用于多参数读出的侧向流膜及包括其的免疫测定装置技术领域
本发明涉及一种包括多个经分离的同构流道的多参数侧向流膜，且涉及一种包括
所述多参数侧向流膜的多参数侧向流免疫测定装置。
背景技术
在现代生物化学分析学中，免疫测定常规地用于检测各种物质(经常被称作配体
(ligand)或分析物(analyte))在例如血液、尿液或唾液等生物流体中且同样在例如食物提
取物、地表水等各种其他样本中的存在或浓度。在固相免疫测定中，结合剂-通常为特异于
待检测配体的抗体-固定在固体支撑物上。一种可包含待检测配体的测试流体与所述固体
支撑物接触，且在存在配体的情形中在所述结合剂与所述配体之间形成有络合物
(complex)。为了使络合物可见，可使经标记抗体结合至所述络合物，随后对结合至所述络
合物的经标记抗体进行可见检测。作为另外一种选择，免疫测定是与竞争反应
(competitive reaction)之后的读出一起进行。为此，分析物自身被固定在固体支撑物上
并为了缀合抗体(conjugated antibody)与存在于样本中的分析物的结合进行竞争。富含
所定义分析物的样本导致在测试线处存在低的绝对信号。
例如硝化纤维素、尼龙、醋酸纤维素、玻璃纤维及其他多孔聚合物等多孔材料已在
固相免疫测定中用作固体支撑物。在所谓的侧向流测定中，待测试配体存在的流体被施加
至多孔膜层的一个端并在毛细力的作用下穿过所述膜在侧向方向上流动。所述多孔膜包括
固定结合剂，所述固定结合剂能够结合配体或结合针对待检测配体的抗体。所述固定结合
剂可均匀地分布在整个膜上。然而，通常，固定结合剂定位在所述膜中的所定义测试地带或
检测地带中，往往定位在已通过接触或喷墨印刷或者其他配发技术而施加的窄测试线中。
在侧向流测试中，将具有固定结合剂的多微孔材料的薄层(膜)支撑在液体不可渗
透层上，以向脆弱的多微孔材料层提供足够的刚性。往往，具有介于约80至200μm范围内的
厚度的多微孔材料的层被支撑在液体不可渗透支撑层上(往往被称作“膜背衬(membrane
backing)”)。
此外，一种侧向流免疫测定装置(通常呈测试条形状)在侧向流动的方向上包括预
过滤垫、缀合物垫、如上所述的侧向流膜、及吸附剂垫(adsorbent pad)。为了以此种侧向流
免疫测定装置来实施测试，将含有需进行评估存在或浓度的配体或分析物的液体样本在侧
向流免疫测定装置的一端处滴落在所述预过滤垫上。所述液体样本将接着通过毛细力而依
序穿过所述缀合物垫、所述侧向流膜而迁移并最终进入所述吸附剂垫。在所述迁移期间，所
述配体或分析物将与存在于缀合物垫中的缀合物颗粒反应，并接着与已提前配发至所述膜
上而作为测试地带或检测地带的捕获分子(capture molecule)(往往为抗体)反应，所述测
试地带或检测地带通常呈与侧向流动方向正交地定向的线的形式。
在19世纪80年代开发出了第一个能够实施针对一个配体或分析物的测试的侧向
流测试条。自那时起，并未对所述测试样式实施任何重大改变，原因在于所述测试样式较便
宜且与大量生产相容。
为了适应利用一个测试条对液体样本中的多个配体或分析物(参数)进行测试的
需要，已开发出包括多于一个测试线的侧向流测试条或装置。
然而，具有多个测试线的所述侧向流测试条在测试线数目上受限(往往，最多仅可
能有7个测试线)，原因在于所述液体样本的移动速度以距原位的距离的平方减小、所述样
本的性质当在通过多个之前的测试线时常常以不可预测的方式改性、且所述样本穿过测试
条迁移得越长就越会损耗所述缀合物，进而使得发生敏感度的损失。
US 7,879,597中示出对多个配体或分析物进行测试的进一步概念，所述US 7,
879,597公开一种系统，所述系统包括多个测试单元(test cell)，所述测试单元具有定义
溶液的第一流动路径的第一吸着剂材料，定义样本的与第一流动路径有区别的第二流动路
