胡黄连总苷提取物在制备用于预防和治疗脂肪肝药物中的用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010543645.1	申请日：	2010.11.15
公开号：	CN102462772A	公开日：	2012.05.23
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):A61K 31/7048变更事项:专利权人变更前:天津药物研究院变更后:天津药物研究院有限公司变更事项:地址变更前:300193 天津市南开区鞍山西道308号变更后:300193 天津市南开区鞍山西道308号\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/80申请日:20101115\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K36/80; A61P1/16	主分类号：	A61K36/80
申请人：	天津药物研究院
发明人：	侯文彬; 赵专友; 周福军; 徐旭; 单淇; 张新鑫; 华洁
地址：	300193 天津市南开区鞍山西道308号
优先权：
专利代理机构：	北京泛华伟业知识产权代理有限公司 11280	代理人：	郭广迅
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内容摘要

本发明提供一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和/或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤：以浓度为0～95％(体积/体积)的C1-C5脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的C1-C5脂肪醇后过滤；滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为0～30％(体积/体积)的C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去；以浓度为40～100％(体积/体积)的C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。本发明制备的胡黄连总苷提取物可以制成药物用于预防和/或治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，以及急性脂肪肝或慢性脂肪肝，进而防止肝纤维化的形成。

权利要求书

1：一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤： (1) 以浓度为 0 ～ 95％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的 C1-C5 脂肪醇后过滤； (2) 滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为 0 ～ 30％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去； (3) 以浓度为 40 ～ 100％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。
2：根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于，所述步骤 (1) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液的浓度为 0 ～ 30％ ( 体积 / 体积 )。
3：根据权利要求 1 或 2 所述的用途，其特征在于，所述步骤 (2) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液为 0 ～ 20％ ( 体积 / 体积 )。
4：根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的用途，其特征在于，所述步骤 (3) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液为 40 ～ 60％ ( 体积 / 体积 )。
5：根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的用途，其特征在于，所述大孔吸附树脂选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯型极性或非极性大孔吸附树脂中的一种或多种。
6：根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的用途，其特征在于，所述提取的方法选自渗漉、回流和浸泡中的一种或多种，优选为渗漉。
7：根据权利要求 1 至 6 中任一项所述的用途，其特征在于，按所述胡黄连总苷提取物的总重量计，所述胡黄连总苷提取物中，胡黄连总苷的含量不低于 60％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ的含量不低于 21％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ的含量不低于 13％ ( 重量 / 重量 ) ；优选地，所述胡黄连总苷提取物还包含胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
8：根据权利要求 1 至 7 中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物为口服剂型或注射剂型。
9：根据权利要求 8 所述的用途，其特征在于，所述口服剂型为片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或口服液；所述注射剂型为水针剂或粉针剂。
10：根据权利要求 1 至 9 中任一项所述注射剂型，其特征在于，所述脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝，或者所述脂肪肝为急性脂肪肝或慢性脂肪肝；所述脂肪肝的相关疾病为脂肪肝引起的肝纤维化。

