治疗肿瘤形成的免疫原性组合物及方法.pdf

本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包括表达与至少一种TLR促效剂配伍的细胞因子(GM-CSF)的赘生性细胞，以及使用所述组合物诱发或提升免疫响应的方法。

权利要求书一种免疫原性组合物，包括一种或多种经基因改造的增殖机能不全的赘生性细胞，所述经基因改造的增殖机能不全的赘生性细胞表达重组免疫激活细胞因子，且包括至少一种Toll样受体(TLR)促效剂。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细胞包括相当量的至少一种TLR促效剂与GM‑CSF。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述TLR促效剂是TLR4促效剂、TLR5促效剂、TLR6促效剂、TLR7促效剂、TLR8促效剂或TLR9促效剂。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括TLR4促效剂及TLR7/8促效剂。
如权利要求5所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述TLR4促效剂是LPS、LPS片段或合成的吡喃葡萄糖基脂质A类似物，且所述TLR7/8促效剂是R848。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，通过辐射使所述细胞增殖机能不全。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述赘生性细胞选自下列所组成的组：白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、鼻咽癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括每1x105细胞至少约1ng TLR4促效剂至每1x105细胞10ng TLR4促效剂。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括每5x105细胞至少约3至5ng。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细胞包括与脂质体或其它脂质载体联合的TLR促效剂。
如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细胞包括LPS/脂质胶束体。
如权利要求1所述的免疫原性组合物，进一步包括表达一种或多种肿瘤抗原的细胞。
如权利要求1至13任何一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细胞是自体细胞或同种异基因细胞。
一种改善对象体内肿瘤形成情况的疫苗，所述疫苗在药学上可接受的赋形剂中，包括有效量的增殖机能不全的赘生性细胞，所述增殖机能不全的赘生性细胞表达重组免疫激活细胞因子，并包括有效量的外源性Toll样受体(TLR)促效剂。
如权利要求15所述的疫苗，其特征在于，所述细胞经过基因改造以表达GM‑CSF。
如权利要求15所述的疫苗，其特征在于，所述组合物包括TLR4促效剂及TLR7/8促效剂。
如权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述TLR4促效剂是LPS、LPS片段或合成的吡喃葡萄糖基脂质A类似物，且TLR7/8促效剂是R848。
如权利要求15所述的疫苗，其特征在于，所述细胞包括LPS/脂质胶束体。
如权利要求12所述的疫苗，进一步包括表达一种或多种肿瘤抗原的细胞。
如权利要求12至20任何一项所述的疫苗，其特征在于，所述细胞是自体细胞或同种异基因细胞。
一种在具有肿瘤形成或具有肿瘤形成发展潜力的对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应的方法，所述方法包括向对象给药有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括一种或多种增殖机能不全的赘生性细胞，所述增殖机能不全的赘生性细胞表达重组免疫激活细胞因子，且所述免疫原性组合物包括包括外源性Toll样受体(TLR)促效剂，所述外源性Toll样受体(TLR)促效剂的量足以在所述对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应。
一种在具有肿瘤形成或具有肿瘤形成发展潜力的对象体内治疗或预防肿瘤进展的方法，所述方法包括向对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，所述量足以在所述对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应，从而治疗所述对象。
一种在具有肿瘤形成的对象体内治疗或预防肿瘤进展或转移的方法，所述方法包括向对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，从而治疗或预防所述对象体内的肿瘤进展或转移。
一种在对象体内治疗已建立的肿瘤或预防肿瘤形成的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，从而在对象体内治疗已建立的肿瘤或预防肿瘤形成。
一种在对象体内治疗微转移或病变残存的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，从而治疗所述对象体内的微转移或病变残存。
一种免疫化对象的方法，所述方法包括向所述对象给药如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗。
如权利要求14至27任何一项所述的方法，其特征在于，所述赘生性细胞来源于癌细胞系或来源于肿瘤。
如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述癌细胞系或肿瘤选自下列所组成的组：白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、鼻咽癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌。
如权利要求14至16任何一项所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过全身给药或口服给药。
如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过肌肉注射、静脉注射、瘤内注射或瘤周注射给药。
如权利要求8或9所述的方法，进一步包括向所述对象给药有效量的一种或多种化疗剂。
如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一种或多种化疗剂选自下列所组成的组：乙酸阿比特龙、六甲蜜胺、脱水长春碱、奥里斯汀、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BMS 184476、2,3,4,5,6‑五氟‑N‑(3‑氟‑4‑甲氧基苯基)苯磺酰胺、争光霉素、N,N‑二甲基‑L‑缬氨酰‑L‑缬氨酰‑N‑甲基‑L‑缬氨酰‑L‑丙基‑1‑L‑脯氨酸‑叔丁酰胺、恶液质素、西马多丁、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、3’,4’‑双脱氧氢‑4’‑脱氧‑8’‑norvin‑caleukoblastine、多烯紫杉醇、多西他赛、环磷酰胺、卡铂、卡氮芥(BCNU)、顺铂、念珠藻素、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺(DTIC)、更生霉素、柔毛霉素、地西他宾、尾海兔素、多柔比星(阿霉素)、依托泊苷、5‑氟尿嘧啶、非那司提、氟他胺、羟基脲及羟基脲紫杉醇、异环磷酰胺、利阿唑、氯尼达明、环己亚硝脲(CCNU)、MDV3100、二氯甲基二乙胺(氮芥)、左旋苯丙氨酸氮芥、羟乙基磺酸米伏布尔、根霉素、sertenef、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇类、尼鲁米特、奥那司酮、紫杉酚、泼尼氮芥、甲苄肼、RPR109881、磷酸雌氮芥、三苯氧胺、他索纳明、紫杉醇、维甲酸、长春碱、长春新碱、硫酸硫酸长春地辛及长春氟宁。
如权利要求12至31任何一项所述的方法，其特征在于，相对于单独使用GVAX，所述方法提升树突细胞的活性和/或增加AHl特异性细胞毒性T细胞的数目或pl5E特异性细胞毒性T细胞的数目。
如权利要求12至31任何一项所述的方法，其特征在于，相对于单独使用GVAX，所述方法降低或稳定肿瘤细胞增殖、肿瘤生长或对象存活率。
一种包括编码GM‑CSF的表达载体的增殖机能不全的赘生性细胞，以及至少一种TLR促效剂。
如权利要求34所述的赘生性细胞，其特征在于，所述细胞衍生于白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、鼻咽癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌或其细胞系。
如权利要求34所述的赘生性细胞，其特征在于，所述细胞包括TLR4和TLR7/8促效剂。
如权利要求34所述的赘生性细胞，其特征在于，所述TLR促效剂与脂质载体联合。
一种用于治疗肿瘤形成的药物组合物，包括有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，以及药学可接受的赋形剂。
一种用于治疗肿瘤形成的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，以及在如权利要求22至33任何一项所述方法中使用所述试剂盒的说明书。
一种治疗或预防对象体内宫颈癌的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，从而治疗或预防所述对象体内的宫颈癌。
一种治疗对象体内多态性TLR缺乏的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的如权利要求1至21任何一项所述的免疫原性组合物或疫苗，从而治疗所述对象体内的多态性TLR缺乏。

说明书治疗肿瘤形成的免疫原性组合物及方法
【相关申请的交叉引用】
本申请主张在2010年4月27日提交的美国临时申请案US61/328,471的优先权，该临时申请案的整体内容通过引用并入本文。
【联邦政府资助的研究下取得发明权的声明】
本工作由来自国家卫生院的资助支持，资助号为NIHK23‑DE018464‑02。政府享有本发明的部分权利。
背景技术
设计为分泌GM‑CSF且经致命辐射的肿瘤细胞疫苗(GVAX)，在各种黑色素瘤、肾细胞癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌以及头颈鳞状细胞癌的模型中显示有希望的的疗效，但由于多个免疫学检验点封锁(immunological checkpoint blockade)，GVAX作为单一治疗剂对于重症患者的临床疗效似乎不佳。最近发现，对于重症抗激素性前列腺癌的第III期测试，GVAX具有不确定的功效。过去的免疫治疗方案往往设计为主要刺激肿瘤特异性宿主免疫响应，而无法克服肿瘤造成免疫逃避(immune evasion)的关键机制，已经成为该方案的主要限制。众多用于递减抗肿瘤免疫响应的定义机制中，已经假定T调节细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞及耐受性树突细胞(tolerizing dendriticcells,DCs)为能阻止成功的免疫治疗的负调节剂。某些这种免疫逃避检验点途径的一个下游后果为免疫系统输入臂中活化的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)数目受限。需要能克服肿瘤细胞造成的免疫逃避关键机制的改良肿瘤细胞疫苗。