径的第二吸着剂材料，以及具有用于辨识一个或多个配体的在第一吸着剂材料与第二吸着
剂材料的接合处定位的固定抗原或抗体或者其他配体结合分子的测试位点(test site)。
尽管在US 7,879,597中公开的所述系统容许多达8个线并排，然而所述系统仍具
有某些限制且与单一参数侧向流测试条相比生产成本高得多。
此外，为了实现待测试配体或分析物的更高敏感度，已开发出其他测试样式。在此
上下文中，研究的主要路径在于减少测试线的体积，以增大每体积单位中缀合物颗粒的数
目。
然而，由于这些膜体积及形状修改所产生的所述样本流中增大的剪切力(shear)，
导致这些尝试中没有任何一个带来显著的敏感度提高。
另外，如在涉及利用二维特征的侧向流装置的US 8,486,717中所示，难以使不同
的测试地带(线或点)处于同一侧向流装置(条)中，原因在于所述流中的第一测试地带将使
所述样本消耗过多的缀合物颗粒。此外，其他测试地带需要被放置得更远，进而使得有足够
的时间来使所述样本流再次均质化。
因此，从以上来看显而易见，在保持制造现有侧向流测试的容易度及同步提高敏
感度的同时以一个侧向流膜评估若干配体或分析物是一个困难的任务。
US 2007/0042444 A1阐述一种包含多孔载体材料的基于免疫扩散的测试装置，其
中以地带或印迹(blot)的形式施加特异结合试剂(免疫试剂(immunoreagent))，一种偶合
有第二特异结合试剂且被分别供应或预施加至所述多孔载体的可检测标记可通过所述样
本而移动，并且样本应用位点可选地设置有过滤器，所述过滤器的特征在于其在多孔载体
材料中包括通道网络，所述通道网络是通过利用激光处理蚀刻多孔载体材料而形成，这一
通道网络包括由所处理区域分离的两个或更多个通道、固定在它们中的一个或多个特异结
合试剂、放置在靠近所述样本应用位点的通道中或所述样本应用位点本身中的可选标记位
点，所述可选标记位点是以使得所述样本能够均匀地分布至每一通道中的方式放置。EP 2
031 376公开一种用于确定液体样本中一个或多个分析物的存在和/或分量(extent)的测
定装置，所述测定装置包括a)第一测定器及第二测定器，各自包括具有用于固定经标记结
合试剂的检测地带的流路径(flow-path)，其中对位于一个或两个检测地带处的经标记结
合试剂的检测指示一个或多个分析物的存在和/或分量，b)共用参考地带，c)一个或多个光
源，对所述检测地带及所述参考地带进行照明，d)一个或多个光电检测器，检测来自所述检
测地带及所述参考地带的光，这一/这些光电检测器产生信号，这一信号的幅值
(magnitude)与所检测到的光量相关，以及e)用于处理来自所述光电检测器的信号的信号
处理工具。US 2006/0246599 A1阐述一种侧向流装置，所述侧向流装置包括单一膜，所述单
一膜对呈并排关系而彼此大体平行排列以彼此独立地运作的多个免疫测定模块进行支撑，
每一模块相对于所述侧向流装置的纵轴而大体平行延伸且配置成具有与所述单一膜的第
一流体流动方向大体平行的第二流体流动方向，所述第一流体流动方向与所述侧向流装置
的所述纵轴大体平行地延伸。DE 10 2007 036 906公开一种制造用于通过薄层色谱法实施
分析的测试条的方法，其中所述测试条具有用于待分析流体的至少两个分离道，其中所述
分离道由以结构化的方式施加在载体上的多微孔材料形成，其特征在于以小于500微米的
厚度施加在载体上的多微孔材料的平坦延伸薄层是通过疏水物质的具体应用而结构化，其
中所述疏水物质在施加时是液体且穿透所述薄层，其中所述物质在所述穿透之后固化且其
中无所述物质的区形成所述分离道。US 5,998,221阐述一种用于测定样本中的分析物的工
艺，所述工艺包括提供具有至少两个道的固体支撑物，其中每一道具有用于将样本施加至
每一道的接触地带，且此外其中所述固体支撑物的所述第一道在所述固体支撑物的所述第