说明书

胡黄连总苷提取物在制备用于预防和治疗脂肪肝药物中的用途
    技术领域本发明属于中药领域，涉及一种胡黄连总苷提取物的用途，具体涉及一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝药物中的用途。
     背景技术肝脏是脂肪代谢的重要器官。正常情况下，脂肪重量占肝脏总重量的 3％～ 5％，正常人每 100g 肝湿重含 4 ～ 5g 脂类，其中磷脂占 50％以上，甘油三酯占 20％，游离脂肪酸占 20％，胆固醇约 7％，其余为胆固醇脂等。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的 5％，或组织学上每单位面积可见 1/3 以上肝实质脂肪化时即称为脂肪肝。脂肪肝的发病机制至今尚未完全明确，一般认为肝细胞合成甘油三酯及分泌低密度脂蛋白之间的不平衡是形成脂肪肝的主要原因。
     脂肪肝是破坏肝功能的头号杀手，至今仍为欧美等发达国家肝病致残和死亡的首要病因，也已成为第一大肝病，患者多达约一亿两千万，其作为一种世界性的常见病、多发病，严重危害人类的身心健康和生活质量，并影响人们发挥工作效率。
     临床根据发病的缓急程度将脂肪肝分为急性和慢性两大类。急性脂肪肝见于药物中毒、妊娠晚期、 Reye 综合症等，其临床表现及预后类似于急性或亚急性重症病毒性肝炎，若治疗及时一般不留后遗症；慢性脂肪肝的形成一般与酒精和代谢综合征 ( 糖尿病、高脂血症和肥胖等 ) 有关，因此又可分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。
     既往认为脂肪肝仅为良性病变，进展缓慢或不进展。但近年的研究发现，酒精性脂肪肝患者中脂肪性肝炎的发病率为约 40％，脂肪性肝硬化的发病率达 50％以上；另外， 20％的非酒精性脂肪肝发展为脂肪性肝纤维化，进而恶化为肝硬化，其中 30％～ 40％的患者死于这些肝相关性疾病，部分发生亚急性肝衰竭和肝细胞肝癌。
     目前，国内外尚无专门治疗脂肪肝的特效药物，临床上多采用降脂类药物与保肝类药物联合用药。这些药物多是针对脂肪肝的某个环节或部分的发病机理起作用，缺乏治疗脂肪肝的特异性。有些调血脂药虽然对脂肪肝有短期疗效，但影响肝功能，使血脂更集中于肝脏进行代谢，增加肝脏负担，长期服用具有潜在的肝毒性，反而会加重脂肪肝的病情。鉴于缺乏治疗脂肪肝的特效药物，因此从中药中寻找新的脂肪肝治疗药物已经成为近年来中药新药研究的热点之一。
     中药胡黄连是玄参科 (Scrophulariaceae) 胡黄连 (Picrorhiza scrophulariiflora Pennell) 的干燥根茎。对胡黄连的化学研究发现，胡黄连主要含有环烯醚萜类、酚苷类、有机芳香酸类成分。药理和临床研究表明，胡黄连以环烯醚萜类为主的苷类成分具有明确的保肝、抗肝损伤作用。近年的研究还表明，胡黄连苷 II 可通过改善肝功能、抑制脂质过氧化反应、下调 TGF-β1 和 I 型胶原 mRNA 以及蛋白表达而抑制肝纤维化的形成。
     发明内容因此，本发明的目的在于基于中药胡黄连总苷提取物来提供一种有效治疗脂肪肝的新型药物。
     用于实现上述目的的技术方案如下：
     一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤：
     (1) 以浓度为 0 ～ 95％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的 C1-C5 脂肪醇后过滤；
     (2) 滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为 0 ～ 30％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去；
     (3) 以浓度为 40 ～ 100％ ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5 脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。
     在上述用途中，优选地，步骤 (1) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液的浓度为 0 ～ 30％ ( 体积 / 体积 )。优选地，步骤 (2) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液为 0 ～ 20 ％ ( 体积 / 体积 )。优选地，步骤 (3) 中采用的 C1-C5 脂肪醇水溶液为 40 ～ 60％ ( 体积 / 体积 )。
     在上述用途中，大孔吸附树脂可以选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯型极性或非极性大孔吸附树脂中的一种或多种。
     在上述用途中，提取的方法可以选自渗漉、回流和浸泡中的一种或多种，优选为渗漉。
     在上述用途中，按胡黄连总苷提取物的总重量计，所述胡黄连总苷提取物中，胡黄连总苷的含量不低于 60％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ的含量不低于 21％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ的含量不低于 13％ ( 重量 / 重量 )。优选地，所述胡黄连总苷提取物还包含胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
     在上述用途中，药物可以为口服剂型或注射剂型。口服剂型可以为片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或口服液。注射剂型可以为水针剂或粉针剂。
     在上述用途中，脂肪肝可以为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝；也可以为急性脂肪肝或慢性脂肪肝。脂肪肝的相关疾病具体为脂肪肝引起的肝纤维化。
     本发明经研究发现经本发明的提取方法制得的胡黄连总苷提取物中胡黄连总苷含量高达 60％ ( 重量 / 重量 ) 以上，其中富含环烯醚萜类等有效成分。采用急、慢性脂肪肝动物模型的研究表明，该胡黄连总苷提取物具有清肝脂、降血脂、降低转氨酶、清除自由基、抗脂质过氧化、增强免疫、保护肝脏的作用。因此，以本发明的提取方法制备的胡黄连总苷提取物可以制成药物，用于预防和 / 或治疗治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，以及急性脂肪肝或慢性脂肪肝，进而防止肝纤维化的形成。
