一种批量合成绿色荧光纳米碳团簇的方法技术领域
本发明属于纳米材料可控合成和电子信息、生物医学工程等多交叉研究领域，具
体涉及一种批量合成绿色荧光纳米碳团簇的方法。
背景技术
碳纳米材料是一类主要由碳元素组成的纳米材料，其中包括一维碳纳米管、二维
石墨烯、石墨炔和零维的纳米金刚石、富勒烯、碳点等，具有优异的电子、光学性质等性质，
在光电二极管、光电转化、太阳能电池和生物医学等方面有着广泛的应用，并已经取得了巨
大的成功。作为家族的新成员：碳点(碳量子点)，具有光学稳定性好，耐光致漂白和良好的
生物安全性等，被用于研发新的生物成像探针，高性能纳米传感器及多纳米药物小分子和
RNA载体。
2010年，Sheila N Baker和Gary A.Baker联合在Angewandte Chemie《应用化学
(德国)》中发表了题为：荧光纳米碳点：应急纳米光(Luminescent Carbon Nanodots:
Emergent Nanolights)，系统地综述了纳米碳点的发现、制备方法、物理化学和应用，并展
望了碳点应用前景，同时也提出了碳点的制备技术和机理，尚需要进一步深入研究。经过6
年的发展，在碳点的制备方法基本上还是按照技术上没有太大的改变，单一从提高荧光量
子产率方面，主要是改善碳点表面的钝化试剂选择和掺杂(如氮掺杂、P掺杂或者表面包被
半导体层如包被TiO2或ZnS)方法，大大地提高了荧光量子产量，由硝酸氧化法制备的荧光
碳点的荧光量子产率不到0.1％提高到60％以上，这也使碳点从基础研究向实际应用方面，
推进了一步。但是碳点的发射的荧光主要还是以蓝色的荧光为主，也有少量报道可以制备
出发射绿色荧光的碳点，与蓝色的荧光碳点相比，发射绿色荧光的碳点的荧光量子产率要
低得多。
至今还没有看到关于碳团簇相关的研究论文和专利发表。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种批量合成绿色荧光纳米碳团簇
的方法，通过还原性糖或还原性小分子有机化合物作为碳前驱体，以人体所需的氨基酸、小
分子多肽和可溶性生物大分子等作为前驱体，以乙二醇或甘油为反应介质，制备较高荧光
量子产率的荧光碳团簇。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种批量合成绿色荧光纳米碳团簇的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一、以还原性有机小分子为碳纳米团簇前驱体，所述还原性有机小分子是指
还原性糖类小分子、柠檬酸或柠檬酸盐中至少一种；
优选地，所述还原性糖类小分子是指还原性单糖或双糖小分子。
优选地，所述还原性单糖是蔗糖、乳糖、麦芽糖、三碳糖、四炭糖、五碳糖中至少一
种。
步骤二、采用氨基酸和多肽或可溶性生物大分子为辅助试剂；
优选地，所述多肽是指根据合成碳点的需要，富含不饱和氨基酸的多肽小分子，自
然界存在谷胱甘肽、脑肽等活性多肽。
优选地，所述氨基酸是人体所需的二十种氨基酸，如色氨酸、谷氨酸、胱氨酸、苯丙
氨酸等，以及由这些氨基酸缩合形成的二肽或多肽小分子中至少一种。
优选地，所述可溶性生物大分子是指脱氧核糖核酸酶、唾液淀粉酶、过氧辣根酶等
中至少一种。
步骤三、将碳纳米团簇前驱体与辅助试剂混合溶于有机极性溶剂中，加入磷酸，恒
温反应一段时间，待反应液的颜色由透明转为棕色，终止反应；
优选地，所述有机极性溶剂为乙二醇或甘油。
优选地，所述反应在搅拌、加热条件下进行，所述加热温度为100～300℃，反应时
间为20～240分钟。
优选地，所述搅拌，其搅拌速度在100～1000r/min。
优选地，所述碳纳米团簇前驱体、辅助试剂和有机极性溶剂质量比为1:0.1:15～
1:20:100。
优选地，所述磷酸，其质量浓度为0.1～50％，磷酸在此过程中起到加强氧化脱水
形成碳纳米材料骨架结构的作用，加速反应进程提高荧光量子产率。
步骤四，反应后的混合溶液，离心除去杂质，逐步透析分离除去未反应的反应物和
少量单分散的碳点，经旋转蒸发浓缩和冷冻干燥处理，得到高纯荧光纳米碳团簇粉末。
优选地，所述离心，离心速度为5000～8000r/min。