一道的整个长度上固定有结合物，所述结合物为用于至少所述分析物的结合物，且所述固
体支撑物的所述第二道与所述固体支撑物的所述第一道并置，且所述第二道在所述固体支
撑物的所述第二道的整个长度上固定有结合物，所述结合物为用于至少所述分析物的结合
物，且已知量的所述分析物被固定在所述在所述固体支撑物的所述第二道的整个长度上固
定的结合物上，使所述第一道的接触地带与样本及由被标以可见标记的配体构成的示踪物
(tracer)接触，使所述第二道的接触区与示踪物接触，并确定被结合在结合物的第一道及
第二道中的示踪物的可见度作为对样本中的分析物的测量。
因此，本发明下的目的是提供一种能够测试液体样本中的多个配体或分析物(参
数)、且具有提高的测定敏感度及信号强度的侧向流膜，并且提供一种对应的制造方法。
发明内容
现在已发现以上目的可通过提供在侧向流的方向上具有通过疏水分离通道而分
离的两个或更多个同构流道的多参数侧向流膜来实现，每一道包括具有结合剂的检测地带
或检测点，借此不仅可提高测定敏感度且可大幅增强侧向流免疫测定的信号强度而且能够
以一个侧向流膜来测试液体样本中的多个标志(参数)。
因此，本发明涉及一种多参数侧向流膜，所述多参数侧向流膜包括多微孔膜层，所
述多微孔膜层可支撑或不支撑在使液体穿过所述多微孔膜层侧向流动的液体不可渗透支
撑层上，
其中所述多微孔膜层在侧向流动的方向上具有两个或更多个同构流道，
其中所述两个或更多个同构流道通过疏水分离通道而分离，且
其中所述两个或更多个同构流道中的每一者包括包含结合剂的检测地带或检测
点，
其中所述两个或更多个流道(4)是同构道。
根据本发明的用以进行多参数读出的侧向流膜可有益地施加在多参数侧向流免
疫测定装置中。
在另一方面中，本发明涉及一种以上所述多参数侧向流膜在基于免疫学的测试中
的使用。
在又一方面中，本发明涉及一种制造如上所述的多参数侧向流膜的方法，所述方
法包括以下步骤：
(a)提供侧向流膜，所述侧向流膜包括支撑或不支撑在液体不可渗透支撑层上的
多微孔膜层，以使液体穿过所述多微孔膜层侧向流动，
(b)激光蚀刻所述多微孔膜层以形成疏水分离通道，进而使得在侧向流动的方向
上设置两个或更多个同构流道，以及
(c)将包含结合剂的检测地带或检测点施加在所述两个或更多个同构流道中的每
一者上。
在又一方面中，本发明涉及一种利用两个或更多个同构道的多参数侧向流测试，
所述两个或更多个同构道具有指定反应地带及位于所述反应地带上游的指定缀合物存储
地带。
附图说明
图1示出根据本发明的侧向流膜的俯视图。
图2示出根据本发明的侧向流膜在侧向流动方向上的剖视图。
图3示出处于被层叠至背衬卡(backing card)上之后且在进行切割以获得单一多
参数条之前的状态中的根据本发明的侧向流膜。作为另外一种选择，为了进行多参数读出
而结构化的膜是以卷样式进行加工。
图4A及图4B示出将根据本发明的侧向流膜与使用抗hCG抗体的尤尼赛多
(UniSart)侧向流膜进行比较的信号强度测试结果。
图5A及图5B示出样本流在所述多参数侧向流条的全部宽度上的均质性。在每一各
别道中观察可比较的信号强度。
具体实施方式
如图1至图3所示，根据本发明的多参数侧向流膜1是支撑在液体不可渗透支撑层3
上的多微孔膜层2的细长排列。多参数侧向流膜1适合于使液体在毛细力的作用下穿过多微
孔膜层2侧向流动且通常在用于对穿过多微孔膜层2而侧向流动的测试流体中的配体或分
析物进行检测的侧向流免疫测定中使用。
根据本发明，多微孔膜层2在侧向流动的方向上具有两个或更多个同构流道4，如
图1及图2中所示。
流道4的宽度并无具体限制，然而，往往介于1mm至4mm范围内，优选地介于2mm至
3mm范围内。
此外，流道4的形状并无具体限制。然而，优选地，流道4的形状选自由直道、锯齿型