     与现有技术相比，本发明至少存在以下有益效果：
     1、本发明采用水或低醇提取，并采用大孔树脂法进行纯化，得到的总苷提取物的成分及含量与现有技术不同，本发明胡黄连总苷提取物中，总苷含量≥ 60 ％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ≥ 21％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ≥ 13％ ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇；现有技术主要为胡黄连环烯醚萜总苷提取物，其中，胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ HPLC 含量总计≥ 20％ ( 重量 / 重量 ) ；
     2、脂肪肝中肝脂大量堆积的成因包括肝脂输出相对不足和肝脂输出绝对不足。肝脂输出相对不足是由进入肝脏的血液中脂肪酸增多或肝脏自身合成脂肪酸增多、加速肝脏合成 TG 所致，药效研究中通常采用高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型；与现有技术相比，本发明除了选择上述模型对胡黄连总苷提取物进行药效研究外，还针对脂肪肝的另一成因，即肝脂输出绝对不足，设计了乙硫氨酸诱发的急性脂肪肝模型和 CCl4 诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型，分别反映了肝脏 VLDL 合成、分泌障碍及脂肪肝氧化抑制。根据脂肪肝发病的多种成因，设计了多种动物模型，从而综合考察了胡黄连总苷提取物对脂肪肝的治疗作用。
     3、本发明在乙硫氨酸诱发的小鼠急性脂肪肝模型中，连续 3 次灌胃给予胡黄连总苷提取物 15、 30、 60mg/kg ；其他试验给药剂量 20、 40、 80mg/kg，胡黄连总苷提取物治疗脂肪肝的大鼠的起效剂量为 20mg/kg/ 天，有效剂量范围为 40 ～ 80mg/kg/ 天。
     4、尽管现有技术中有将胡黄连提取物用于治疗和预防肝病的报道，但是其中胡黄连提取物的成分和含量与本发明不同，而且由于肝病的种类很多，不同肝病的形成机理差别很大，对于不同形成机理的肝病需要针对性使用不同的药物，本发明通过大量研究发现，本发明制备的特定组成的胡黄连提取物在治疗脂肪肝中效果尤佳。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
     实施例 1
     将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 水浸泡 2 小时，装入渗漉筒，以水渗漉，收集 240L 渗漉液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 D101 大孔吸附树脂，以水洗去杂质，再以 60％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 2.8 公斤，其中总苷含量达 70％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ为 22.5％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ为 13.9％ ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
     取上述胡黄连总苷提取物 1.2 公斤，加淀粉 1.6 公斤，微晶纤维素 400g，制粒，装胶囊，每粒含总苷 30mg。
     实施例 2
     将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 的 30％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液浸泡 12 小时，装入渗漉筒，以 30％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液渗漉，收集 240L 渗漉液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 AB-8 大孔吸附树脂，以水洗去杂质，再以 50％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 2.6 公斤，其中总苷含量达 75％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ为 22.8％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ为 14.6％ ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
     取上述胡黄连总苷提取物 1.1 公斤，加淀粉 1.6 公斤，微晶纤维素 400g，制粒，压片，每片含总苷 30mg。
     实施例 3
     将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 的 20％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液回流 3 次，每次 2 小时，每次 80L，合并提取液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 HPD100
     大孔吸附树脂，以水及 20 ％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗去杂质，再以 40 ％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 3 公斤，其中总苷含量达 60％ ( 重量 / 重量 )。胡黄连苷Ⅱ为 21.6％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ为 13.5％ ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷Ⅳ、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
     实施例 4