发明内容
如下所述，本发明的通常特征在于免疫原性组合物，包括表达与至少一种TLR促效剂配伍的细胞因子(GM‑CSF)的赘生性细胞，以及使用该组合物诱发或提升免疫响应的方法。
一方面，本发明的通常特征在于，一种免疫原性组合物，含有一种或多种表达重组免疫激活细胞因子之增殖机能不全的基因改造赘生性细胞，以及至少一种Toll样受体(TLR)促效剂。
另一方面，本发明的通常特征在于，一种改善对象体内肿瘤形成的疫苗，该疫苗含有在药学可接受的赋形剂中有效量的表达重组免疫激活细胞因子之增殖机能不全的赘生性细胞，和有效量的外源性Toll样受体(TLR)促效剂。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种在具有肿瘤形成或具有肿瘤形成发展潜力的对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应的方法，该方法涉及向对象给药有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种或多种表达重组免疫激活细胞因子之增殖机能不全的赘生性细胞，且包括其量足以在所述对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应的外源性Toll样受体(TLR)促效剂。
再一方面，本发明的通常特征在于一种包括编码GM‑CSF的表达载体之增殖机能不全的赘生性细胞，包括，以及至少一种TLR促效剂。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种在具有肿瘤形成或具有肿瘤形成发展潜力的对象体内治疗或预防肿瘤形成的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的免疫原性组合物或疫苗，其量足以在所述对象体内诱发赘生性细胞抗原特异性免疫响应，从而治疗该对象。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种在具有肿瘤形成的对象体内治疗或预防肿瘤进展或转移的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，从而治疗或预防该对象体内的肿瘤进展或转移。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种治疗对象体内已建立的肿瘤或预防对象体内肿瘤形成的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，从而治疗该对象体内已建立的肿瘤或预防对象体内的肿瘤形成。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种在具有微转移或病变残存的对象体内治疗微转移或病变残存的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，从而治疗该对象体内的微转移或病变残存。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种免疫化对象的方法，该方法包括向对象给药本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种用于治疗肿瘤形成的药物组合物，包括有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，以及药学可接受的赋形剂。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种用于治疗肿瘤形成的试剂盒，该试剂盒包括有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，和以本文所揭示的任何方法使用该试剂盒的说明书。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种治疗或预防对象体内宫颈癌的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，从而治疗或预防该对象体内的宫颈癌。
又一方面，本发明的通常特征在于，一种治疗对象体内多态性TLR缺乏的方法，该方法包括向对象给药有效量的本文所揭示的任何免疫原性组合物或疫苗，从而治疗该对象体内的多态性TLR缺乏。
上述任一方面或本文中叙述的本发明其它任一方面的多个具体实施例中，该细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)。另一具体实施例中，该细胞含有相当量的至少一种TLR促效剂与GM‑CSF。再一具体实施例中，该TLR促效剂是TLR4促效剂、TLR5促效剂、TLR6促效剂、TLR7或TLR8促效剂、TLR9促效剂。又一具体实施例中，该免疫原性组合物含有TLR4促效剂和TLR7/8促效剂。又一具体实施例中，该TLR4促效剂是LPS、LPS片段或合成性吡喃葡萄糖基脂质A类似物，该TLR7/8促效剂是R848。其它具体实施例中，通过辐射使得该细胞增殖机能不全。某些具体实施例中，该赘生性细胞选自下列所组成的组：白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、鼻咽癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌。其它具体实施例中，该组合物包括每1x105细胞至少约1ng TLR4促效剂至每1x105细胞10ng TLR4促效剂。进一步的具体实施例中，该组合物含有每5x105细胞至少约3至5ng。另一具体实施例中，该细胞含有与脂质体或其它脂质载体相结合的TLR促效剂。进一步的具体实施例中，该细胞含有LPS/脂质胶束体。其它具体实施例中，该免疫原性组合物含有表达一种或多种肿瘤抗原的细胞。进一步的具体实施例中，该免疫原性组合物含有自体细胞或同种异基因细胞。
上述任一方面或本文中叙述的本发明其它任一方面的多个具体实施例中，该赘生性细胞来源于癌细胞系或来源于肿瘤。又一具体实施例中，该癌细胞系或肿瘤选自白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、鼻咽癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌。又一具体实施例中，该免疫原性组合物通过全身给药或口服给药。进一步的具体实施例中，该免疫原性组合物通过肌肉注射、静脉注射、瘤内注射或瘤周注射给药。另外的具体实施例中，该方法包括向对象给药有效量的一种或多种化疗剂。某些具体实施例中，该一种或多种化疗剂选自乙酸阿比特龙、六甲蜜胺、脱水长春碱、奥里斯汀(auristatin)、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BMS 184476、2,3,4,5,6‑五氟‑N‑(3‑氟‑4‑甲氧基苯基)苯磺酰胺、争光霉素、N,N‑二甲基‑L‑缬氨酰‑L‑缬氨酰‑N‑甲基‑L‑缬氨酰‑L‑proly‑1‑L脯氨酸‑叔丁酰胺、恶液质素、西马多丁、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、3’,4’‑双脱氧氢‑4’‑脱氧‑8’‑norvin‑caleukoblastine(3',4'‑didehydro‑4'‑deoxy‑8'‑norvin‑caleukoblastine)、多烯紫杉醇(docetaxol)、多西他赛(doxetaxel)、环磷酰胺、卡铂、卡氯芥(BCNU)、顺铂、念珠藻素、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺(DTIC)、更生霉素、柔毛霉素、地西他宾、尾海兔素、多柔比星(阿霉素)、依托泊苷、5‑氟尿嘧啶、非那司提、氟他胺、羟基脲及羟基脲紫杉醇、异环磷酰胺、利阿唑、氯尼达明、环己亚硝脲(CCNU)、MDV3100、二氯甲基二乙胺(氮芥)、左旋苯丙氨酸氮芥、羟乙基磺酸米伏布尔(mivobulin isethionate)、根霉素、sertenef、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇类、尼鲁米特、奥那司酮、紫杉酚、泼尼氮芥、甲苄肼、RPR109881、磷酸雌氮芥、三苯氧胺、他索纳明、紫杉醇、维甲酸、长春碱、长春新碱、硫酸硫酸长春地辛及长春氟宁。另外的具体实施例中，相对于单独使用GVAX，该方法提升树突细胞的活化和/或增加AHl特异性细胞毒性T细胞或pl5E特异性细胞毒性T细胞的数目。某些具体实施例中，相对于单独使用GVAX，该方法降低或稳定化肿瘤细胞增殖、肿瘤生长或对象存活率。进一步的具体实施例中，该细胞来源于白血病、慢性骨髓性白血病、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、舌癌、喉癌、扁桃体癌、下咽癌、nasaipharynx癌、乳癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤及脑癌或其细胞系。另外的具体实施例中，该细胞包括TLR4促效剂及TLR7/8促效剂。其它具体实施例中，该TLR促效剂与脂质载体相结合。
定义
“细胞因子”意指局部作用并调理个体免疫响应的激素。
“基因改造赘生性细胞”意指经过基因改造以表达转基因的细胞或细胞群落，并给药予患者作为癌症治疗的一部分。本发明的免疫原性组合物或疫苗包括赘生性(如，肿瘤)细胞，该细胞是进行治疗的患者的“自体”或“同种异基因”细胞，或与取自该患者的肿瘤细胞混合的“无关细胞”。通常，该经过基因改造的赘生性细胞与正在折磨该患者的肿瘤细胞一般型相同。例如，患有黑色素瘤的患者典型将给药来源于黑色素瘤的基因改造细胞。本文中，表达GM‑CSF的基因改造肿瘤细胞疫苗可指为“GVAX”。美国专利第US 5,637,483、US5,904,920、US 6,277,368、US 6,350,445号，以及美国专利公开第US 20100150946号揭示了经过基因改造以表达细胞因子如GM‑CSF，之后再次向患者给药以治疗癌症的自体及同种异基因癌细胞，上述每篇专利均通过引用而清楚地并入本文。美国专利第US 6,033,674和US5,985,290号中揭示了用于治疗胰腺癌的表达GM‑CSF的基因改造癌细胞或“表达细胞因子的细胞疫苗”形式，上述两篇专利均通过引用而清楚地并入本文。美国专利US 6,464,973揭示了表达普遍免疫调节细胞因子的无关细胞系，该专利通过引用而清楚地并入本文。
“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)多肽”意指，具有免疫调节活性并具有至少约85%氨基酸序列被鉴定为基因登录号(GenBankAccession No.)AAA52122.1的细胞因子或其片段。
例示性GM‑CSF序列(NCBI AAA52122.1)提供如下：
1 mwlqsllllg tvacsisapa rspspstqpw ehvnaiqear rllnlsrdta aemnetvevi
61semfdlqept clqtrlelyk qglrgsltkl kgpltmmash ykqhcpptpe tscatqiitf
121 esfkenlkdfl lvipfdcwe pvqe