优选地，所述逐步透析，所用透析袋的截留分子量为200～1500等，按照透析袋截
留分子量的顺序依次透析，即200，500，1000，1500。
优选地，所述的透析时间为12～72h。
本发明所使用的碳前驱体具有还原性，辅助试剂在反应的作用除了掺杂和钝化作
用外，它还发生了自身偶联成膜包被多个单一碳点而形成的碳纳米团簇结构作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用极其温和的条件，反应过程中无高温、高压或等离子辐射等，易于
调控制备碳纳米团簇的分子量和荧光发射光谱。
(2)本发明中所选用的反应试剂均是纯天然性的小分子或生物小分子，反应介质
是低毒性的有机极性反应试剂，不会对大气环境和水环境造成污染。
(3)本发明方法制备的荧光碳点的量子产率高达40％以上，可以通过调控物料比、
反应温度和时间，来调控颗粒直径大小。
(4)本发明方法制备的荧光碳点具有较低的生物毒性和良好的生物相容性，碳点
表面富含氨基和羧基，为进一步在生物检测、生物影像和载药治疗等方面，具有广阔的应用
前景；
(5)本发明方法分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化批
量生产。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、
目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例制备的碳纳米团簇TEM等图，其中：a为碳纳米团簇高分辨透射
电镜图(TEM)；b为图a内选取内碳纳米团簇内单个碳点的超高分辨TEM和指纹衍射图谱；
图2为本发明实施例制备的碳纳米团簇紫外吸收光谱等图，其中：a为碳纳米团簇
与单一碳点的紫外吸收光谱；b为碳纳米团簇与单一碳点的荧光发射光谱图，内嵌的是手持
式紫外灯照射下的荧光照片；
图3为本发明实施例制备的碳纳米团簇红外吸收光谱等图，其中a为碳纳米团簇傅
立叶红外吸收光谱；b为碳纳米团簇与单一碳点的荧光寿命图谱以及二阶指数拟合曲线和
数据表；
图4为碳纳米团簇与单一碳点的细胞毒性图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术
人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术
人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明
的保护范围。
本发明提供了一种制备了荧光碳团簇的新方法，其荧光相对于单一的荧光碳点的
荧光量子产率高，荧光从单个荧光碳点荧光相比发生了红移，制备方法简单，无需特殊的设
备和仪器，无高温高压，可以直接制备在纯水中单一分散的荧光团簇。通过对形貌、表面化
学性质、荧光量子产量、寿命和荧光光谱性质表征，证实了本发明合成的荧光碳点团簇的物
理和化学性质，其良好的荧光性能和良好的生物安全性，可以用于生物成像、作为生物载体
等方面应用前景。
实施例1
本实施例涉及一种碳纳米团簇新制备方法，所述方法包括以下步骤：
以葡萄糖为碳前驱体，亮氨酸为辅助试剂，在乙二醇介质中反应制备荧光碳纳米
团簇，具体为：
(1)在室温下，称取0.5g葡萄糖和0.5g亮氨酸，在磁力搅拌下溶解于预先放入25mL
乙二醇圆底烧瓶中，在混合液中加入浓磷酸，配成质量比15％磷酸乙二醇溶液，待反应物完
成溶解后，加热回流反应，温度保持在140℃保持反应60min后，反应溶液的浓度从无色透明
转成深棕色溶液，停止反应，冷却纯化分离。
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液5000r/min离心，弃去沉淀。
(3)将步骤(2)中的上清液，经截留分子量为1000透析袋中，置于大量的超纯水中，
在室温、磁力搅拌下，透析除去未反应的小分子和溶剂，透析期间采用间隔1h，2h，3h，4h等
换超纯水，透析时间为48h，收集6小时后透析袋外水溶液中单一碳点，经旋蒸蒸发浓缩后，
经冷冻干燥后，溶于二次水中定容待测。