     将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 240L 的 10％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液浸泡 24 小时，减压浓缩浸泡液，至 1g 药材 /mL。通过 NKA 大孔吸附树脂，以 10％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗去杂质，再以 50％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 1 公斤，其中总苷含量达 65％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅱ为 21.9％ ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷Ⅰ为 13.7％ ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷Ⅲ、胡黄连苷 Ⅳ、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。
     试验例
     试验的目的在于验证胡黄连总苷提取物在预防和 / 或治疗脂肪肝中的效果。为了证明本发明的胡黄连总苷提取物的治疗效果和安全性，其药效学、药理学、毒理学研究过程及结果如下：
     一、主要药效学试验
     1. 对乙硫氨酸诱发的急性脂肪肝模型的影响
     ICR 小鼠 70 只，雄性，体重 20.3±1.2(18.2 ～ 22.5)g，随机分为 7 组，每组 10 只。采用乙硫氨酸制备急性脂肪肝模型，乙硫氨酸能抑制肝脏合成载脂蛋白，从而使脂质代谢中甘油三酯 (TG) 运出肝脏出现障碍，导致 TG 蓄积于肝脏而形成脂肪肝。小鼠禁食过夜后，除正常对照组灌服蒸馏水外，其余各组灌服 DL- 乙硫氨酸 (250mg/kg， 20mL/kg) 造模， 1h 后，正常对照组和模型对照组灌服 0.5％ (g/ml)CMC，受试药组灌服实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 15、 30、 60mg/kg/ 次，阳性药物组分别灌服强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 1700、 100mg/kg/ 次 ( 均相当于临床日用量的 3 倍 )，给药体积均为 10ml/kg。每日给药 2 次，共给药 3 次。于末次给药后 1h 处死小鼠，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比＝ 1 ∶ 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)。结果如表 1 所示。
     表 1 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响
     **△△ △△△ * 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05，P ＜ 0.01。
     结论，在乙硫氨酸诱发的小鼠急性脂肪肝模型中，连续 3 次灌胃给予胡黄连总苷提取物 15、 30、 60mg/kg 治疗后，可显著降低肝脏 TG，使肝脏升高的 TG 分别下降了 15.7％ (P ＞ 0.05)、 24.7％ (P ＜ 0.05)、 29.6％ (P ＜ 0.01)。胡黄连总苷提取物 15mg/kg 与强肝颗粒 1700mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 30mg/kg 与凯西来 100mg/kg 的作用相当。
     2. 对高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型的影响
     SD 大鼠 70 只，雄性，体重 211±5(202 ～ 221)g。除正常对照组饲喂普通饲料外，其余大鼠饲喂高脂饲料制备慢性脂肪肝模型。通过大量摄入外源性脂肪酸使进入肝脏的脂肪酸增加，引起肝细胞缓慢脂变，最终形成与临床高脂蛋白血症所致的脂肪肝相似的脂肪肝模型。高脂饲料配方为 5％ ( 重量 / 重量 ) 猪油、 2％ ( 重量 / 重量 ) 胆固醇、 0.5％ ( 重量 / 重量 ) 胆盐、 0.2％ ( 重量 / 重量 ) 甲基硫氧嘧啶和 92.3％ ( 重量 / 重量 ) 普通饲料。造型 8 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对照组灌服 0.5％ (g/ml)CMC ；受试药组灌服实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 20、 40、 80mg/kg ；阳性药组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。
     给药前及末次给药后 1h 动物眼眶取血 1ml，制备血清，测定血清甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)。结果如表 2 和表 3 所示。
     处死动物，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比＝ 1 ∶ 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定 TG、 TC。结果如表 4 所示。
     表 2 胡黄连总苷提取物对血清 TG、 TC 的影响
     △△ △△△ * 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.01 ； P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05 ； ** P ＜ 0.01。
     表 4 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响△△△ * 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05。
     结论：饲喂高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20、 40、 80mg/kg 治疗 30 天能有效清除肝内及血液中的脂肪，使肝脏升高的 TG 分别下降了 15.2％ (P ＞ 0.05)、 37.8％ (P ＜ 0.05)、 72.8％ (P ＜ 0.01) ；使肝脏升高的 TC 分别下降了 21.7％ (P ＞ 0.05)、 24.1％ (P ＜ 0.05)、 24.8％ (P ＜ 0.05) ；使血清升高的 TC 分别下降了 45.3％ (P ＞ 0.05)、 66.5％ (P ＜ 0.05)、 77.1％ (P ＜ 0.01) ；使血清升高的 LDL-C 分别下降了 39.5％ (P ＜ 0.05)、 55.4％ (P ＜ 0.01)、 57.3％ (P ＜ 0.01) ；使血清下降的 HDL-C/LDL-C 分别上升了 0.7 ％ (P ＞ 0.05)、 30.1 ％ (P ＜ 0.05)、 30.8 ％ (P ＜ 0.01) ；并能减轻肝细胞脂肪变性程度。胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。