已经显示，GM‑CSF诱发粒细胞与巨噬细胞谱系的造血细胞的生长。此外，它也活化树突细胞抗原处理及呈递功能，该树突细胞是免疫系统中主要的抗原呈递细胞(APC)。一具体实施例中，免疫原性组合物包括GM‑CSF编码序列，该序列有效地链结至用以在该疫苗的细胞中进行表达的调控序列，。
“GM‑CSF核酸分子”意指，编码GM‑CSF多肽的多核苷酸。
GM‑CSF核酸分子可编码鼠科动物或人类的GM‑CSF，并且可以为基因组DNA形式(见美国专利公开第US 2006/0057127号，该专利通过引用以其整体并入本文)或cDNA形式(见美国专利公开第US2006/0057127号，该专利通过引用以其整体并入本文)。一具体实施例中，该GM‑CSF编码序列将美国专利公开第US 2006/0057127号中揭示的氨基酸序列编码，该专利通过引用以其整体并入本文。GM‑CSF编码序列的其它实例可在基因库登录号AF373868、AC034228、AC034216、M10663及NM000758中找到。
例示性GM‑CSF编码序列(AF373868)提供如下：
  1gcagtctgtt tcctaccaga ctgggagcct caagggccaa atgtgagggc cagtgggagg
 61gtcccgttta cctccccaga acaggtcctg gtgtggattg gaaagacttg ttgactgact
121gtctgagcta tgacaactca tttctaggag gaaagtgacc ttctctccca gatgggtcat
181acaggctctc tgcctccctg gccatcagct gaaccactat ctatggctcc cttccctgcc
241ctccagcctc cagggtgcta tccaacacat gtgatatcta catgtagtat ccatgtcctc
301atctctcccc cgagagctcc ctggaaagag ctgagccaag gccttgcaaa aaaggtggag
361aaagggccag ggcctggaca tttcatgttc ccaccccagc ctggccacta ggagtgttct
421acgcaggctc agatggatgg ggctggcctc acagtggggt ctggaggact aaggtttggt
481ttctctatgc aaggtcagaa aaactcccac agtacaggga aactggccag ggctgcagac
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721gcctggagcc tttcataaag caggtaagag gactcaatag atgcatctgc atggaaaaca
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“Toll样受体促效剂”意指活化TLR受体家族成员的试剂。
“吡喃葡萄糖基脂质A”或“吡喃葡萄糖基脂质A”或“吡葡糖基脂质佐剂”或“GLA”意指，美国专利公开第US 11/862,122和US20080131466号中揭示的新颖的、临床阶段、人类Toll样受体‑4(TLR‑4)促效剂，上述专利以其整体并入本文。
“IDC‑1005”意指，在含有卵磷脂的稳定的水包角鲨烯油乳液的存在下，1mg/ml GLA与0.2mg/ml R848的混合物。
“脂质载体”意指，能用于通过脂质体的形成而将试剂传输至细胞的任何组合物，其非限制性实例是脂质体。
“R848”意指分子量为314.17的咪唑喹啉化合物，该化合物是通过TLR7/TLR8MyD 88依赖的信道经而活化免疫细胞的TLR促效剂。R848具有下述分子式：C17H22N4O2；结构如下：

“TEGVAX”意指GVAX进一步与TLR促效剂配伍。
“Toll样受体(TLR)”意指，感知微生物产物及/或引发适应性免疫响应的Toll样受体家族蛋白质成员或其片段。一具体实施例中，TLR活化树突细胞(DC)。
“Toll样受体4(TLR4)”意指，具有至少85%序列鉴定为NP_612564的多肽或其具有免疫调节活性的片段。人类的Toll样受体4前体NP_612564提供如下：
  1mmsasrlagt lipamaflsc vrpeswepcv e vpnityqc melnfykipd nlpfstknld
 61lsfnplrhlg sysffsfpel qvldlsrcei qtiedgayqs lshlstlilt gnpiqslalg
121afsglsslqk lvavetnlas lenfpighlk tlkelnvahn liqsfklpey fsnltnlehl
181dlssnkiqsi yctdlrvlhq mpllnlsldl slnpmnfiqp gafkeirlhk ltlrnnfdsl
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301idlfncltnv ssfslvsvti ervkdfsynf gwqhlelvnc kfgqfptlkl kslkrltfts
361nkggnafsev dlpslefldl srnglsfkgc csqsdfgtts lkyldlsfng vitmssnflg
421leqlehldfq hsnlkqmsef svflslrnli yldishthtr vafngifngl sslevlkmag
481nsfqenflpd iftelrnltf ldlsqcqleq lsptafnsls slqvlnmshn nffsldtfpy
541kclnslqvld yslnhimtsk kqelqhfpss laflnltqnd factcehqsf lqwikdqrql
601lvevermeca tpsdkqgmpv lslnitcqmn ktiigvsvls vlvvs vavl vykfyfhlml
661lagcikygrg eniydafviy ssqdedwvrn elvknleegv ppfqlclhyr dfipgvaiaa
721niihegfhks rkvi vvsqh fiqsrwcife yeiaqtwqfl ssragiifiv lqkvektllr
781qqvelyrlls rntyleweds vlgrhifwrr lrkalldgks wnpegtvgtg cnwqeatsi
“缓解”意指减轻、压制、削弱、减少、阻止或稳定化疾病的发展或进展。
“类似物”意指，不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保持相应天然出现的多肽的生物活性，同时具有某些相对于天然出现的多肽提升该类似物功能的生化改造。这些生化改造可增加该类似物的蛋白酶抗性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。
本公开中，“包括(comprises)”、“包括(comprising)”“含有(containing)”及“具有(having)”等可具有美国专利法中规定的意义，可意指“包含(includes)”、“包含(including)”等；“主要由……组成”或“主要包含”等具有美国专利法中规定的意义，该术语是开放性的，允许存在所列举者之外的要素，只要超过所列举者之外的要素的存在不改变所列举者的主要特征或新特征即可，但不包括现有技术的具体实施例。
“疾病”意指损伤或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何状况或不适。
“有效量”意指，足以诱发或提升对抗赘生性细胞或肿瘤抗原特异性的免疫响应，以相对于未经治疗的患者，以降低或稳定化肿瘤生长、提升对象存活率或缓解疾病的症候。用以实践用于治愈性治疗疾病的本发明的活性化合物的有效量可依据给药方式以及对象的年龄、体重及健康状况而改变。最后，主治医师或兽医将决定适当的量和给药方案。该量指为“有效”量。
“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。这部分优选含有所参考核酸分子或多肽整体长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000核苷酸或氨基酸。一具体实施例中，TLR4促效剂的片段包括LPS或另一足以提升对象体内免疫响应的TLR4促效剂的至少约10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600或700氨基酸。
“杂交”意指互补的核酸碱基之间的氢键合，可以是双螺旋(Watson‑Crick)、胡斯坦碱基配对(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合(reversed Hoogsteen hydrogen bonding)。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配合成对的互补核酸碱基，。
“分离的”意指，材料不同程度地自其原生状态中发现的正常伴生成分游离出来。“分离”表示自原始来源或周围物质分离的程度。
“分离的多核苷酸”意指，不含基因的核酸(如，DNA)，而在作为本发明核酸分子来源的有机体的天然出现的基因组中，该核酸侧面伴生基因。该术语因而包括，例如，并入载体、并入自主复制质粒或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA、或作为独立于其它序列的独立分子(例如，通过PCR或酶切(restriction endonucleasedigestion)生成的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。此外，该术语包括转录自DNA分子的RNA分子、以及作为编码另外多肽序列的杂合基因一部分的重组DNA。
“分离的多肽”意指，已经自其天然伴生物分离的本发明的多肽。典型地，当多肽的至少60重量%自其天然伴生的蛋白质及天然有机分子分离时，该多肽即为分离的。该制剂优选为至少75重量%，更优选至少90重量%，最优选至少99重量%的本发明的多肽。本发明的孤立多肽可通过例如自天然来源提取、表达编码此多肽的重组核酸、或化学合成该蛋白质而获得。可通过任何适当的方法如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测量纯度。
“微转移”意指二期肿瘤太小而无法临床检测的转移形式。
“小量病变残存”意指，在治疗过程中或治疗之后，患者体内残留少量的肿瘤细胞。
“肿瘤形成”意指，以细胞或组织的病理性增殖及其后续迁移或侵入其它组织或器官为特征的疾病。肿瘤形成生长典型是非受控性及进展性的，且在不激发、或将造成正常细胞增殖中断的情况下出现。肿瘤形成可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于，选自下列所组成的组的器官：膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、食道、输卵管、胆囊、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨胳肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫及阴道，或其组织或细胞类型。肿瘤形成包括癌症如肉瘤、癌变或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
侵入周围组织或进入血流或淋巴管的肿瘤形成细胞形成距原始肿瘤一定距离的二期肿瘤或转移。已经转移的肿瘤形成更难治疗，且一般具有更差的预后。依据肿瘤形成的严重性(即，肿瘤大小及侵入力)，定为四个阶段，即I期、II期、III期或IV期。肿瘤形成I期是严重性最低的，且具有最好的预后。肿瘤形成II期典型包括更大的肿瘤，且多少伴随更差的预后。I肿瘤形成II期及IV期已经自其原始位点铺展开来，且具有最差的预后。