道及弯曲型道组成的群组。更优选地，所述流道的形状选自由锯齿型道及弯曲型道组成的
群组，如图1(锯齿型道)及图3(弯曲型道)中所示。
根据本发明，如图1至图3中所示，流道4通过疏水分离通道5而分离，且如在图1中
作为实例示出，所述两个或更多个同构流道4中的每一者包括包含一个结合剂的检测地带
6，进而使得每一检测地带6通过其自身的流道而被供应以测试液体。在本发明的一个实施
例中，若干个流道4中的每一者可包括检测地带且所述若干个流道中的至少某些流道可包
含等同或不同的结合剂。由于所述分离，因此每一检测地带(反应地带)将接收具有完全相
同的量及相同品质的样本及缀合物溶液，此使得每一检测点6(图5)的测定敏感度及信号强
度提高。
根据本发明的优选实施例，每一检测地带6具有为介于0.5mm至3mm、优选地介于
1mm至2mm的直径或尺寸。此外，检测地带6优选地具有圆形形状，但也可呈小线形状(喷流非
接触测点设备(jetted non-contact spotting equipment))。
根据本发明的优选实施例，疏水分离通道5具有为介于0.1mm至1mm、优选地介于
0.15mm至1mm的宽度。
多微孔膜层2可由任何适合用于侧向流膜的多微孔材料制成。这类材料是所属领
域中已知的且包括硝化纤维素、尼龙、醋酸纤维素、聚醚砜(polyethersulfone，PES)、聚偏
氟乙烯(polyvinylidenfluoride，PVDF)、交联葡聚糖(cross-linked dextran)及其他多孔
聚合物。优选地，多微孔膜层2是硝化纤维素层。用于侧向流测定的硝化纤维素膜层是所属
领域中众所周知的且由互连的硝化纤维素海绵裹杆(rods-in-a-sponge)式结构构成。
液体不可渗透支撑层3是所属领域中众所周知的且经常被称作“背衬(backing)”。
合适的支撑层包含例如聚酯、聚丙烯、聚乙烯、丙烯酸(共聚)聚合物、乙烯基-丙烯酸聚合
物、聚碳酸酯、及杂多糖等聚合材料。
根据本发明的优选实施例，所述两个或更多个同构流道4中的每一者还包括位于
检测地带6下游的包含结合剂的控制地带(如图5中所示)。各别道的控制地带可包含不同的
试剂。此控制地带往往将过度地结合所有缀合物试剂或颗粒。
所述控制地带的主要作用是确保所述液体已输送至指定道中。所选择的试剂组合
将必然地引起阳性读出，而不依赖于测试地带处的结果。在图5中，举例而言，以1mg/ml的最
终浓度印刷了自兔子提纯出的抗鼠免疫球蛋白。
根据本发明的优选实施例，每一控制地带具有处于与所述测试地带相同范围(即，
介于0.5mm至3mm、优选地介于0.2mm至1.0mm)内的直径或尺寸。
为了使在检测地带6中形成的所述结合剂与配体或分析物之间的络合物可见化，
通常使用例如免疫标记等可检测标志。待分析的液体最常在流过所述侧向流膜之前首先流
过所谓的缀合物垫。所述缀合物垫包括可检测标志的可移动缀合物及检测剂，即可结合至
所述配体或分析物但与所述结合剂不同的剂。若所述待分析液体流过所述缀合物垫，则所
述缀合物结合至所述配体且所述配体/缀合物络合物随所述液体流过所述膜层。在所述膜
层中，所述配体-缀合物络合物结合至固定结合剂。所述可移动缀合物往往特异于一个分析
物。因此，在多参数测试中，若干个缀合物试剂被混合并施加在缀合物垫的整个垫宽度上。
另一选择将为在所述缀合物垫上以规则间隔喷射各别缀合物试剂。所述间隔的宽度对应于
所述流道的宽度，造成规定的道中所需缀合物的较高浓度。此选择也可因所定义区域的较
高试剂浓度而减少产生可见信号所必需的缀合物的量。作为位于所述侧向流膜上游的缀合
物垫的另外一种选择，所述侧向流膜自身可包括至少一个缀合地带，所述缀合地带包括可
检测标志的可移动缀合物以及检测剂。这类缀合地带定位在检测点上游。在此种情形中，只
有特异于检测地带上的配体的缀合物将在指定道中流动，而不会在其他道中出现任何损