     3. 对酒精 + 高脂诱发的慢性脂肪肝模型的影响
     SD 大鼠 70 只，雄性，体重 212±6(200 ～ 223)g。除正常对照组灌服 0.5％ (g/ml) CMC 外，其余大鼠每天灌服造型乳液 15ml/kg，用以制造与人类的饮食结构相似的慢性脂肪肝模型。乙醇具有肝毒性，可抑制脂肪酸 β 氧化，高脂可增强乙醇对肝脏的损伤。造型乳液比例为 60％ ( 体积 / 体积 ) 乙醇 10ml/kg、胆固醇 1g/kg、猪油 5g/kg。造型第 8 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对照组灌服 0.5％ (g/ml)CMC ；受试药组灌服实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 20、 40、 80mg/kg ；阳性药物组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。
     于给药前动物眼眶取血 1ml，制备血清，测定 TG、 TC。末次给药后 1h 取血测定 TG、 TC、谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)。结果如表 5 和表 6 所示。
     处死动物，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比＝ 1 ∶ 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定 TG、 TC。结果如表 7 所示。另取肝组织，以黄嘌呤氧化酶法测定 SOD，以 TBA 法测定 MDA，以样本碱水解法测定羟脯氨酸含量。结果如表 8 所示。
     表 5 胡黄连总苷提取物对血清 TG、 TC 的影响△△△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01 ； *** P ＜ 0.001。
     表 6 胡黄连总苷提取物对血清 ALT、 AST 的影响
     △ △△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。
     表 7 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响
     △△△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。表 8 胡黄连总苷提取物对肝脏 SOD、 MDA 的影响
     △△△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.01 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。
     结论，酒精 + 高脂诱发的慢性脂肪肝模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20、 40、 80mg/ kg 治疗 30 天能清除肝内及血液中的脂肪，使肝脏升高的 TG 分别下降了 13.3％ (P ＞ 0.05)、 40.2 ％ (P ＜ 0.05)、 76.1 ％ (P ＜ 0.01) ；使肝脏升高的 TC 分别下降了 2.3 ％ (P ＞ 0.05、 22.6％ (P ＞ 0.05)、 60.5％ (P ＜ 0.05) ；使血清升高的 TG 分别下降了 79.2％ (P ＜ 0.05)、 77.8％ (P ＜ 0.05)、 93.1％ (P ＜ 0.01) ；使血清升高的 TC 分别下降了 47.7％ (P ＞ 0.05)、
     56.8％ (P ＜ 0.05)、 81.2％ (P ＜ 0.05) ；能改善肝脏功能，降低转氨酶，使血清升高的 ALT 分别下降了 69.4％ (P ＞ 0.05)、 77.6％ (P ＜ 0.05)、 83.6％ (P ＜ 0.05) ；使血清升高的 AST 分别下降了 82.9％ (P ＜ 0.05)、 97.9％ (P ＜ 0.01)、 95.7％ (P ＜ 0.01) ；提高 SOD 活性，减少 MDA 含量。胡黄连总苷提取物 20 ～ 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。
     4. 对 CCl4 诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型的影响
     SD 大鼠 70 只，雄性，体重 154±10(141 ～ 177)g。除正常对照组颈部皮下注射中性菜油外，其余大鼠皮下注射 40％ ( 体积 / 体积 )CCl4 中性菜油溶液。CCl4 在肝内经微粒体细胞色素氧化酶 P450 激活为自由基 CCl3-，导致肝微粒体的脂质过氧化，破坏肝细胞线粒体结构及功能，使其对脂肪的氧化能力降低，损伤肝细胞内质网，使脂蛋白的合成减少。注射首剂量为 0.5ml/kg 体重，以后 0.2ml/100g 体重， 2 次 / 周。造型 7 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对照组灌服 0.5％ (g/ml)CMC ；受试药物组灌服由实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 20、 40、 80mg/kg ；阳性药物组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。给药前及末次给药后 1h 动物眼眶取血 1ml，制备血清，测定血清谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)。结果如表 9 所示。
     处死动物，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比＝ 1 ∶ 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定 TG、 TC。结果如表 10 所示。