如文中所用，“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或其它撷取该试剂的途径。
如文中所用，“重组”包括参考使用表达编码该多肽的异种多核苷酸的细胞生产的多肽。由于该细胞已经通过引入合适的孤立核酸序列而进行转基因，该细胞生产该重组多肽。该术语也包括参考细胞、或核酸、或载体，该细胞或核酸或载体已经通过引入异种核酸或将原生核酸突变为对于该细胞为非原生的形式而改造，或该细胞来源于经如此改造的细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的原生(非重组)形式中没有的基因，表达在原生形式中找到的基因的突变型，或表达并非正常表达、可表达或根本不表达的原生基因。
“降低”意指反向改变至少10%、25%、50%、75%或100%。
“参考”意指标准或控制条件。
“参考序列”是用作序列比较的基准的已定义序列。
参考序列可以是具体序列的子集或整体；例如，全长度cDNA或基因序列的碎片或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，该参考多肽序列的长度通常为至少约16氨基酸，优选至少约20氨基酸，更优选至少约25氨基酸，甚至更优选约35氨基酸，约50氨基酸或约100氨基酸。对于核酸，该参考核酸序列的长度通常为至少约50核苷酸，优选至少约60核苷酸，更优选至少约75核苷酸，甚至更优选约100核苷酸或约300核苷酸，或与之接近或其间的任何整数。
“特异性结合”意指，化合物或抗体识别并结合本发明的多肽，但该化合物或抗体基本不识别并结合样本如天然地包括本发明多肽的生物样本中的其它分子。
可用于本发明方法的核酸分子可包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。该核酸分子不需要与内源性核酸序列100%相同，但典型将展现基本相同性。具有与内源性序列“基本相同性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂合。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。该核酸分子不需要与内源性核酸序列100%相同，但典型将展现基本相同性。具有与内源性序列“基本相同性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂合。“杂合”意指互补多核苷酸序列(如，本文揭示的基因)或其部分在各种严格条件下配对，以形成双链分子(见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)，Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
“基本相同”意指，多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文所揭示的任何一个氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所揭示的任何一个核酸序列)至少50%相同。与用作比较的序列的该氨基酸水平或核酸相比，该序列优选至少60%，更优选80%或85%，更优选90%、95%甚或99%相同。
典型使用序列分析软件(例如，GCG软件包(Sequence AnalysisSoftware Package of the Genetics Computer Group,University ofWisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wi s.53705)的BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列相同性。该软件通过指定各种置换、删除、及/或其它改造的同源性程度来匹配相同或相似序列。保存性置换典型包括下列各组中的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。一个确定相同性程度的例示性途径中，可使用BLAST程序，e‑3与e‑100之间的评分表明紧密相关的序列。
“对象”意指哺乳动物，包括但不限于，人类或非人类哺乳动物，如牛科动物、马科动物、犬科动物、羊或猫科动物。
如文中所用，“肿瘤”指代所用的赘生性细胞生长及增殖，无论其为恶性或良性，以及所有的癌前及成癌细胞及组织。
本文中提供的范围理解为该范围内所有数值的缩略。例如，范围1至50理解为包括任何数字、数字组合或来自下列所组成的组的子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如文中所用，术语“治疗”等指代降低或缓解不适及/或与其相关的症候。应明确，尽管未排除，治疗不适或状况并不需要完全消除该不适、状况或与之相关的症候。
除非具体指明或自语境明显可知，如文中所用，术语“或”理解为包括在内。除非具体指明或自语境明显可知，如文中所用，术语“一”或“该”理解为单数或复数。
除非具体指明或自语境明显可知，如文中所用，术语“约”理解为处于该技术的正常公差范围内，例如，处于该均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所标明数值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非可自语境中明确获知，本文所提供的数值全部以术语“约”修饰。
本文中任何变量定义中所列化学基团的详述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。用于本文中变量或方面的具体实施例的详述包括作为任何单一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分组合的具体实施例。
本文所提供的任何组合物或方法可与一种或多种本文所提供的其它组合物及方法并用。
附图说明
图1显示TLR4促效剂传输入GVAX。图1是一套显示TLR4促效剂传输入GVAX的FACS图。为了优化LPS进入GVAX疫苗细胞的吸收效率，脂质体与LPS‑BODIPY荧光团共轭物的浓度如所标示者改变。在进行流式细胞计分析之前，洗涤细胞5次。最终洗液中，LPS低于0.125EU/ml，无法使用LAL分析检出。最优吸收出现在使用40μg/ml脂质体及每lxl05细胞25μg/ml LPS培养6hr后。这些条件用于以每一细胞为基础定量LPS。
图2A、图2B及图2C显示，TEGVAX可诱发活体内的抗肿瘤响应。典型在肿瘤注射之后3至5天，使用适当的PBS、GVAX或TEGVAX对接种B16的C57BL/6(图2A)、接种SCCFVII/SF的C3H(图2B)、以及接种CT26的Balb/c(图2C)小鼠进行癌周治疗。据统计，所研究的全部鼠科动物模型中，TEGVAX组体内肿瘤的进展慢于GVAX组。对于B16及SCCFVII/SF模型，GVAX治疗组与PBS治疗组之间并无差异。CT26模型中，40至60%的TEGVAX组小鼠在第18天经历了肿瘤自明显可见至无法检出水平的退化。将等摩尔LPS配伍入293T细胞中也显示与对照治疗组小鼠相比无差异的生长速率。显示肿瘤退化的小鼠再植入CT26肿瘤(2xl06)，无肿瘤的生长。全部三组鼠科动物模型中，TEGVAX组小鼠的肿瘤生长速率比GVAX组小鼠的肿瘤生长速率降低，与之相对应，前者的存活率得以提升。
图3显示，所记录的TEGVAX组小鼠的体内抗肿瘤响应是MyD88依赖的。使用该B16模型，在接种肿瘤后，对MyD88无效的小鼠进行瘤内疫苗治疗3至5天，进行体内肿瘤生长速率。在MyD88无效的小鼠中没有TEGVAX治疗组中的抗肿瘤响应。
图4A及4B显示，该TEGVAX治疗增加了淋巴细胞和抗原呈递细胞向该肿瘤微环境中的渗透。图4A是一套对以对照、GVAX或TEGVAX处理的CT26肿瘤中的CD4+、CD8+、CD86+及CD45+细胞进行免疫组化染色的显微照片。黄色细胞表示最开始的两块分区中，CD4或CD8与CD45的局部共同染色。第三块分区表示仅CD86共轭物染色。每张切片随机选择10个区域在40X放大下对这些细胞进行形式上地定量。图4B是通过免疫组化获得的定量数据的图解表示。在以GVAX或TEGVAX处理的肿瘤中，两组CD4、CD8、CD86及CD45细胞的每种均具有统计学差异(P<0.01)。
图5显示，TEGVAX处理增加了引流淋巴结(DLN)中的活化树突细胞(DC)。在注射肿瘤3天后，以PBS(未显示)、GVAX或TEGVAX对荷CT26肿瘤的Balb/c小鼠进行癌周治疗。在处理5至7天后，自该DLN分离DC。如图所示，对B220+CD11c+细胞进行门控，并分析CD86、MHCCII及CD80染色。与GVAX处理组相比，TEGVAX增加了DLN中CD86+MHCII+以及CD80+MHCII+DC的数目。
图6A及图6B显示，TEGVAX处理增加了肿瘤特异性CD8+T细胞的数目。以PBS、GVAX或TEGVAX对荷CT26的Balb/c小鼠进行癌周治疗3天，5天后，自脾及淋巴结中分离CD8+细胞并纯化。使用4T1细胞作为APC及AHl肽执行ELISPOT试验，并测量IFN量。图6A是显示在脾及引流LN中，TEGVAX组中生成AHl特异性IFN的T细胞的统计学数量大于GVAX组(P<0.01)的图示。图6B是AHl特异性CTL致死的图示。使用体内CTL试验来测量使用或不使用TEGVAX处理荷CT26肿瘤的小鼠体内AHl特异性CTL的致死百分率。将以‑gal CFSE标记的低细胞或以AHl CFSE标记的高细胞同时注入原生组、荷瘤组或以TEGVAX处理的荷瘤组中。TEGVAX组的平均中值特异性肿瘤溶解高于未治疗组(P<0.07)。
图7显示，不经配伍而独立注射GVAX与等摩尔LPS并不诱发抗肿瘤响应。以GVAX、LPS或不经脂质体配伍的LPS与GVAX的混合物对荷B16的小鼠进行癌周处理。这些实验中，将与图2中所用等摩尔量的LPS进行癌周注射。
图8显示，TEGVAX也能诱发全身性抗肿瘤响应。使用该B16肿瘤模型，以TEGVAX对小鼠进行癌周处理，或将TEGVAX自肿瘤接种位点注射入侧肢。两组TEGVAX组显示相似的体内肿瘤生长速率。
图9是显示以GVAX、R848及GLA组合预防黑色素瘤肿瘤细胞生长的图示。在接种B16肿瘤3天后，注射GVAX及其与各种TLR促效剂配伍的配方。在疫苗治疗的时间内，肿瘤并不明显。跟踪每组的肿瘤相对生长速率。对于以GVAX、GLA及R848治疗的B16肿瘤，最初记录的肿瘤生长弱于其它组，这些小鼠的一部分小鼠体内的这些肿瘤退化。
图10是显示经TLR促效剂增强的GVAX降低了已建立的B16肿瘤的肿瘤生长速率的图示。将B16肿瘤细胞注入脚垫中，一旦该肿瘤变得明显，即以该图中标注的疫苗配方治疗该小鼠。该疫苗注射入侧肢中。
图11提供若干显示ELISPOT试验及体内CTL试验结果的图，显示，以GVAX/GLA/R848治疗的小鼠具有最大数目的pl5E特异性T细胞，且这一结果与体内肿瘤生长速率相关。在以该疫苗配方处理1至2周后宰杀被处理的小鼠，并分析其脾中的肿瘤特异性T细胞。
图12提供两张图，显示以GVAX/GLA/R848处理的小鼠具有显着提升的活化树突细胞。
图13提供FACS分析，显示以GVAX/GLA/R848处理的小鼠具有统计上显着数量的表达I1‑12的CDllc+细胞。
图14是显示各种GVAX/GLA/R848配方对已建立的B16肿瘤的效果的图。IDC‑1005是在载剂的存在下的GLA/R848，该载剂包括稳定的含有卵磷脂的水包角鲨烯油乳液。
具体实施方式