(4)收集步骤(3)中透析袋中的碳纳米团簇，经旋蒸蒸发浓缩，冷冻干燥定容待用。
(5)采用高分辨TEM、荧光光谱、紫外吸收光谱等技术，表征碳点的表面相貌和光谱
性质，通过积分球测试不同粒径大小碳点的绝对荧光量子产量。
实施例2
以柠檬酸为碳前驱体，谷胱甘肽为辅助试剂，在乙二醇介质中反应制备荧光碳纳
米团簇，具体为：
(1)在室温下，称取1g柠檬酸和0.5g谷胱甘肽，在磁力搅拌下溶解于预先放入25mL
乙二醇圆底烧瓶中，在混合液中加入浓磷酸，配成质量比5％磷酸乙二醇溶液，待反应物完
成溶解后，加热回流反应，温度保持在160℃保持反应80min后，反应溶液的浓度从无色透明
转成深棕色溶液，停止反应，冷却纯化分离。
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液8000r/min离心，弃去沉淀。
(3)将步骤(2)中的上清液，经截留分子量为500透析袋中，置于大量的超纯水中，
在室温、磁力搅拌下，透析除去未反应的小分子和溶剂，透析期间采用间隔1h，2h，3h，4h等
换超纯水，透析时间为48h，收集6小时后透析袋外水溶液中单一碳点，经旋蒸蒸发浓缩后，
经冷冻干燥后，溶于二次水中定容待测。
(4)收集步骤(3)中透析袋中的碳纳米团簇，经旋蒸蒸发浓缩，冷冻干燥定容待用。
(5)采用高分辨TEM、荧光光谱、紫外吸收光谱等技术，表征碳点的表面相貌和光谱
性质，通过积分球测试不同粒径大小碳点的绝对荧光量子产量。
实施例3
以柠檬酸为碳前驱体，过氧辣根酶为辅助试剂，在甘油介质中反应荧光碳纳米团
簇，具体为：
(1)在室温下，称取1g柠檬酸和0.25g过氧辣根酶，在磁力搅拌下溶解于预先放入
25mL乙二醇圆底烧瓶中，在混合液中加入浓磷酸，配成质量比20％磷酸乙二醇溶液，待反应
物完成溶解后，加热回流反应，温度保持在180℃保持反应120min后，反应溶液的浓度从无
色透明转成深棕色溶液，停止反应，冷却纯化分离。
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液7000r/min离心，弃去沉淀。
(3)步骤(2)中的上清液，经截留分子量为1500透析袋中，置于大量的超纯水中，在
室温、磁力搅拌下，透析除去未反应的小分子和溶剂，透析期间采用间隔1h，2h，3h，4h等换
超纯水，透析时间为48h，收集6小时后透析袋外水溶液中单一碳点，经旋蒸蒸发浓缩后，经
冷冻干燥后，溶于二次水中定容待测。
(4)收集步骤(3)中透析袋中的碳纳米团簇，经旋蒸蒸发浓缩，冷冻干燥定容待用。
(5)采用高分辨TEM、荧光光谱、紫外吸收光谱等技术，表征碳点的表面相貌和光谱
性质，通过积分球测试不同粒径大小碳点的绝对荧光量子产量。
实施例4
以实施例1制备得到的单一碳点和碳纳米团簇，以MTT法研究碳纳米团簇的生物安
全性。MTT即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商用名为：噻唑蓝是一种黄色
颜料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒
(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此可以用来鉴别出细胞的生理活性。具
体过程：
1.接种细胞：本实验选择是人胃上皮细胞GES-1细胞，购置于中科院细胞库。细胞
培养在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Hyclone公司)上培养，培养基中用含10％胎小
牛血清，1％的抗生素。培养箱内的环境为37℃(5％CO2)。培养液配成单个细胞悬液，接种到
96孔板，接孔密度为5×103细胞/孔，每孔用培养液定量体积100ul。
2:培养细胞：上述培养条件下，培养过夜，用浓度梯度纳米颗粒与这些细胞混合孵
育24小时(避光，37℃，5％CO2)。
3.显色：除去上清液，将细胞用0.01M PBS洗涤一次。将150μL DMEM和15μL的MTT溶
液(浓度5mg/ml，pH 7.4)加入到每个孔中后在37℃再孵育4小时。之后，去除含MTT的培养