     另取肝组织，以黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 (SOD)，以 TBA 法测定丙二醛 (MDA)，以样本碱水解法测定羟脯氨酸含量。结果如表 11 所示。
     再取 1cm×1cm×0.5cm 肝右叶浸入福尔马林液中固定， HE 染色。Masson 三色染色观察大鼠肝脏胶原组织 ( 染色胶原纤维呈蓝色 ) 沉积等变化。胶原纤维面积百分比＝胶原纤维面积 / 肝组织面积 ×100％，结果如表 12 所示。
     表 9 胡黄连总苷提取物对血清转氨酶的影响
     △△△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05 ； P ＜ 0.01。表 10 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响
     △△△ * 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05。表 11 胡黄连总苷提取物对肝脏 SOD、 MDA 的影响△△ △△△ * 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.01、 P ＜ 0.001 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05， ** P ＜ 0.01。
     表 12 胡黄连总苷提取物对肝纤维化的影响
     △△△ * ** 注： 1. 与正常组比较， P ＜ 0.01 ； 2. 与模型组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01。
     结论： CCl4 诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20、 40、 80mg/ kg 治疗 30 天能清除肝内脂肪，使肝脏升高的 TG 分别下降了 7.0％ (P ＞ 0.05)、 35.8％ (P ＜ 0.05)、 38.5％ (P ＜ 0.05) ；能改善肝脏功能，降低转氨酶，使血清升高的 ALT 分别下降了 14.0％ (P ＞ 0.05)、 23.4％ (P ＜ 0.05)、 42.0％ (P ＜ 0.01) ；使血清升高的 AST 分别下降了
     29.6％ (P ＞ 0.05)、 47.0％ (P ＜ 0.05)、 59.1％ (P ＜ 0.01) ；并能提高 SOD 活性，减少 MDA 含量。胡黄连总苷提取物 20 ～ 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40 ～ 80mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。
     综上所述，胡黄连总苷提取物治疗脂肪肝的大鼠的起效剂量为 20mg/kg/ 天，有效剂量范围为 40 ～ 80mg/kg/ 天。药理作用包括清肝脂、降血脂、降低转氨酶、抗脂质过氧化、清除自由基、保护肝脏、增强免疫等作用，能通过多个环节有效地治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，防止肝纤维化。
     二、一般性药理研究
     一般性药理研究未发现药物对血液循环系统和呼吸系统的明显毒性。也未见对动物平衡运动能力的影响，但在 30、 270mg/kg 剂量下与戊巴比妥协同，对睡眠有一定促进作用。
     三、急性毒性试验
     小鼠单次静脉注射不同剂量的胡黄连总苷提取物后，药后部分动物出现即刻短暂的抽搐等毒性症状，各剂量组小鼠均出现药后俯卧和活动减少等症状。除最低剂量组 0.70g/kg 外，其余各剂量组动物均出现死亡，并随剂量增大而增多，死亡动物分布于 1 小时内，且无性别差异。死亡和活杀小鼠剖检脏器组织均未见明显异常。药后存活动物 24h 症状基本消失，毒性反应程度与剂量呈正相关；药后存活动物在观察期内体重增长基本正常。小鼠单次静脉给予一定剂量的胡黄连总苷提取物后具有明显的毒性反应，并导致动物死亡，用 Bliss 法计算 LD50 为 1.09g/kg(95％可信限： 0.98g/kg ～ 1.21g/kg)。灌胃给药后， 12.5g/kg 剂量组动物在药后 14 天的观察期内，动物平均体重增长明显低于同期对照组 (p ＜ 0.05 或 p ＜ 0.01)，尤其是药后 1 周内个别动物出现体重负增长； 10.0g/kg 剂量组动物在药后 14 天的观察期内，体重增长基本正常，与对照组比较均无显著性差异 (p ＞ 0.05)。结果提示，小鼠灌胃给予 10.0g/kg 为最大无毒反应剂量。
     四、长期毒性试验
     大鼠连续灌胃给予 50、 150 和 450mg/kg 的胡黄连总苷提取物 6 个月，在给药期和恢复期内观察动物的一般反应、进食情况、测定动物的体重，给药 3 个月、 6 个月和恢复期 1 个月结束时检测血液学指标、血液生化指标、系统尸检、脏器系数和组织病理学等指标。结果发现，高剂量组，在给药期间雄性及雌性动物的体重增长缓慢、总胆红素轻微升高；另外，高剂量组雌性动物的网织红细胞呈轻微升高及肾脏器系数出现轻微增大趋势，除上述异常指标外，其余各项检测指标均未发现与药物相关的明显改变。中剂量组，给药期间除雄性动物的体重增长缓慢，及雌性动物的总胆红素有轻微升高外，其余检测指标均未见与药物相关的明显变化。低剂量组，给药期间的动物各项检测指标均未发现与药物相关的毒性反应。停药恢复 1 个月后，上述有异常变化的检测指标均恢复正常。组织病理学检查的主要脏器未见与药物相关的器质性病变及延迟毒性反应。因此，可认为大鼠灌胃给予胡黄连总苷提取物 50mg/kg( 相当于临床拟用剂量的 30 倍 )，为基本安全剂量。
     比格犬连续口服胡黄连总苷提取物 320mg/kg、 80mg/kg、 20mg/kg 剂量，设对照组，连续给药 180 天。药后每日观察动物的精神、行为、饮食、粪便，定期进行体重、粪便潜血、尿生化、心电图、血液学、血液生化、骨髓、眼科、病理组织等项检查。结果发现 320mg/kg、 80mg/ kg 剂量组动物，在给药最初出现轻度的胃肠道反应 ( 呕吐、稀便 )，给药后尿潜血检查均有
     部分动物呈现阳性，但未随给药进程而加重；病理组织学检查膀胱粘膜、胃肠粘膜轻度淤血； 320mg/kg 剂量组动物谷草转氨酶轻度升高；这些变化在停药后能够消失。 20mg/kg 剂量组动物的精神、活动、饮食、粪便、体重、肛温、血液学、血液生化、尿液生化、心电图均无明显影响；该剂量为未观测到毒性反应的剂量 ( 以每 kg 体重计算相当于拟临床剂量的 13 倍，以体表面积换算相当于拟临床剂量的 8.3 倍， 90mg/ 人 / 天， 60kg/ 人 )。17