失。可在此方面中使用的适合的可检测标志并无特别限制且是所属领域中已知的。它们包
括例如具有不同颜色或荧光染料的乳胶珠粒以及金色纳米颗粒。
因此，根据本发明的优选实施例，所述两个或更多个同构流道4中的每一者还包括
位于检测点6上游的至少一个缀合点，所述至少一个缀合点包含可检测标志的可移动缀合
物以及检测剂。用于沉积所述缀合物试剂的膜区域可比此处定义的同构流道稍大(0.5mm)。
根据本发明的优选实施例，所述结合剂选自由特定抗体及适配体中的蛋白质及肽
组成的群组。
本发明还涉及一种包括根据本发明的多参数侧向流膜的侧向流免疫测定装置。侧
向流免疫测定装置是所属领域中众所周知的且例如在US 2006/0205059、US 5,252,496、及
US 5,591,645中进行阐述。根据本发明的经多参数配置的侧向流膜1可在包括以直接或竞
争样式在所属领域中已知的任何适合的侧向流免疫测定装置中使用。
通常，根据本发明的多参数侧向流免疫测定装置包括反应地带，所述反应地带包
括根据本发明的经多参数配置的侧向流膜1、位于反应地带上游的样本添加地带及位于反
应地带下游的吸附地带。测试流体被添加至所述样本添加地带，所述样本添加地带通常包
括其中吸附有所述液体的过滤垫。通过毛细力的作用，所述液体自样本添加地带穿过反应
地带流动至吸附地带。所述装置可包括位于样本添加地带与反应地带之间的所谓的缀合地
带，进而使得测试液体被迫流过所述缀合地带，所述缀合地带包括缀合至与测试液体中的
相关配体结合的检测剂的可移动免疫标记或其他标志。经标记检测剂将接着结合至测试流
体中的配体且经标记配体流过反应地带并在它们可被可见化的反应地带中结合至固定结
合剂。作为另外一种选择，所述经多参数配置的侧向流膜1包括如在上文中所述的至少一个
缀合地带。
根据本发明，所述制造多参数侧向流膜1的方法包括以下步骤：
(a)提供侧向流膜，所述侧向流膜包括支撑或不支撑在液体不可渗透支撑层3上的
多微孔膜层2，以使液体穿过多微孔膜层2侧向流动，
(b)激光蚀刻多微孔膜层2以形成疏水分离通道5，进而使得在侧向流动的方向上
设置两个或更多个同构流道4，以及
(c)将包含结合剂的检测点6施加在所述两个或更多个同构流道4中的每一者上。
在本方法的步骤(a)中设置的侧向流膜是共同(common)侧向流膜，其能够以已知
的方式制造，通常通过首先设置液体不可渗透支撑层3并接着将构成多微孔膜层2的材料溶
解在适合的溶剂中而成的溶液施加在支撑层3上来制造。接着蒸发所述溶剂而获得支撑在
液体不可渗透支撑层3上的多微孔膜层2的侧向流膜。
根据本方法的步骤(b)，实施激光蚀刻多微孔膜层2以形成疏水分离通道5，进而使
得在侧向流动的方向上设置两个或更多个同构流道4。
具体而言，利用激光蚀刻来处理多微孔膜层2，进而使得自液体不可渗透支撑层3
移除多微孔膜层2的材料并形成多个同构流道4，所述多个同构流道4是通过疏水边界线5而
分离，疏水分界线5向下到达液体不可渗透支撑层3的被暴露出的疏水材料。
所述激光蚀刻工艺可例如通过使用具有皮秒脉冲的Nd：YVO4固态激光、特别是以
532nm的波长及12皮秒的脉冲长度、10mJ的脉冲能量及10kH的脉冲频率来实现。利用Nd YAG
或CO2激光的另一激光蚀刻工艺也已使得硝化纤维素膜成功结构化。
来自步骤(b)的产物可被加工成不同样式。优选实施例是卷。这种样式的另一优选
实施例是薄片(sheet)的封装体。
根据本方法的步骤(c)，利用共用技术将包含结合剂(等同的或不同的)的检测点6
施加在所述两个或更多个同构流道4中的每一者上。优选地，通过接触或喷墨印刷或者气溶
胶喷射来施加检测点6。
可选地，在又一步骤中，在检测点6的上游施加包含可检测标志的可移动缀合物以
及检测剂的缀合地带。
通过以下实例来进一步说明本发明，但本发明并不仅限于此。
实例
实例1：利用蒸发工艺制备侧向流膜
