“植物－微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法.pdf

“植物－微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法，首先筛选出特异性的能高效降解PCP污染物的降解菌，然后对其菌种及降解特性进行实验研究，选择最适条件培养。培养后菌液与灭菌并且添加了不同浓度污染物的受试土壤混合后，作为盆栽碱蓬的实验用土。在碱蓬的不同生长时期取土样测定其中PCP残留量。特点是：有碱蓬种植并且其种子经PCP降解菌菌液浸泡，土壤中混有菌液的受试样的PCP降解率最高，低浓度PCP(5mg/kg)的降解率可达94.73％。接种特异性PCP降解菌同时种植碱蓬，两者结合，对土壤修复作用的功效要大于单纯接种特异性PCP降解菌或种植碱蓬效果，可以达到最佳的PCP降解效果。

1、  一种“植物—微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法，其特征在于：
(一)筛选特异性污染物降解菌Psendomonasa sp.和Bacillus sp.
针对受损土壤的污染物为氯酚类物质中的五氯酚PCP，筛选降解菌的过程包括采样、富集培养、驯化、分离；
(1)富集培养
取沿海岸受PCP污染严重地区的泥样，接入PCP富集培养基中，富集培养；待培养基浑浊后，得到活化污泥原液；
(2)驯化
将活化的污泥原液接入PCP富集培养基中振荡培养，在检测到PCP降解后，加入无菌玻璃石棉，继续培养一段时间后，静置，弃去上清液；在下层污泥中再加入含PCP的富集培养基，同上培养，直至PCP降解；这样反复驯化下层污泥，并逐渐增加培养基中PCP的含量，使得污泥中的PCP降解菌不断被富集；
(3)分离
在以PCP为唯一碳源，含有溴百里酚蓝的固体培养基上筛选周边变成黄色的菌落，转板划线分离，再回接到添加了溴百里酚蓝的PCP分离培养基中，经培养后，挑选培养基由蓝色变成黄色，并且较为浑浊的培养样品涂布于含高浓度PCP的平皿中；重复以上过程，获得高效降解PCP的菌株；最终筛选出两株高效PCP降解菌P5、P9，P5为Psendomonas sp.P9为Bacillus sp.；
在筛选的起始阶段培养基中添加的PCP浓度较低，为50mg/l，驯化阶段逐渐增加PCP浓度，直至500mg/l，并且为了适应高含盐环境，在筛选的无机盐培养基中添加1％的氯化钠；在平板分离过程中，选取长势较快并且经回试仍有较强PCP降解能力的菌种；
以上其中：
无机盐培养基：K₂HPO₄        1.73g；    KH₂PO₄       0.68g；
              NH₄NO₃        1.0g；     CaCl₂·2H₂O  0.02g；
              MnSO₄·H₂O    0.03g；    MgSO₄·7H₂O  0.1g；
              FeSO₄             0.03g；    NaCl                 10g；
              水                    1000ml；   PH                   7.4
富集培养基：在无机盐培养基中添加一定浓度的PCP作碳源，另加入0.5g/l的酵母粉作生长因子和补充碳源；
分离培养基：在无机盐培养基中添加一定浓度的PCP作唯一碳源；
(二)碱蓬——特异性PCP降解菌联合修复污染土壤
将PCP高效降解菌的混合菌液与滨海高含盐含PCP土壤混合，并在其混合土壤上栽种碱蓬：灰绿碱蓬suaeda.glanca bunge和盐地碱蓬S.salsa(L.)Pall，即可达到修复污染土壤。

2、  根据权利要求1所述的“植物——微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法，其特征在于：碱蓬种植时，将其种子经PCP降解菌菌液浸泡。