本发明提供包括赘生性细胞的免疫原性组合物，该赘生性细胞表达与至少一种TLR促效剂配伍的细胞因子(GM‑CSF)，以及使用该组合物诱发或提升免疫响应的方法。
本发明至少部分地基于下述发现：将TLR促效剂加入以肿瘤细胞为基础的疫苗中，通过克服该肿瘤组织中存在的宿主免疫响应逃避机制而增加该疫苗的效能。特别地，如下文详述的，产生了同源的GM‑CSF所分泌的完整细胞肿瘤疫苗(GVAX)与TLR4促效剂(用于TLR增强GVAX的TEGVAX)。在三种不同的治疗鼠科动物模型中测试该疫苗的效能，该模型包括极差免疫原性B16鼠科动物黑色素瘤模型。使用免疫组化、流式细胞术分析、ELISPOT及体内CTL分析来评估对抗该肿瘤组织的先天性免疫响应及适应性免疫响应。与单独使用GVAX相比，TEGVAX的瘤内及全身给药导致了体内抗肿瘤响应增加。在TLR信号受损的MyD88‑/‑小鼠中不存在TEGVAX的改良的抗肿瘤效能。在Balb/c小鼠的CT26鼠科动物模型中，40至60%的小鼠显示所移植的肿瘤退化。当再次注入CT26肿瘤细胞时，这些小鼠证明已经对该肿瘤免疫。以TEGVAX处理的肿瘤显示，CD4及CD8T细胞的渗透性增加，且该肿瘤组织中CD86+细胞的数量增加。与GVAX处理组及伪处理组相比，来自以TEGVAX处理的小鼠的引流淋巴结具有的活化CD86+MHCII+剂CD80+MHCII+树突细胞数增加。ELISPOT试验以及体内CTL试验显示，以TEGVAX处理的小鼠体内，AH1肿瘤抗原特异性的CTL数量增加。以细胞为基础的疫苗可与TLR促效剂配伍，改善体内抗肿瘤响应。
TLR促效剂提升抗肿瘤免疫响应
使用肿瘤细胞疫苗作为客观肿瘤抗原的来源，已经在多例临床实践中显示为安全。然而，这一途径的临床效能受限于活化抗原呈递细胞的适度上调，而该抗原呈递细胞能使得T细胞响应偏向抗肿瘤细胞毒性响应。在感染的情境中已经显示，TLR促效剂使得树突细胞活化成为免疫原性的，反之，TLR4信号的缺乏可能导致耐受性(14)。布兰德(Blander)和麦哲托夫(Medzhitov)发现，在LPS的存在下，被吞噬的微生物抗原可能更有效地呈递(17)。没有含抗原的吞噬溶酶体中的TLR4信号，II类肽‑MHC络合物在DC上的细胞表面上的呈递效率低下。这些发现表明，当作为组合疫苗的一部分而给出时，局部的TLR4刺激可提升抗肿瘤响应。
由于TLR4的生理学配体是LPS，它是响应脓毒症的大分子，因此使用任何TLR促效剂所考虑的一个要素是其毒性。LPS的TLR4促效剂活性已经孤立于LPS的脂质A成分，且各种形式的非毒性脂质A形式已经引入癌症患者体内(18)。其它人已经将超过致热剂量(suprapyrogenic dose)的LPS经皮肤向癌症患者给药，无任何证据表明脓毒症及过敏反应的出现(19)。另一考量因素是在肿瘤细胞上表达的TLR4受体可促进致癌(20)。
包括表达免疫调节细胞因子GM‑CSF的经过基因改造的肿瘤细胞的该GVAX疫苗，目前正在进行黑色素瘤、乳癌、胰腺癌及结肠癌的临床试验。如本文所报导，仅限于局部地将TLR刺激与GVAX组合，能显着提升该GVAX疫苗的免疫原性。LPS及其它TLR促效剂已经配伍入GVAX细胞中，以最小化预致癌TLR4刺激并最小化全身性TLR4刺激，而且这种新颖的组合疫苗在若干鼠科动物模型中显示抗肿瘤效能。
据此，本发明提供包括TLR促效剂的疗法组合物，该促效剂含有以肿瘤形成细胞为基础的疫苗，以及使用该以细胞为基础的疫苗来预防、降低或消除赘生性细胞(如，乳癌和黑色素瘤细胞)侵入力或治疗肿瘤形成或期症候的方法。
一特别的具体实施例中，本发明提供一种自体癌细胞疫苗，由经过基因改造以分泌粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)的患者特异性癌细胞所组成，并进一步配制以包括Toll样受体促效剂。GM‑CSF调节各种具有某些刺激白血球生成特异性的定向造血干细胞的增殖和分化，且可反而诱发嗜中性白血球减少症。这种试剂也促进抗原呈递、上调抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并增加白介素‑2介导淋巴因子活化的杀伤细胞的功能，且可增多宿主的抗肿瘤免疫力。TLR促效剂起到佐剂的作用，并增加该疫苗的效能。以肿瘤细胞为基础的疫苗与TLR促效剂配伍，增加了活化的局部树突细胞的数量，以及增加肿瘤特异性CTL响应。对于安全性，在作成疫苗之前辐射照射细胞。
免疫原性组合物
包括癌疫苗的免疫原性组合物可用作治疗剂及预防药物，治疗特殊类型的癌。较佳地，通过生成针对表达在对象体内的肿瘤上的特异性肿瘤抗原的疫苗，这些疫苗可调整为治疗特定个体的癌。本发明的疫苗典型含有经灭活的肿瘤细胞或表达肿瘤抗原的细胞，该细胞已经过基因改造以表达GM‑CSF，该细胞进一步包括TLR4促效剂或其片段。将本发明的细胞引导为通过将该细胞与TLR4促效剂接触而摄取该TLR4促效剂，该TLR4促效剂与脂质体或其它脂质体载剂如油/水乳液亲油性分子、能溶解这些亲油性分子的非细胞毒性、被动吸收的任何物质组合。不想受缚于理论，该TLR促效剂或其生物活性片段在足以形成含TLR促效剂的胶束的情况下与脂质体接触。该表达GM‑CSF的肿瘤细胞非特异性地吸收该胶束，且该TLR促效剂配伍的细胞疫苗可用于刺激对象的免疫系统。其它具体实施例中，在载剂的存在下，TLR促效剂被吸收于细胞上。适宜载剂的一个非限制性实例是含有卵磷脂的稳定的水包角鲨烯油乳液(如，水包10重量%油乳液)。该免疫系统对这种刺激的响应是产生以该肿瘤形成为靶点的免疫响应细胞。特别的具体实施例中，希望本发明的癌疫苗以无法检出的肿瘤细胞如微转移或病变残存为靶点，从而预防该肿瘤形成的复发。与用于预防其它疾病出现的疫苗不同，癌疫苗典型是在对象被证实具有肿瘤形成之后给药。
使用如本文中揭示者生成的细胞组合物生产赘生性细胞疫苗。将该细胞处理为增殖机能不全，并注射入具有肿瘤初始细胞抗原刺激免疫响应的患者体内。预期该免疫系统以小群落癌细胞为靶点，该小群落细胞携带一种或多种显示在经致死辐射的细胞上的抗原。
重组多肽表达
本发明提供经过基因改造以表达重组GM‑CSF多肽的细胞。几乎可使用科学界已知的任何方法生产本发明的GM‑CSF多肽。典型地，通过就爱那个具有编码全部或部分GM‑CSF多肽的核酸分子或其片段的适宜宿主细胞(如，来源于肿瘤或赘生性细胞系的细胞)转移至适当表达载剂中而生产重组多肽。该核酸分子可在体外传输至来源于具有肿瘤形成或赘生性细胞系的对象的细胞。该核酸分子必须以其可摄取的形式传输至对象细胞，因此可生产治疗有效水平的GM‑CSF蛋白质或其片段。
尤其由于转导病毒(如，逆转录病毒、腺病毒、及腺病毒伴随病毒)载体的高传染效率及稳定的整合及表达，该载体可用于基因传输(见，例如，Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423‑430,1997；Kido et al.,Current Eye Research 15:833‑844,1996；Bloomer etal.,Journal of Virology 71:6641‑6649,1997；Naldini et al.,Science 272:263‑267,1996；and Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sc i.U.S.A.94:10319,1997)。例如，编码GM‑CSF蛋白质及其突变型或片段的多核苷酸可克隆入逆转录病毒载体中，且表达可自其内源性启动子驱除、自该逆转录病毒的长末端重复驱除、或自对于该兴趣的靶点细胞类型特异性的启动子驱除。其它可使用的病毒载体包括，例如，牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，如EB病毒(Epstein‑BarrVirus)(又见，例如，the vectors of Miller,Human Gene Therapy15‑14,1990；Friedman,Science 244:1275‑1281,1989；Eglitis etal.,BioTechniques 6:608‑614,1988；Tolstoshev et al.,CurrentOpinion in Biotechnology 1:55‑61,1990；Sharp,The Lancet337:1277‑1278,1991；Cornetta et al.,Nucleic Acid Research andMolecular Biology 36:311‑322,1987；Anderson,Science226:401‑409,1984；Moen,Blood Cells 17:407‑416,1991；Milleret al.,Biotechnology 7:980‑990,1989；Le Gal La Sal le et al.,Science 259:988‑990,1993；and Johnson,Chest 107:77S‑83S,1995)。逆转录病毒载体已经得到特别好的发展，并且已经用于临床环境(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson etal.,U.S.Pat.No.5,399,346)。最优选地，病毒载体用于在将TLR4促效剂传输至本发明的细胞之前、同时或之后，将GM‑CSF多核苷酸给药至该细胞。
非病毒途径也可用于将编码GM‑CSF的载体引入来源于具有肿瘤形成的患者或来源于赘生性细胞系的细胞中。例如，可在脂质转染(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham et al.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al.,Methods inEnzymology 101:512,1983)、脱唾液酸血清类粘蛋白‑聚赖氨酸共轭物(Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu et al.,Journal of Biological Chemi stry 264:16985,1989)的存在下，通过给药编码GM‑CSF的核酸分子而将该核酸分子引入细胞中，或通过在手术条件下的微注射而将该核酸分子引入细胞中(Wolff etal.,Science 247:1465,1990)。优选地，该核酸与脂质体和精蛋白组合给药。可在以编码GM‑CSF的载体转染之前或之后，以脂质体和TLR4促效剂同时组合处理细胞。
实现体外转染的方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔及原生质融合。脂质体对于将DNA传输入细胞具有潜在的益处。
用于本发明方法中的cDNA表达可由任何适当的启动子(如，人类巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)引导，且通过任何适宜的哺乳动物调控元素调节。例如，若需要，已知优先引导特异性细胞类型中的基因表达的增强子可用于引导核酸的表达。所使用的增强子包括，而不限于，那些以组织特异性或细胞特异性为特征的增强子。
或者，若使用基因克隆作为疗法构建，可通过同源调节序列介导调节，或者，若需要，通过来源于异种源的调节序列介导调节，该异种源调节序列包括上述的任何启动子或调控元素。
本发明中包括的另一治疗途径包括，将重组治疗剂如分泌重组GM‑CSF蛋白质、其突变型或片段的细胞直接给药至潜在或当前染病组织(如，瘤外或癌周给药)或全身给药(例如，通过任何传统重组蛋白质给药技术)。表达该GM‑CSF蛋白质的细胞的给药剂量取决于大量饮水，包括个体患者的体型和健康状况。对于任何特别的对象，具体剂量方案应根据个体所需及进行给药或监视该组合物给药的人的专业判断而随着时间改变。
自体细胞