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1、(10)申请公布号 CN 102462772 A (43)申请公布日 2012.05.23 CN 102462772 A *CN102462772A* (21)申请号 201010543645.1 (22)申请日 2010.11.15 A61K 36/80(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人天津药物研究院地址 300193 天津市南开区鞍山西道 308 号 (72)发明人侯文彬赵专友周福军徐旭单淇张新鑫华洁 (74)专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司 11280 代理人郭广迅 (54) 发明名称胡黄连总苷提取物在制备用于预。

2、防和治疗脂肪肝药物中的用途 (57) 摘要本发明提供一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤：以浓度为 0 95 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的C1-C5脂肪醇后过滤；滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为 0 30 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去；以浓度为40100 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。本发明制备的胡黄连总苷提取物可以制成药物用于预防和 /。

3、或治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，以及急性脂肪肝或慢性脂肪肝，进而防止肝纤维化的形成。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 15 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 15 页 1/1 页 2 1. 一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤： (1) 以浓度为 0 95 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的 C1-C5脂肪醇后过滤； (2) 滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为 0 30 。

4、( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去； (3) 以浓度为 40 100 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。 2. 根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于，所述步骤 (1) 中采用的 C1-C5脂肪醇水溶液的浓度为 0 30 ( 体积 / 体积 )。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的用途，其特征在于，所述步骤 (2) 中采用的 C1-C5脂肪醇水溶液为 0 20 ( 体积 / 体积 )。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述步骤(3)中采用的C1-C5 脂肪醇水溶液为。

5、40 60 ( 体积 / 体积 )。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述大孔吸附树脂选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯型极性或非极性大孔吸附树脂中的一种或多种。 6. 根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的用途，其特征在于，所述提取的方法选自渗漉、回流和浸泡中的一种或多种，优选为渗漉。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其特征在于，按所述胡黄连总苷提取物的总重量计，所述胡黄连总苷提取物中，胡黄连总苷的含量不低于 60 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷的含量不低于 21 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷的含量不低于 1。

6、3 ( 重量 / 重量 ) ；优选地，所述胡黄连总苷提取物还包含胡黄连苷、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物为口服剂型或注射剂型。 9. 根据权利要求 8 所述的用途，其特征在于，所述口服剂型为片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或口服液；所述注射剂型为水针剂或粉针剂。 10. 根据权利要求 1 至 9 中任一项所述注射剂型，其特征在于，所述脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝，或者所述脂肪肝为急性脂肪肝或慢性脂肪肝；所述脂肪肝的相关疾病为脂肪肝引起的肝纤维化。权利要求。

7、书 CN 102462772 A 2 1/15 页 3 胡黄连总苷提取物在制备用于预防和治疗脂肪肝药物中的用途技术领域 0001 本发明属于中药领域，涉及一种胡黄连总苷提取物的用途，具体涉及一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝药物中的用途。背景技术 0002 肝脏是脂肪代谢的重要器官。正常情况下，脂肪重量占肝脏总重量的 3 5，正常人每 100g 肝湿重含 4 5g 脂类，其中磷脂占 50以上，甘油三酯占 20，游离脂肪酸占20，胆固醇约7，其余为胆固醇脂等。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5，或组织学上每单位面积可见 1/3 以上肝实质脂肪。