“植物—微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法
技术领域
本发明属于滨海受损土壤改造方法，特别涉及一种“植物一微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法。
背景技术
天津渤海沿岸地区大部分为高盐碱度的滩涂及湿地，近年来，受工业污染加剧的影响，主要由城市生活污水和工业污水汇入的南排污河对渤海沿岸土壤的污染也日趋严重。再加上周边地区农田中大量农药的不合理使用，使得土壤中所含的各种毒害性很强的有机物浓度和种类也大大增加。这其中，氯酚类化合物，尤其是五氯酚(简称PCP)在土壤中的积累成为破坏其原有生态环境的最主要因素。土壤中PCP主要来源于木材防腐剂、农药、除草剂等，它作为一种应用广泛、污染严重的含氯有机化合物，其毒性很强且化学性质稳定难降解，易在土壤中残留从而造成严重的污染，因此许多国家都将其列入优先控制的污染物黑名单中。基于上述原因，对PCP污染土壤的生物修复一直都是近年来科学家研究的热点，Saber和Crawford(1985)等从被PCP污染的土壤中筛选出属于黄杆菌属的菌体，用于降解氯酚类有较好的效果。还有研究者报道了不同的好氧菌纯培养时其对PCP的降解作用(Edgehill，1983.Kiyohara，1992)。Miethling和Karlson(1996)的研究表明，未接种外来降解菌的污染土壤，PCP完全矿化需7个月，当接种两种浓度为10⁸个/g的降解菌时，1个月内其CO₂的释放量即可达到未接种土壤7个月的水平。
与上述研究成果不同，本发明中的土壤环境由于处于滨海地区，其含盐量很高，单纯的PCP降解菌很难存活，或者即使存活也会因为对环境的不适应而难以发挥作用，从而无法起到修复PCP污染土壤的作用。因此，我们有必要重新筛选一种抗盐能力强，并且和环境土著植物联合发挥作用的PCP降解菌，来构建一种全新的生态修复方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种“植物—微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法。用于高含盐环境地区，特别是滨海地区的，采用土著植物和筛选的PCP特异降解菌联合修复受损土壤，以达到经济效益、环境效益和社会效益的有机统一。
本发明具体方案为：
对于滨海地区被氯酚类有机污染物污染的大面积盐碱土壤，本发明采用耐盐碱的土著植物—碱蓬作为宿主植物，配合特异性降解五氯酚等氯酚类物质的优势菌株，联合作用于受污土壤，修复受损土壤。
一种“植物—微生物”联合定向修复五氯酚污染土壤的方法，其特征在于：
(一)筛选特异性污染物降解菌Psendomonas sp.和Bacillus sp.
针对受损土壤的污染物为氯酚类物质中的五氯酚PCP，筛选降解菌的过程包括采样、富集培养、驯化、分离；
(1)富集培养
取海沿岸受PCP污染严重地区的泥样，接入PCP富集培养基中，富集培养；待培养基浑浊后，得到活化污泥原液；
(2)驯化
将活化的污泥原液接入PCP富集培养基中振荡培养，在检测到PCP降解后，加入无菌玻璃石棉，继续培养一段时间后，静置，弃去上清液；在下层污泥中再加入含PCP的富集培养基，同上培养，直至PCP降解；这样反复驯化下层污泥，并逐渐增加培养基中PCP的含量，使得污泥中的PCP降解菌不断被富集；
(3)分离
在以PCP为唯一碳源，含有溴百里酚蓝的固体培养基上筛选周边变成黄色的菌落，转板划线分离，再回接到添加了溴百里酚蓝的PCP分离培养基中，经培养后，挑选培养基由蓝色变成黄色，并且较为浑浊的培养样品涂布于含高浓度PCP的平皿中；重复以上过程，获得高效降解PCP的菌株；最终筛选出两株高效PCP降解菌P5、P9，其P5和P9名称为Psendomonas sp.和Bacillus sp.；
在筛选的起始阶段培养基中添加的PCP浓度较低，为50mg/l，驯化阶段逐渐增加PCP浓度，直至500mg/l，并且为了适应高含盐环境，在筛选的无机盐培养基中添加1％的氯化钠；在平板分离过程中，选取长势较快并且经回试仍有较强PCP降解能力的菌种；