由于每个患者的肿瘤表达独特的肿瘤抗原组，而该抗原组可能不同于来自另一患者的组织学上类似的匹配MHC的肿瘤细胞，使用表达细胞因子如GM‑CSF且包括TLR4抗原的经过基因改造的自体细胞具有优势。参见，如，Kawakami et al.,J.Immunol.,148,638‑643(1992)；Darrow et al.,J.Immunol.,142,3329‑3335(1989)；and Horn etal.,J.Immunother.,10,153‑164(1991)。相对地，匹配MHC的肿瘤细胞提供下述优势：该患者不需要进行手术以获得其肿瘤样本来生产经过基因改造的肿瘤细胞。
一具体实施例中，治疗具有肿瘤形成的对象的方法包括，自该对象获得肿瘤细胞；将该细胞与编码GM‑CSF的表达载体接触；在提供该细胞吞噬或摄取该TLR促效剂的条件下将该细胞与TLR促效剂接触；(如通过辐射该)将该细胞处理为增殖机能不全；以及将该细胞向取得该细胞的对象给药。优选地，该组合物经皮内、皮下或瘤内给药至该哺乳动物对象。
某些例中，单一的自体肿瘤细胞可仅表达GM‑CSF或表达与一种或多种肿瘤相关抗原的GM‑CSF。其它例中，GM‑CSF和一种或多种肿瘤相关抗原可通过不同的自体肿瘤细胞表达。本发明的一方面，通过引入包括编码GM‑CSF、操作链结至其表达所必需的启动子和表达/控制序列的核酸序列的载体而改造自体肿瘤细胞。另一方面，可通过引入包括核酸序列的载体而改造相同的自体肿瘤细胞或第二种自体肿瘤细胞，该核酸序列编码一种或多种肿瘤相关抗原操作链结至其表达所需的启动子和表达/控制序列的。可使用相同或不同的载体将编码一种或多种肿瘤相关抗原的核酸序列引入相同或不同的自体肿瘤细胞中。编码一种或多种肿瘤相关抗原的核酸序列可进一步包括或不包括操作链结至启动子的可选择的标记序列。预期地，该自体肿瘤细胞表达高量的GM‑CSF和/或一种或多种前列腺肿瘤相关抗原。
同种异基因细胞
一具体实施例中，含有TLR4促效剂(如，包括与脂质体载剂相结合的TLR促效剂)的经过基因改造的同种异基因细胞可提升肿瘤免疫原性。如本文所用的，“赘生性细胞系”包括最初来源于肿瘤或其它赘生性细胞的细胞。该细胞典型展现培养中的不定生长。一方面，提升对象的免疫响应的方法包括：(a)获得赘生性细胞系；(b)对该细胞系进行遗传学改造，使该细胞能生产增量的细胞因子如GM‑CSF；(c)在一定条件下将该细胞与TLR促效剂接触，从而该细胞摄取促效剂；(d)将经改造的赘生性细胞系处理为增殖机能不全；以及(d)将该赘生性细胞系向具有与该赘生性细胞系来源相同类型的肿瘤形成或具有该肿瘤形成发展潜力的对象给药。某些具体实施例中，所给药的细胞是同种异基因的，或与该对象具有或不具有MHC匹配。该同种异基因系提供下述优势，他们可预先被制备、表征，并等量分样于含有已知量的TLR4促效剂的小瓶中，生产相当量的细胞因子并存储(如冰冻)，因此，良好表征的细胞可用于向对象给药。WO00/72686中的实施例揭示了生产经过基因改造的同种异基因细胞的方法，该专利通过引用明显地并入本文。
可使用任何适当的给药路径将同种异基因细胞系组合物引入该患者体内，优选地，该组合物经皮内、皮下或瘤内给药。
TLR促效剂
任何适当的TLR促效剂或促效剂的组合可用于制备本文所提供的免疫原性组合物，该促效剂包括：R848、GLA、细菌脂肽、细菌脂蛋白、细菌脂磷壁酸、分支杆菌脂聚糖、酵母聚糖、孔蛋白、病毒双链RNA、脂聚糖、脂质A、单磷酰基脂质AAGPs、鞭毛素(Flagellin)、病毒单链RNA、咪唑并喹啉、细菌DNA、CpG DNA、疟原虫色素、尿道致病菌(Uropathogenic bacteria)及原生动物抑制蛋白。这些TLR促效剂是该技术中已知的，且由例如里德(Reed)等在Trends in Immunol.30:23‑32,2008中揭露，该文献进一步提供了佐剂及载剂的综述。Reed报导的文献通过引用以其整体并入本文。
给药(administration)
在给药之前，经过基因改造以表达细胞因子(如，GM‑CSF)且包括TLR促效剂的赘生性细胞可低温贮藏。优选地，将该细胞处理为使它们不能增殖(“增殖机能不全”)。最优选地，通过辐射使得该细胞机能不全，该辐射能导致增殖机能不全但仍允许在细胞最终死亡之前产生GM‑CSF。一具体实施例中，在向患者给药之前，以约50至约200拉德(rads)/分(min)或自约120至约140rads/min的剂量辐射本发明的细胞。优选地，以足以基本上抑制100%细胞不进行进一步增殖的总剂量辐射该细胞。预期地，以约10,000至20,000rads，最优约15,000rads的总剂量辐射该细胞。
典型地，在治疗过程中，将超过一种表达细胞因子(如，GM‑CSF)的包括TLR促效剂的细胞向对象给药。依据特定的疗程，可在一个时间点进行多次注射，并在多个时间跨度内重复该治疗。例如，初始或“激发(priming)”治疗之后进行一种或多种“助推(booster)”治疗。典型通过相同的给药途径和/或约在相同的位点进行该“激发”治疗和“助推”治疗。当给药多个剂量时，第一个免疫化剂量可高于后续免疫化剂量。例如，5×l07‑8的激发剂量，其后可能是若干个107‑8至3×107‑9助推剂量的GM‑CSF和产生肿瘤抗原的细胞。
包括TLR促效剂的经过基因改造的细胞的单一注射剂典型在至少约105至109细胞之间，如1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、5×107、×108、×109细胞。可根据如所给出细胞免疫疗法组合物产生的细胞因子和/或肿瘤抗原水平来调节产生细胞因子和肿瘤抗原的细胞数。优选的具体实施例中，肌肉注射或静脉注射经改造的细胞。
某些具体实施例中，以每一百万细胞每24小时能产生至少1、5、10、25、75、100、200、300、400、500ng GM‑CSF的剂量给药该细胞免疫疗法的产生细胞因子的细胞。某些具体实施例中，以每一百万细胞每24小时能产生至少500ng特定肿瘤抗原的剂量给药本发明的免疫原性组合物。鉴于本文提供的公开，最优细胞剂量及比例的确定是常见问题，且处于该领域技术人员能力范围内。
将本发明的细胞处理为移除在制备该细胞中使用的大多数添加成分。特别地，移除培养介质中的胎牛血清、牛血清成分或其它生物补充剂。一具体实施例中，例如通过重复的轻柔离心将该细胞洗涤入适当的药理学可接受的赋形剂中。可接受的赋形剂包括各种细胞培养介质、等渗盐水、具有或不具有生理学可接受的缓冲剂如磷酸盐或羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)，以及营养物质如葡萄糖、生理学可接受的离子或氨基酸，特别是那些没有其它免疫原性成分的。用于体内给药的组合物包括适宜的载剂或稀释剂，其可进一步为药学可接受的。例如，可使用运载试剂如白蛋白及血浆片段和惰性增稠剂。该技术中已经揭示制作该组合物的手段。见《雷明顿医药科学(第19版)》(Remington'sPharmaceutical Sciences 19th edition,Genarro,A.Ed.(1995))。
在药物剂型中，本文中揭示的免疫原性组合物可单独使用或与该领域已知的其它药物活性化合物适当地并用。
药物疗法
本发明包括以赘生性细胞为基础的疫苗，可用于肿瘤形成(如，表达GM‑CSF且包括TLR4促效剂或其片段的增殖机能不全的赘生性细胞)的治疗。一特别的具体实施例中，本发明的免疫原性组合物可用于诱发或增强对抗肿瘤形成或肿瘤特异性抗原的免疫响应。本文中使用的短语“增强免疫响应”意指，可检出的特异性免疫活性的可检出的增加(如，B细胞和/或T细胞响应)。增强免疫响应的一个实例是，在给药本发明的表达细胞因子的细胞疫苗之前检出的较低水平的结合至抗原的抗体的量增加。另一实例是增加细胞免疫响应。细胞免疫响应包括T细胞，且可在体外(如，通过铬释放试验)或体内观察到。增强免疫响应典型伴随有特异性免疫细胞群落的增加。
另一具体实施例中，本发明的免疫原性组合物可用于抑制赘生性细胞生长。短语“抑制赘生性细胞生长”指代肿瘤质量、肿瘤体积、肿瘤细胞量或该肿瘤生长速率的任何可测的下降。可通过该领域技术人员已知的多种方法检测肿瘤质量的可测的下降。这些包括可访问肿瘤的直接测量、(如血液中存在的)肿瘤细胞计数、肿瘤抗原(e.g.Prostate Specific抗原(PSA)测量、甲胎蛋白(AFP)和各种可视化技术(如MRI、CAT扫描和X射线)。肿瘤生长速率的下降典型与癌症患者的更长存货时间相关。其它具体实施例中，本发明以细胞为基础的疫苗可用于预防或降低肿瘤生长和/或赘生性细胞侵入周遭组织或转移的潜力。对于治疗的用途，本文所揭露的疫苗可与例如药学可接受的缓冲剂如生理盐水配伍而进行全身给药，或局部给药。优选的给药路径包括，例如，瘤内注射、瘤周注射、皮下注射、静脉注射、腹膜间注射、肌肉注射或皮内注射，其足以诱发或增强免疫响应。将使用处于生理学可接受载剂中的治疗有效量的本文中证实的治疗剂来实现人类患者或其它动物的治疗。适当的载剂及其配方由E.W.Martin揭示于《雷明顿医药科学》中。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者年龄和体重，以及该肿瘤形成的临床症候而改变。通常，该量将处于在治疗其它与肿瘤形成的疾病中使用的其它试剂所使用的范围内，但某些例子中，由于该化合物的增加的特异性，将需要较低的量。
药物组合物配方
用于治疗肿瘤形成而给药以细胞为基础的疫苗，该给药可通过任何导致与其它成分合并的该疫苗的浓度有效于缓解、降低或稳定化肿瘤形成的适当手段。该疫苗可以任何适宜的量包括在任何适当的载剂物质中，且通常以该组合物总重量的1至95重量%的量存在。该以细胞为基础的疫苗可提供为适用于非经肠道(如经皮下、静脉、肌肉或腹膜)给药路径的剂型。优选的给药方法是肌肉输液、瘤内输液或静脉输液。该药物组合物可根据传统药物学实践(见，如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000and Encyclopedia ofPharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988‑1999,Marcel Dekker,New York)而配制。
非经肠道的组合物
可通过以剂型、配方或通过适当传输装置或含有传统、非毒性药学可接受的载剂及阻剂的移植物而注射、输液或移植(皮下、静脉、肌肉、腹膜等)的方式给药包括该以细胞为基础的疫苗的药物组合物。该组合物的配方和制剂是该药物配方领域技术人员已知的。配方可在前述《雷明顿：药物科学及实践》中找到。
用于非经肠道用途的组合物可提供为单位剂型(如，单剂量安瓿)或提供在含有若干剂量的小瓶总，其中可添加适当的防腐剂(见下文)。该组合物可为溶液、悬浮液、乳液、输液装置或移植用传输装置的形式，或可作为在使用前与水或另一适当载剂重构的干粉而存在。该组合物除了包括降低或缓解肿瘤形成的活性剂之外，还可包括适当地非经肠道可接受的载剂和/或赋形剂。该活性治疗剂可合并入微球、微胶囊、纳米粒子、脂质体等中，以进行控制释放。再者，该组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、等渗调节剂、张度调节剂和/或分散剂。
如上所述，根据本发明的药物组合物可为适用于无菌注射的形式。将适当的治疗剂溶解或悬浮于非仅肠道可接受的液体载剂中，以制备该组合物。可使用的可接受的载剂和溶剂是水，通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或适当缓冲剂调节为适当pH的水，1,3‑丁二醇，林格溶液(Ringer's solution)，以及等渗氯化钠溶液及葡萄糖溶液。该水性配方也可含有一种或多种防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在使用微溶或难溶于水的化合物的例子中，可加入溶解增强剂或增溶剂，或该溶剂可包括10至60%w/w的丙二醇等。