通过已建立的蒸发工艺来制造一种硝化纤维素系侧向流膜。简略来说，在不锈钢
带(stainless belt)上或在聚酯薄膜上施加硝化纤维素(3至10％(重量))与30至50％(重
量)的醇、40至60％(重量)的醋酸甲酯、及7至13％(重量)的水的共聚物混合溶液(polymer
blend solution)。铸造生产线提供挥发组分的受控蒸发工艺。所得膜被浸渍以阴离子表面
活性剂，以确保穿过全部膜厚度的是均质毛细流。接着对所述膜进行干燥，卷绕成最终的卷
并小心地检查物理及化学特性。
将即可使用的侧向流膜层叠至背衬卡(G&L精密模具切割(G&L Precision Die
Cutting))上并通过激光蚀刻而结构化，以容许进行多个各别反应及读出。接着在指定区域
处利用例如赛福莱克斯点样仪(sciFLEXarrayer)(赛伊宁(Scienion)AG，柏林)等高精密分
液器以蛋白质溶液来印刷背衬卡的膜区段。将相应的样本(奥斯龙(Ahlstrom)，等级6615)、
缀合物垫及吸附剂垫(奥斯龙；等级222)装配至背衬卡上。接着自所述背衬卡切割出包括2
个或更多个流道的最终条。
实例2：多参数侧向流测定1
制备如在实例1中般制造、层叠、并安装的一种硝化纤维素膜。利用各别流道来对
背衬卡的一半进行结构化，而不对另一半进行结构化。产生四十毫米宽的条，所述条包括6
个流道且每流道1个测试点、或者6个测试点在全部膜区域上并置但与经结构化的侧向流膜
条具有等同的位置。测试点是利用非接触式配发系统(赛福莱克斯点样仪，赛伊宁AG)而施
加且含有50nl抗-hCGα(抗人绒毛膜促性腺激素-阿尔法，阿里斯塔生物(Arista
Biological))。将抗-hCGβ-金缀合抗体(BBI国际(BBI International))溶解在100mM三羟
甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)(pH 8.0缓冲剂)中而成的溶液十五微升(μl)置于所述条的
缀合垫上。
利用包含溶解在20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂中的50mlU hCG、150mM氯化钠、
0.05％BSA(pH 8，2)的样本来培养所述以硝化纤维素膜尤尼赛多140(图4A)或尤尼赛多95
(图4B)制作的侧向流条。将所述测试条保持在竖直姿态直至液体边沿线已到达吸附剂垫的
高度的约一半为止(在10与15分钟之间)。测试点显现为暗红色。后者与经结合金缀合物的
量成比例。利用CCD照相机(韦尔萨多克(VersaDoc)，伯乐(BioRad))拍摄所述条的数码图片
并利用图像实验室(Image Lab)(图4A)对相应测试点的强度进行量化。此处报告净信号强
度并将所述净信号强度定义为绝对信号强度减去即时背景(immediate background)的强
度。
实例3：多参数侧向流测定2
除在每一流道中施加2个点(一个测试点及一个控制点)这一事实以外，如实例2中
所述般制备侧向流条。所述控制点包含兔抗鼠免疫球蛋白(1mg/ml，BBI国际)。利用尤尼赛
多CN 140(图5A)或尤尼赛多CN 95(图5B)硝化纤维素膜来进行侧向流测试。自所述背衬卡
切割出40mm宽的条并利用15μl的抗-hCGβ-金缀合抗体溶液来处理相应缀合物垫。接着利用
溶解在20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂中的25mlU hCG、150mM氯化钠、0.05％BSA(pH 8.2)来
培养所述侧向流条。如实例2中所述般记录数码图片并分析所述图像。
本申请中使用以下参考符号：
1：多参数侧向流膜
2：多微孔膜层
3：液体不可渗透支撑层
4：同构流道
5：疏水分离通道
6：检测点