以上其中：
无机盐培养基：
K₂HPO₄      1.73g；     KH₂PO₄       0.68g；
NH₄NO₃      1.0g；      CaCl₂·2H₂O  0.02g；
MnSO₄·H₂O  0.03g；     MgSO₄·7H₂O  0.1g；
FeSO₄       0.03g；     NaCl         10g；
水          1000ml；    PH           7.4
富集培养基：在无机盐培养基中添加一定浓度的PCP作碳源，另加入0.5g/l的酵母粉作生长因子和补充碳源；
分离培养基：在无机盐培养基中添加一定浓度的PCP作唯一碳源；
(二)碱蓬——特异性PCP降解菌联合修复污染土壤
将PCP高效降解菌的混合菌液与滨海高含盐含PCP土壤混合，并在其混合土壤上栽种碱蓬：灰绿碱蓬suaeda.glanca bunge和盐地碱蓬S.salsa(L.)Pall，即可达到修复污染土壤。
碱蓬种植时，将其种子经PCP降解菌菌液浸泡。
本发明的特点是
本方法适用于含盐量很高的PCP污染土壤的修复。PCP降解菌抗盐能力强，并且和环境土著植物碱蓬联合发挥作用共同修复的污染土壤，是一种全新的生态修复方法。它适用于一切含盐量很高的PCP污染土壤的修复，尤其适用于渤海滨海地区含盐量很高的PCP污染土壤的修复。
有碱蓬种植并且其种子经PCP降解菌菌液浸泡，土壤中混有菌液的PCP降解率最高，低浓度PCP(5mg/kg)的降解率可达94.73％。接种特异性PCP降解菌对土壤修复作用的功效要大于单纯种植碱蓬，将两者结合，则可以达到最佳的PCP降解效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
1.PCP降解菌Psendomonas sp.和Bacillus sp.的分离
选取适当泥样接种到PCP富集培养基中培养，初始PCP浓度为50mg/l，30℃，180rpm摇床培养24hr。本实验中所使用的基础无机盐培养基中NaCl的含量为1％，这是为了适应沿海土壤的高含盐而有针对性的筛选耐盐的PCP降解菌而设置的。待培养基浑浊后，得到活化污泥原液。将活化污泥原液转接到500ml富集培养基中进行驯化。污泥经不断增加PCP浓度的培养基的多次驯化，其降解PCP的时间大大缩短。在驯化至PCP含量为400～500mg/l时，48hr内可将PCP降解；但当PCP含量在550mg/l左右时，则降解不稳定，易出现红色物质，此时降解率虽达到90％左右，但不稳定，易丧失降解特性；当PCP含量超过600mg/l时，菌体大量死亡，PCP几乎没有降解。因此，本实验驯化污泥中的PCP降解菌能稳定降解的PCP最大浓度为500mg/l。
从驯化污泥液中经反复分离筛选，分离到2株能高效降解PCP的菌株，分别命名为P5和P9。其中P5菌落圆形，白色，表面隆起，边缘整齐，湿润光滑；镜检为短杆状，大小0.6～0.8μm×0.9～1.2μm，无芽孢，能运动，一端生单鞭毛；革兰氏染色阴性，好氧，氧化酶、接触酶阳性；糖发酵、VP反应、甲基红反应、吲哚实验、水解明胶、硝酸盐还原为阴性，经鉴定P5为Psendomonas sp.。P9菌落白色，边缘不整齐呈锯齿状，表面干燥；镜检为杆状，大小0.4～0.6μm×2.4～3.0μm，有芽孢，运动能力强，周生鞭毛；革兰氏染色阳性，好氧，接触酶阳性，能水解明胶、淀粉；能还原硝酸盐和亚硝酸盐；VP反应、甲基红反应、吲哚实验阴性。经鉴定P9为Bacillus sp.。
2.PCP降解菌的降解特性
使用的培养基为以PCP为唯一碳源的分离培养基(其中NaCl浓度为1％)，培养条件为30℃，180rpm摇床培养48hr，PCP使用浓度为500mg/l和200mg/l。受试菌种分别为P5、P9混合菌、P5单菌、P9单菌。待培养结束后，采用藏红T分光光度法测定培养基上清液中的PCP含量，具体实验结果为：当PCP浓度为200mg/l时，混合菌、P5、P9在48hr内对PCP的降解率分别为98.87％、97.74％、96.96％；当PCP浓度为500mg/l时，它们相应的降解率分别为95.05％、92.56％、90.27％。可见，低浓度的PCP比高浓度PCP有更高的降解率，并且混合菌比单菌的降解效率高。混合菌种在24hr左右即可将PCP降解到最低水平，无论是降解速度还是最终的降解率均优于单菌。