组合疗法
任选地，本发明以癌疫苗为基础的疗法可与任何其它化疗药物组合给药；这些方法是熟练技术人员已知的且由马丁(E.W.Martin)揭示于《雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》中。特别地，本发明的免疫原性组合物可与下列的任何一种或多种组合给药：乙酸阿比特龙、六甲蜜胺、脱水长春碱、奥里斯汀、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BMS 184476、2,3,4,5,6‑五氟‑N‑(3‑氟‑4‑甲氧基苯基)苯磺酰胺、争光霉素、N,N‑二甲基‑L‑缬氨酰‑L‑缬氨酰‑N‑甲基‑L‑缬氨酰‑L‑脯氨酰‑L脯氨酸‑叔丁酰胺、恶液质素、西马多丁、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、3’,4’‑双脱氧氢‑4’‑脱氧‑8’‑norvin‑caleukoblastine、多西他赛、紫杉醇、环磷酰胺、卡铂、卡氯芥(BCNU),顺铂、念珠藻素、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺(DTIC)、更生霉素、柔毛霉素、地西他宾、尾海兔素、多柔比星(阿霉素)、依托泊苷、5‑氟尿嘧啶、非那司提、氟他胺、羟基脲及羟基脲紫杉醇、异环磷酰胺、利阿唑、氯尼达明、环己亚硝脲(CCNU)、MDV3100、二氯甲基二乙胺(氮芥)、左旋苯丙氨酸氮芥、羟乙基磺酸米伏布尔、根霉素、sertenef、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇类、尼鲁米特、奥那司酮、紫杉酚、泼尼氮芥、甲苄肼、RPR109881、磷酸雌氮芥、三苯氧胺、他索纳明、紫杉醇、维甲酸、长春碱、长春新碱、硫酸硫酸长春地辛及长春氟宁。
本发明的组合疗法中，多种治疗成分可用足以抑制肿瘤生长的量同时给药，或彼此在1天、3天、5天、7天、14天、21天或28天内给药。依据癌症的类型奇迹发展阶段，该组合疗法可用于治疗癌以减缓该癌的扩散、减缓该癌的生长、杀死或捕捉已经自原始肿瘤转移至身体其它部位的癌细胞、减轻癌造成的症候或预防最初阶段的癌。组合疗法也可通过消除造成疼痛或不适的癌细胞，从而帮助人们更舒服地生活。
本发明的组合给药允许每一化合物以较低剂量给药，提供与单独给药化合物相似的效能以及较低的毒性。或者，该组合以相似或降低的毒性导致改善的治疗赘生物的效能。
试剂盒
本发明提供用于治疗或预防肿瘤形成的试剂盒。一具体实施例中，该试剂盒包括含有单位剂量的有效量的以肿瘤细胞为基础的疫苗的治疗或预防组合物。某些具体实施例中，该试剂包括无菌容器，该容器含有治疗或预防性细胞组合物；该容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、薄膜包装或其它该技术中已知的适当容器形式。该容器可由塑料、玻璃、纸板、金属箔或其它适用于保持药剂的材料制造。
若需要，将本发明以肿瘤细胞为基础的疫苗与将该疫苗向患有癌症(如，黑色素瘤、乳癌)或具有癌发展风险的对象给药的说明书一起提供。该说明书通常包括关于该组合物用于治疗或预防肿瘤形成的信息。其它具体实施例中，该说明书包括下列的至少一种：治疗剂的说明；治疗或预防局部缺血或其症候的用法和用量；注意事项；警告；适应症；禁忌症；用药过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。该说明书可直接打印在该容器(当存在)上，或作为用在该容器上的标签，或作为分离的片材、小册子、卡片或折迭页提供在该容器内或该容器上。
除了特别说明的，采用技术人员视界内的传统的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术来实践本发明。该技术在下述例举的文献中得以完整地阐述："Molecular Cloning:A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney,1987)；"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996)；"GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994)；"CurrentProtocols in Immunology"(Coligan,1991)。这些技术可实际用于制备本发明的多核苷酸和多肽，并且因此可认为其适用于制造和实践本发明。用于特定具体实施例的特别有用的技术将在下文中讨论。
提出下述实施例，以对该领域技术人员提供关于如何制造和使用本发明的试验、筛选和治疗方法的完全公开，且并不欲以限制发明人所设定的其发明的范畴。
实施例
实施例1：TLR促效剂增强GVAX(TEGVAX)的配方
为了提升限于局部的固有免疫细胞活化、最小化Toll样受体4(TLR4)刺激的全身毒性以及最小化对肿瘤细胞的TLR4R刺激，将脂质多糖(LPS)配伍入GVAX(TEGVAX：TLR4增强的GVAX)。在致死辐射之前，使用可商购的脂质载体，即脂质体(Lipofectamine)，来优化LPS进入GVAX细胞的吸收。为了定量该吸收的程度，使用LPS‑二氟化硼二吡咯(Dipyrromethene Boron Difluoride,BODIPY)荧光团测试进行优化的各种条件，使得98%的该细胞与LPS‑BODIPY配伍(图1)。为了定量每细胞吸收的LPS总量，鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate,LAL)试验(Cambrex)证明，使用优化LPS配方的该脂质体方法，4.73+/‑0.2ng的LPS被吸收入5x105细胞中。对于每一鼠科动物体内肿瘤实验，使用LAL试验以及GM‑CSF ELISA试验测试TEGVAX的等量小样，以保证该TEGVAX配方中具有相当量的LPS和GM‑CSF的。所分泌的典型GM‑CSF的范围是50至200ng/ml/106细胞/天。
实施例2：TEGVAX在多个鼠科动物癌模型中诱发体内抗肿瘤响应
最初在B16黑色素瘤鼠科动物模型中测试TEGVAX的效能，其中，将肿瘤接种至治疗模型后的3至5天，进行TEGVAX的瘤内输送。瘤内注射基本原理的一部分是确保以环绕在该肿瘤与引流淋巴结之间的仅限于局部的抗原呈递细胞(APCs)为靶点。选择这些时间点是因为，早在进行B16注射3天后，即存在非变应性及耐受性肿瘤特异性T细胞。如图2所示，相较于GVAX处理，TEGVAX降低了B16肿瘤的生长速率。生长速率的统计学上的显着差异转化为存活率曲线差异(图2)。然而，使用TEGVAX处理的C57B1/6小鼠全部最终在注射部位发展为大肿瘤。测量到每5x105GVAX细胞给出4.73ng LPS，实施对照实验，其中，将与TEGVAX处理组中等摩尔量的LPS进行癌周注射。相较于以GVAX或PBS(图7)处理的荷瘤小鼠，这些小鼠的生长速率或存活率并无不同。
相较于PBS对照组，以不具脂质配方的GVAX进行等摩尔LPS注射并未展示抗肿瘤响应，说明LPS的细胞内配伍对于其抗肿瘤响应是重要的(图7)。TEGVAX也诱发全身性抗肿瘤响应(图8)。使用该B16黑色素瘤模型，以TEGVAX对小鼠进行癌周治疗或治疗肿瘤接种位点侧肢，两组处理组显示类似的体内肿瘤生长速率(图8)。
将SCCFVII/SF细胞皮下注射入具有野生型TLR4R的同源C3H/HeOUJ小鼠的侧面，以测试TEGVAX是否能在其它鼠科动物肿瘤模型中展示抗肿瘤响应(图2)。一旦肿瘤可察觉，使用自鼠科动物SCCFVII/SF鳞状细胞癌细胞制备的TEGVAX或GVAX处理该肿瘤。与使用B16模型的TEGVAX实验相比，TEGVAX显示显着的抗肿瘤响应。再一次地，使用TEGVAX处理的小鼠全部最终发展为大块肿瘤，需要执行安乐死。由于在SCCFVII/SF小鼠模型中测量舌‑口底口腔肿瘤的固有不确定性，未实施原位注射。
最后，还在CT26结肠癌模型中测试TEGVAX，该实验也显示抗肿瘤响应，其中统计学上，所移植肿瘤的生长速率比仅以GVAX处理的CT26肿瘤慢(图2)。对于CT26，40至60%以TEGVAX处理的小鼠实际上具有肿瘤退化。自存活小鼠获取CT26细胞，再次移植该肿瘤，未长出任何肿瘤，证明完全的免疫疗效。对于该CT26模型，还测试了摩尔量与TEGVAX相等的与经致死辐射的HEK 293细胞配位的LPS。将LPS配伍入不具有相同肿瘤抗原和GMCSF的以细胞为基础的疫苗中，在CT26模型中不引起抗肿瘤响应。
实施例3:对TEGVAX的抗肿瘤响应是MyD88依赖性的
为了证实上述的体内抗肿瘤效应确实是由引入TLR4信号所引起的，将B16肿瘤接种入具有MyD88‑/‑基因型的C57B1/6小鼠中。随后以TEGVAX或GVAX处理该肿瘤。图3显示，与TLR4刺激相比，由于加入配伍于GVAX细胞中的TLR4促效剂而造成的抗肿瘤响应增强是次要的。早期注意到的GVAX组中的轻微差别，最终与PBS处理组的生曲线重迭(图7)。MyD88是TLR4信号传递的主要细胞内中介体，无MyD88小鼠中TLR4信号传递的缺失不再展示在野生型C57B1/6小鼠中始终观察得到的体内抗肿瘤响应增强。
实施例4：TEGVAX诱发肿瘤微环境中T细胞浸润性和APCs的增强
为了检查来自TEGVAX处理的体内抗肿瘤响应的潜在机制，在处理之后获取该肿瘤组织并分析其淋巴细胞性浸润。如图4所示，与对照处理组和以GVAX处理的肿瘤相比，以TEGVAX处理的肿瘤具有定量增加的CD4和CD8浸润性。此外，假设TLR4促效剂刺激仅限于局部的专职性APC成熟，将抗CD86的抗体实施免疫染色，且注意到，以TEGVAX处理的肿瘤微环境中的CD86+细胞定量增强。还检查在该肿瘤组织中巨噬细胞是否增加，但未发现处理组之间存在F4+巨噬细胞浸润性的显着差别。
实施例5：局部引流淋巴结中的树突细胞活化增益
图4中的免疫染色数据与下述假设一致：与细胞疫苗配伍的TLR4促效剂能增加活化的局部树突细胞的数量。DC是重要的主要抗原加工细胞，它们能指示效应细胞是否变为耐受性的或细胞毒性的。不欲受缚于理论，被吸收入GVAX中的LPS可能作为细胞碎片和胶束而与肿瘤抗原一起被浸润性DC吞噬。因此，使用TEGVAX处理时，似乎活化的局部DC群落的数目应有所增长。为了测试这一假设，从来自以PBS、GVAX或TEGVAX处理的荷瘤小鼠的引流淋巴结纯化树突细胞，并以B220和CD1l c对传统DC群落进行门控。对来自这些经门控细胞的DC活化标记物CD86、CD80和MHCII进行多参数染色显示，与GVAX处理组或对照处理组相比，来自TEGVAX处理组的树突细胞具有更大的活化DC群落(图5)。
实施例6:以TEGVAX处理的小鼠中，肿瘤特异性细胞毒性T细胞扩张
协同研究CT26模型与SCCFVII/SF和B16模型的一个基本原理是用于定量AH1特异性细胞毒性T细胞的试剂的实用性。进行ELISPOT试验，以测试对于活化局部树突细胞的EGVAX的体内抗肿瘤响应是否能增加肿瘤特异性细胞毒性效应细胞的下游群落。使用I类免疫原性MHC Ld限制型AH1肽，从引流淋巴结和脾获取T细胞，并在AH1肽(ELISPOT试验中，以APC致敏(pulse)的CT26细胞免疫显性肽)的存在下筛选产生IFN的细胞毒性T细胞。尽管在以TEGVAX处理后第5天检测到了少量AH1特异性T细胞，如图6A所示，在第8天，TEGVAX组中的引流淋巴结和脾中均存在统计学上显着的AH1特异性T细胞。体内细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T‑lymphocyte,CTL)试验也证明，与未处理组相比，TEGVAX处理组中对AH1肽的细胞毒性T细胞的激发增强(图6B)。使用来自B16模型的pl5E特异性T细胞的体内CTL试验也证明，该TEGVAX组中的pl5E特异性T细胞增强。
