDD1mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10‑30(优选15‑27，更优选19‑23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源RHBDD1基因的表达。
发明人发现，采用RNAi方法下调人RHBDD1基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明RHBDD1基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对RHBDD1基因的siRNA，筛选出了可有效抑制RHBDD1的表达进而抑制人肝癌HepG2细胞、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一系列干扰人RHBDD1基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默RHBDD1基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人RHBDD1基因设计的小干扰RNA及表达人RHBDD1 siRNA的慢病毒，稳定并特异地下调RHBDD1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明RHBDD1基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默RHBDD1基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
本发明的设计思路为：
本发明通过如下方法来筛选获得一种人RHBDD1(NM_032276)基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人RHBDD1基因序列；预测siRNA位点；合成针对RHBDD1基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达RHBDD1基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix，Sigma‑aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，包装产生病毒颗粒，即可制得高效沉默RHBDD1基因的慢病毒。
基于上述方法，本发明提供了33个干扰RHBDD1基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO 1‑33所示)，构建了特异干扰人RHBDD1基因的慢病毒。
同时本发明还公开一种人RHBDD1基因的RNAi慢病毒及其制备与应用。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低肿瘤细胞中内源性RHBDD1基因的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长。本研究表明，RHBDD1基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，RHBDD1基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的RHBDD1基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1：针对人RHBDD1基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人RHBDD1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取RHBDD1(NM_032276)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对RHBDD1基因的有效的siRNA靶点。在RHBDD1基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得33个碱基的序列，表1列出了其中33条针对RHBDD1基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人RHBDD1基因的siRNA靶点序列


针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：21为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL‑GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55‑56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物上游引物序列：5’‑CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA‑3’(SEQ ID NO：35)；下游引物序列：5’‑GTAATACGGTTATCCACGCG‑3’(SEQ ID NO：36)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6‑1，反应条件如表6‑2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO：21的RNAi载体，命名为pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA。
构建pGCSIL‑GFP‑Control‑shRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’‑TTCTCCGAACGTGTCACGT‑3’(SEQ ID NO：37)。构建pGCSIL‑GFP‑Control‑shRNA阴性对照质粒时，针对Scr(scramble)siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA。
表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体
表4pGCSIL‑GFP质粒酶切反应体系
  试剂 体积(μl)  pGCSIL‑GFP质粒(1μg/μl) 2.0  10×buffer 5.0  100×BSA 0.5  Age I(10U/μl) 1.0  EcoR I(10U/μl) 1.0  ddH2O 40.5  Total 50.0
表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
  试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)  线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0  退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 ‑ 1.0  10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0  T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0  ddH2O 16.0 17.0 16.0  Total 20.0 20.0 20.0
表6‑1PCR反应体系
  试剂 体积(μl)  10×buffer 2.0  dNTPs(2.5mM) 0.8  上游引物 0.4  下游引物 0.4  Taq聚合酶 0.2  模板 1.0  ddH2O 15.2  Total 20.0
表6‑2PCR反应体系程序设定

2.构建RHBDD1‑shRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％‑80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma‑aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus‑20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10‑15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于‑80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA序列为SEQ ID NO：34。对照慢病毒control‑shRNA的包装过程同RHBDD1‑shRNA慢病毒，仅以pGCSIL‑GFP‑Control‑shRNA载体代替pGCSIL‑GFP‑RHBDD1‑shRNA载体。
实施例2：实时荧光定量RT‑PCR法检测RHBDD1基因的沉默效率
处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(Tca8113、HepG2细胞、Panc‑1细胞和95D细胞的MOI为10，SGC7901细胞和MCF‑7的MOI为20)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M‑MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。RHBDD1基因的引物如下：上游引物5’‑GCAGGACTGAGTGAAGAAGAAC‑3’(SEQ ID NO：38)和下游引物5’‑GTGAGAGATGAAACCCGTAGG‑3’(SEQ ID NO：39)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’‑TGACTTCAACAGCGACACCCA‑3’(SEQ ID NO：40)和下游引物5’‑CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA‑3’(SEQ ID NO：41)。按表8中的比例配置反应体系。
表7逆转录反应体系
  试剂 体积(μl)  5×RT buffer 4.0  10mM dNTPs 2.0  RNasin 0.5  M‑MLV‑RTase 1.0  DEPC H2O 3.5  Total 11.0
表8Real‑time PCR反应体系
  试剂 体积(μl)
  SYBR premix ex taq：  10.0  上游引物(2.5μM)：  0.5  下游引物(2.5μM)：  0.5  cDNA  1.0  ddH2O  8.0  Total  20.0
设定程序为两步法Real‑time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2‑ΔΔCt分析法计算侵染了RHBDD1 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Control‑shRNA)的细胞作为对照。实验结果(图2)表明，人肝癌HepG2细胞、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞的RHBDD1 mRNA表达水平分别下降了59.6％、60.6％、65％、89.5％、79.9％和68.8％(结果见图2)。
实施例3：检测侵染RHBDD1‑shRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞、人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人乳腺癌MCF‑7细胞、人胰腺癌Panc‑1细胞、人胃癌SGC7901细胞和人肺癌95D细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(Tca8113、HepG2细胞、Panc‑1细胞和95D细胞的MOI为10，SGC7901细胞和MCF‑7的MOI为20)，加入适宜量的RHBDD1‑shRNA慢病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3‑图8所示)。结果表明，慢病毒浸染组各肿瘤在细胞体外培养4‑5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，表明RHBDD1基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。
实施例4肿瘤细胞中RHBDD1基因过表达的试验
组织样本：人胰腺癌，乳腺癌和胃癌的组织样本RHBDD1
抗体：购自Sigma公司
试验方法：
取出组织芯片，将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯15分钟X2，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液中，无水乙醇中，95％乙醇中，85％乙醇中，75％乙醇中，蒸馏水中依次浸泡10分钟；然后用用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H2O2，室温封闭10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；10％血清(TBS配制)封闭30分钟；吸弃血清，勿洗加入RHBDD1抗体(1∶100稀释)孵育过夜；TBS洗2遍，每次5分钟；加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育60分钟；TBS洗4遍，每次5分钟；加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸30秒，清水漂洗7‑8遍；脱水封片，于75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液，二甲苯中，依次浸置5分钟；取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照，结果如图9所示。
结果表明：
使用RHBDD1抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人胰腺癌，乳腺癌和胃癌的组织样本中，都能发现RHBDD1基因编码蛋白的高表达。图中深灰色代表表达阳性。
发明人对实验结果分析后发现，认为可通过检测组织细胞RHBDD1基因的表达来辅助诊断癌症。