为了进一步考察混合菌对PCP降解的最佳条件，我们还分别在不同的盐度、温度、PH值的条件下研究了其对PCP的降解性能。结果表明，PCP降解混合菌对高盐浓度(5％)的耐受性很差，几乎没有使PCP得到降解。菌体在5％的盐浓度下大量死亡，显示出其对高盐环境的敏感。对于2％的中等盐浓度该混合菌尚能表现出一定的耐受性，但与筛选浓度(1％)相比，降解率还是下降了很多。混合菌株降解PCP的最佳条件为温度30～35℃，PH7.0～8.0，180rpm摇床培养48hr。
3.栽培试验
先将土壤在121℃的高温下灭菌40min，以杀死土壤中的真菌菌丝和孢子。试验设计3个PCP浓度处理，其浓度分别为5、50、200mg/kg(分别表示低、中、高3种处理浓度)。加入PCP的方法为：先用95％的乙醇溶解所需的PCP量，加入到少部分试验土壤中，待乙醇完全挥发后(1～2d)，再逐级扩大地将其拌入全部试验土壤中，充分搅匀，放置2d后装盆，每盆装土200g。先向盆中装150g供试土壤，在土壤表面均匀洒入10％的筛选出的PCP降解菌P5、P9混合菌液(每种菌液各10ml)，然后再在上面装50g土壤(所装土壤应较疏松，保证通氧)。对于菌液空白对照则按相同的方法接入相同剂量的灭菌菌液。装盆后称重加水使土壤含水量为田间持水量的70％，过夜后在盆中播种经表面消毒及包覆菌液处理的碱蓬种子15粒(不接PCP降解菌的对照样所用的种子表面只消毒，不包覆菌液)，出苗后定苗为10株；盆栽试验在控温生长室中进行，土壤水分维持田间持水量的70％，日间温度25℃，夜间20℃，光照强度为4000～7000lx，生长过程中在30、60、90、120d时分别取样，同一PCP浓度处理每次取12盆，分别为接菌种植物、接菌不种植物、不接菌种植物、不接菌不种植物四种情况，每种情况3个平行样。
4.土壤中可提取态PCP浓度的测定
土壤取样后经风干、去除植物根并过20目筛后待分析。每份待测土样称取10g，然后分别加入蒸馏水10ml，12M的H₂SO₄ 1ml，振荡混合均匀，室温放置，使土样中的PCP充分被溶出。然后采用蒸馏法收集溜出液，用藏红T分光光度法测定样品中PCP的含量。
5.栽培结果
对于接入特异性PCP降解菌的土壤而言，当种植碱蓬时，土壤中可提取态的低、中、高三个浓度PCP在120d内的降解率分别为94.73％、91.09％、30.60％；而不种植碱蓬的相应各样的降解率只有67.3％、57.74％、25.22％。以上数据充分说明了种植碱蓬促进了土壤中PCP可提取态浓度的下降，在3个浓度处理水平下，有植物处理时PCP可提取态浓度的降低明显高于无植物的。
对于不接种特异性PCP降解菌的各样来说，种植碱蓬时，土壤低、中、高三个浓度PCP在120d内的降解率分别为55.59％、32.60％、5.40％；而不种植碱蓬的相应各样的降解率为17.49％、11.27％、5.77％。上述的各个数值都明显低于相应的接菌的各样的降解率。这是因为特异性PCP降解菌的加入对在较短时间内降解土壤中的高浓度PCP起着很大的作用，从而有效地减低了其对碱蓬的毒性。另外，凡是接菌种植物的各样其种子都经过了降解PCP菌液的浸泡，这在很大程度上降低了PCP对种子萌发的抑制，保证了碱蓬的顺利生长。
比较接菌与不接菌两种情况可以看出，接种特异性PCP降解菌对土壤修复作用的功效要大于单纯种植碱蓬。但是如果将两者结合，则可以达到最佳的PCP降解效果。这一方面是因为碱蓬本身对微量PCP有一定的吸收转化作用，或是可以利用降解菌降解PCP的代谢产物，从而促进了降解反应的进行；另一方面，结合PCP降解菌P5、P9对高盐环境的耐受度不高的特点，碱蓬的种植也起到了积聚盐分，从而降低土壤中可溶态盐浓度，以保证P5、P9正常的生理代谢活动的作用。