实施例7：与GVAX组合的TLR4促效剂降低肿瘤细胞生长并增加AHl特异性细胞毒性T细胞的数目
如上所述，TEGVAX改善三种独立的鼠科动物模型的体内肿瘤响应。在B16黑色素瘤模型、CT26结肠癌模型以及SCCVII舌鳞状细胞癌模型中，与仅使用GVAX相比，经瘤内注射入所建立肿瘤的TEGVAX降低了肿瘤生长。在接种肿瘤后使用TEGVAX进行全身处理也降低了体内的B16生长速率。为了检查诱发该抗肿瘤响应的免疫学机制，使用CT26鼠科动物模型来研究该抗肿瘤细胞毒性T细胞(CTL)响应。使用良好表征的Elispot试验和体内CTL试验，以TEGVAX处理的小鼠显示，在处理后第8天，AHl特异性细胞毒性T细胞(CTL)的数目增加。这些实验中，通过将TLR4促效剂与GVAX组合，降低了临床前期模型的肿瘤生长速率。
实施例8：合成性TLR4促效剂‑吡喃葡萄糖脂质A类似物(GLA)与GVAX和TLR7及TLR8促效剂(R848)组合，显着降低黑色素瘤细胞的生长
将另一形式的TLR4促效剂(GLA,合成性吡喃葡萄糖基脂质A类似物)与GVAX合用，以测试该肿瘤微环境中，超过一种类型的TLR信号传递是否能改善该抗肿瘤响应。与GVAX配伍的GLA也与R848、TLR7和TLR8促效剂合用。实施荷B16黑色素瘤小鼠的体内肿瘤处理实验。使用该B16黑色素瘤模型，GVAX、GLA和R848的组合防止了野生型小鼠体内恶性B16肿瘤的生长(图9)。
在接种肿瘤2至4天后，注射该疫苗制剂。典型地，在这些免疫原性极差的肿瘤细胞中，GVAX本身并不能预防B16的体内生长。当对这些小鼠再次注射B16黑色素瘤细胞系时，该激励肿瘤细胞并不生长。实施ELISPOT和体内CTL试验来定量pl5E特异性CD8+T细胞，且与仅使用GVAX处理的小鼠相比，使用GVAX、GLA和R848处理的小鼠明显具有更多的pl5E特异性CD8+T细胞。
实施例9：GVAX/GLA R848的组合增强了树突细胞活化
为了处理形成的肿瘤组织，使用GVAX/GLA/R848配方来处理可察觉的B16肿瘤。在接种肿瘤之后7至10天，将该疫苗配方注射入远离该可察觉肿瘤组织的位点。再一次地，该TLR促效剂增强了GVAX降低肿瘤生长速率的效果(图10)。
在每组中实施ELISPOT和体内CTL试验，以定量pl5E特异性CTL的水平，结果表明，以GVAX/GLA/R848处理的小鼠具有最大数目的pl5E特异性T细胞，这与体内肿瘤生长速率一致(图11)。
考虑到使用GVAX/GLA/R848配方的抗肿瘤响应，假设该TLR促效剂增强的疫苗正在刺激树突细胞。因此，获取来自每一处理组的引流淋巴结和脾，检查树突细胞的活性状态。在CDl l c+和B220+细胞上使用CD80和CD86活化标记，该GVAX/GLA/R848处理组显示显着增强的活化树突细胞(图12)。
使用免疫组化分析来自每一处理组的肿瘤组织。在以GVAX/GLA/R848处理的肿瘤中，发现了较大数目的CD4+、CD8+和CD86+细胞。最后，检查每一处理组中的细胞因子环境，以测定以该TLR促效剂处理的小鼠的I1‑12量是否提升。在引流淋巴结和脾中获取CD1lc正细胞，检查I1‑12细胞因子的量，从而测定将该T细胞谱导向抗肿瘤Thl响应的能力(图13)。以GVAX/GLA/R848处理的小鼠具有统计学显着的表达I1‑12的CDllc+细胞，其为将T细胞环境导向Thl响应的初级细胞因子。在引流淋巴结和脾中均注意到这一现象。
总之，这些结果显示，使用GVAX平台和多种TLR促效剂的组合途径已经增加了实体肿瘤处理的效能。GVAX与TLR4和TLR7/8促效剂的组合改善了体内抗肿瘤响应。改善的抗肿瘤响应与引流淋巴结和脾中活化树突细胞的数目增加、肿瘤特异性CTL的数目增加以及能分泌I1‑12的CDllc+的数目增加相关。
实施例10：TLR促效剂与GVAX细胞疫苗的特异性配伍时间改善抗肿瘤活性的体内效能
评估在TEGVAX配方的形成过程中该TLR促效剂及GVAX的培养时间对抗肿瘤活性的影响。制备三种含有GLA/R848和GVAX A的TEGVAX配方分组，每一配方中该GLA/R848及GVAX的培养长度不同(30分钟、1小时和2小时)。将每种TEGVAX配方向荷已建立的B16肿瘤的小鼠给药，测量该B16肿瘤在24天内的相对体积(图14)。作为对照组，将GVAX和GLA/R848不经混合而给药(图14中“单独的”)。另一对照组仅由载剂组成。当在辐射前将GLA和R848在载剂的存在下与GVAX混合30分钟时，该配方不具有抗肿瘤活性。若将GVAX和TLR促效剂培养超过2小时，该抗肿瘤活性也降低。当在载剂的存在下将GLA和R848与GVAX合并1小时的时候，观察到TEGVAX配方中的最大抗肿瘤活性(图14)。
使用下列方法和材料获得上述结果。
鼠科动物肿瘤细胞系
在含有10%热灭活胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的RPMI 1640介质中，培养经转导以分泌GM‑CSF的SCCFVII/SF头颈鳞状细胞癌、B16‑F0黑色素瘤和B16‑F0细胞系。与之类似，加入MEM非必需氨基酸(Sigma,St.Louis)、1mM丙酮酸钠和2mM L‑谷氨酸，培养CT26结肠直肠癌细胞系。在相同的具有CT26但加入来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的潮霉素B(lg/L)(RocheApplied Science,Indianapolis,IN)的介质中，培养以GM‑CSF转导的旁邻B78HI细胞。全部细胞均于37°C在5%湿度的CO2中培养。在接种肿瘤前10天注射疫苗的接种模型中测试的GVAX疫苗细胞系显示，在全部三种GVAX系中均无肿瘤生长。
小鼠
自杰克森实验室(Jackson Laboratory)购买成年(年龄>50天)雌性C57BL/6、Balb/C和C3H/HeOUJ小鼠，根据约翰霍普金斯动物保护与使用委员会(Johns Hopkins Animal Care and Use Committee)的规定进行放置。自约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)的弗兰克·乌索(Franck Housseau)博士处获得C57BL/6MyD88‑/‑小鼠。
TEGVAX配方
将脂质体试剂(120μg/m1)和来自大肠杆菌(Escherichia coli026:B6)的LPS(10‑25μg/ml)合并入脂质复合体中。以5x105细胞的密度种植用于脂多糖(LPS)配方的细胞，24小时后，将其在脂质‑LPS复合体中培养6小时，以PBS洗涤5次，然后注射入小鼠体内。根据制造商的说明进行鲎变形细胞溶解物(LAL)试验(Cambrex)，以将并入该细胞的LPS定量。使用0至3.0EU/ml的LPS(23EU/ng)作为标样。在致死辐射前，培养TEGVAX以确保有活力的细胞生长。膜联蛋白染色证实，在配方之后没有细胞凋亡的证据。
对于含有TEGVAX配方的GLA/R848，用于以该GVAX细胞吸附TLR促效剂的载剂是具有卵磷脂的稳定的水包角鲨烯油乳液。在载剂中制备含有浓度为1mg/ml的GLA和0.2mg/ml的R848的TLR促效剂。将所培养的GVAX细胞胰酶化并洗涤。洗涤之后，以10,000RAD对该细胞进行致死辐射。在注射入小鼠之前，在载剂的存在下将GLA和R848与经辐射的GVAX细胞混合，并在室温培养1小时。典型地，在注射之前将20μl GVAX细胞与20μl GLA/R848/载剂混合。
体内疫苗处理试验
将5xl04B16‑F0细胞经皮下注射入C57BL/6小鼠的右侧。在接种3至5天后，将106经致死辐射(150Gy)的B16GM‑CSF(GVAX)、106经致死辐射(150Gy)的配伍有LPS的GVAX(TEGVAX配方)或吸收有LPS的293细胞进行癌周注射。某些例子中，将疫苗注射入肿瘤接种侧的侧肢中。分别以可比较的方法使用C3H/HeOUJ小鼠和Balb/c小鼠的SCCFVII/SF细胞和CT26细胞。
免疫组化
将来自小鼠的冷冻CT26肿瘤切为10μm厚度，并以1%BSA在室温阻断30分钟。将在4°C培养1小时的抗鼠CD45(eBioscience)和抗鼠CD4‑异硫氰酸荧光素(FITC)、CD8‑FITC与CD86‑FITC抗体(BDPharmingen)作为一级抗体。某些例子中，使用抗CD45‑Cy3(Invitrogen)作为二级抗体。使用DAPI复染10分钟。将10个随机选择区域内的细胞在40x放大下计数。显微镜是Nikon Eclipse F800，相机是Nikon DS‑Qilmc，用于这一实验的软阶是NIS‑Element AR 3.0。在以GVAX和TEGVAX处理5天后，获取荷瘤BL/6小鼠的脾和引流淋巴结。在含有DNAse I(Roche)和可商购的组织分离用酶组(LIBERASEBLENDZYME 2)(20,000Mandl U/ml)(Roche)于介质中对脾切片进行酶解。通过去除CD3+和CD19+获得富DC的群落，对其染色以突显CDllc+和B220+。使用来自BD Biosciences的CD80、CD86和MHCII抗体进行多色FACS分析，评估经CDllc+B220+门控的DC。
ELISPOT试验
以小鼠干扰素(IFN)‑γ抗体(Ab)涂覆于(MabTech)酶联免疫斑点(Enzyme‑linked immunosorbent spot,ELISPOT)板(MultiScreenHTS过滤板，Millipore)24小时，将4T1乳癌细胞以10μg/ml的AHl肽致敏过夜。第二天，自小鼠获取脾和淋巴结。将106CD8a+细胞以三等份放置，与105未致敏(unpulsed)的4T1细胞共同培养、与105致敏的4T1细胞共同培养，或以1μΜ的PMA，并以l0ng/ml的离子霉素刺激作为正对照组。第三天，以生物素化的抗鼠IFN‑γAb(MabTech)培养该板，再以链霉亲和素‑HRP培养，进行ELISPOT(BD)。使用ELISPOT(BD)用AEC基质试剂组进行发色，并使用ELISPOT读板器(Immunospot)进行分析。
体内CTL试验
使用可商购的体内示踪用CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(分子探针)测试使用或不使用TEGVAX处理的荷CT26肿瘤的小鼠中的CTL杀死百分比。以浓度为10μg/ml的β‑半乳糖苷酶(B‑gal)或AHl肽将脾细胞处理并致敏90分钟。该β‑gal群落以CFSE标记为低(0.5μΜ)，而该AHl群落以羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记(5μΜ)。培养10分钟后，对三组小鼠以10细胞/小鼠的量注射经CFSE标记的细胞。注射后24小时，获取脾细胞并分析。
统计分析
使用配对t测试(Paired t‑test)计算双尾p值(two‑tailed pvalue)，以评估两组处理组间差异的统计显着性。统计显着性p值标示如下：**p＜0.01和*p＜0.05。使用Excel软件分析数据。
其它具体实施例
自前述说明清晰可见，可对本文揭示的本发明作出变更和修饰以使其适应各种用途及条件。这些具体实施例也处于权利要求书范畴内。
本文中任何变量定义中所列要素的详述包括该变量作为任何单一要素或所列要素的组合(或次组合)的定义。用于本文中变量或方面的具体实施例的详述包括作为任何单一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分组合的具体实施例。
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