基，每孔加入150μL二甲基亚砜，室温下，震荡10min充分摇匀，以溶解难溶性紫蓝色结晶物
甲瓒晶体。
4：比色：用标准酶标仪(Scientific Multiskan MK3,thermo,USA)记录570nm每孔
的吸光度。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(实验组OD490nm/对照组的OD490nm)×
100％，设对照组细胞的存活率为100％。
图例说明：
图1中a和b为实施例1备的碳纳米团簇高分辨透射电镜图，从中可以看出，碳纳米
团簇的直径为20～35nm颗粒，图1b给出了一个团簇里所包含的单个碳点的个数和晶格衍射
指纹谱；
图2中a是实施例1制备的单分散碳点和碳纳米团簇的紫外吸收光谱，从图可以看
到碳纳米团簇的紫外吸收有明显的红移现象；
图2中b是实施例1方法制备的单分散碳点和碳纳米团荧光发射光谱，单个碳点主
要是发射蓝色荧光，发射光峰为460nm，激发光为370nm，而纳米团簇主要发射绿色荧光，发
射峰为525nm，激发光为410nm，同时发射光的强度有所增强。
图3中a为实施例1中制备的两种碳纳米材料的傅立叶红外吸收光谱。从图谱上可
以看到O-H弹性振动在3400cm-1，N-H弹性振动出现在2953cm-1主峰区，C＝O伸缩振动峰在
1733cm-1处。C-O/C-N键的弯曲振动和C-O-C键的伸缩峰分别出现在1383cm-1and 1114cm-1
处。证实合成的荧光碳纳米团簇表面主要有羧基，并有氮掺杂到碳纳米团簇中，也是其荧光
增强的主要原因之一。
图3中b是实施例1制备的单分散碳点和碳纳米团簇的荧光寿命以及拟合曲线和数
据列表(内嵌)。两种纳米颗粒的荧光寿命一致，t1可高达131ns，t2为19ns均说明了具有较
长的荧光寿命。
图4实施例1中制备的单分散性碳点和碳纳米团簇的生物细胞毒性，加入高达400μ
g/ml，均没有发现细胞毒性，证实了本发明制备的荧光碳纳米团簇具有较高的生物安全性。
表1给出了采用同样的方法，对比了反应物中不同的辅组合成试剂和H3PO4介质，得
到的荧光碳点的荧光量子产率，从表可以得到采用加入色氨酸和磷酸获得荧光量子产率最
高。
表1：同一批次获得的单一荧光碳点和荧光碳纳米团簇的绝对量子产率(积分球
法)
碳点
绝对量子产率(％)
绝对误差(％)
相对误差(％)
Leu-P-Cdots
28.24
1.208
0.0128
Leu-P-CNC
32.18
7.330
0.6251
GSH-P-Cdots
9.574
4.168
0.4352
GSH-P-CNC
16.24
5.123
0.3284
HRP-P-Cdots
12.43
3.458
0.2849
HRP-P-CNC
22.15
6.471
0.5271
注：Leu为亮氨酸，GSH为谷胱甘肽，HRP为过氧辣根酶，CNC为碳纳米团簇,Cdots为
单一碳纳米点。
本发明可实现一步合成批量荧光团簇，且无需进一步钝化处理，制备的碳纳米团
簇的荧光量子产率高于同批次制备单一碳点的荧光量子产率；通过控制反应温度、反应物
的物料比等调控荧光碳点的荧光发射波长；发射波段可从近紫外到橙色荧光碳点；制备过
程简单，可操作性强，无需特殊设备和无污染，制备的荧光碳纳米团簇表面富含羧基，为进
一步在生物成像、生物检测等方面应用提供良好的条件。
综上所述，本发明提供了一种制备碳纳米团簇的新方法，采用乙二醇作为反应介
质，以小分子有机物为碳前驱体，加入氨基酸和磷酸辅助试剂，制备碳纳米团簇。此方法具
有操作安全、无需特殊的设备，可重复性强、快捷方便、生物安全性好等优点，在一般实验室
均能完成，易于规模化和推广。碳点和碳纳米团簇在水中单一分散，表面富含羧基基团，为
制备生物纳米探针提供便利，有望在生物标记、疾病探测，药物输送和缓释载体等实现影像
介导下的综合治疗等方面，具有广阔的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述
特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影
响本发明的实质内容。