8、化时即称为脂肪肝。脂肪肝的发病机制至今尚未完全明确，一般认为肝细胞合成甘油三酯及分泌低密度脂蛋白之间的不平衡是形成脂肪肝的主要原因。 0003 脂肪肝是破坏肝功能的头号杀手，至今仍为欧美等发达国家肝病致残和死亡的首要病因，也已成为第一大肝病，患者多达约一亿两千万，其作为一种世界性的常见病、多发病，严重危害人类的身心健康和生活质量，并影响人们发挥工作效率。 0004 临床根据发病的缓急程度将脂肪肝分为急性和慢性两大类。急性脂肪肝见于药物中毒、妊娠晚期、 Reye 综合症等，其临床表现及预后类似于急性或亚急性重症病毒性肝炎，若治疗及时一般不留后遗症；慢性脂肪肝。

9、的形成一般与酒精和代谢综合征 ( 糖尿病、高脂血症和肥胖等 ) 有关，因此又可分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。 0005 既往认为脂肪肝仅为良性病变，进展缓慢或不进展。但近年的研究发现，酒精性脂肪肝患者中脂肪性肝炎的发病率为约 40，脂肪性肝硬化的发病率达 50以上；另外， 20的非酒精性脂肪肝发展为脂肪性肝纤维化，进而恶化为肝硬化，其中 30 40的患者死于这些肝相关性疾病，部分发生亚急性肝衰竭和肝细胞肝癌。 0006 目前，国内外尚无专门治疗脂肪肝的特效药物，临床上多采用降脂类药物与保肝类药物联合用药。这些药物多是针对脂肪肝的某个环节或部分的发病机理起作用。

10、，缺乏治疗脂肪肝的特异性。有些调血脂药虽然对脂肪肝有短期疗效，但影响肝功能，使血脂更集中于肝脏进行代谢，增加肝脏负担，长期服用具有潜在的肝毒性，反而会加重脂肪肝的病情。鉴于缺乏治疗脂肪肝的特效药物，因此从中药中寻找新的脂肪肝治疗药物已经成为近年来中药新药研究的热点之一。 0007 中药胡黄连是玄参科 (Scrophulariaceae) 胡黄连 (Picrorhiza scrophulariiflora Pennell) 的干燥根茎。对胡黄连的化学研究发现，胡黄连主要含有环烯醚萜类、酚苷类、有机芳香酸类成分。药理和临床研究表明，胡黄连以环烯。

11、醚萜类为主的苷类成分具有明确的保肝、抗肝损伤作用。近年的研究还表明，胡黄连苷 II 可通过改善肝功能、抑制脂质过氧化反应、下调 TGF-1 和 I 型胶原 mRNA 以及蛋白表达而抑制肝纤维化的形成。说明书 CN 102462772 A 3 2/15 页 4 发明内容 0008 因此，本发明的目的在于基于中药胡黄连总苷提取物来提供一种有效治疗脂肪肝的新型药物。 0009 用于实现上述目的的技术方案如下： 0010 一种胡黄连总苷提取物在制备用于预防和 / 或治疗脂肪肝或其相关疾病药物中的用途，其中所述胡黄连总苷提取物的制备方法包括以下步骤： 0011 (1) 以。

12、浓度为 0 95 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液提取胡黄连，除去提取液中的 C1-C5脂肪醇后过滤； 0012 (2) 滤液通过大孔吸附树脂并以浓度为 0 30 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，洗脱液弃去； 0013 (3) 以浓度为 40 100 ( 体积 / 体积 ) 的 C1-C5脂肪醇水溶液洗脱，除去洗脱液中的溶剂。 0014 在上述用途中，优选地，步骤 (1) 中采用的 C1-C5脂肪醇水溶液的浓度为 0 30 ( 体积 / 体积 )。优选地，步骤 (2) 中采用的 C1-C5脂肪醇水溶液为 0 20 ( 体积 / 体。

13、积 )。优选地，步骤 (3) 中采用的 C1-C5脂肪醇水溶液为 40 60 ( 体积 / 体积 )。 0015 在上述用途中，大孔吸附树脂可以选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯型极性或非极性大孔吸附树脂中的一种或多种。 0016 在上述用途中，提取的方法可以选自渗漉、回流和浸泡中的一种或多种，优选为渗漉。 0017 在上述用途中，按胡黄连总苷提取物的总重量计，所述胡黄连总苷提取物中，胡黄连总苷的含量不低于 60 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷的含量不低于 21 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷的含量不低于 13 ( 重量 / 重量 )。优选地，所。

14、述胡黄连总苷提取物还包含胡黄连苷、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 0018 在上述用途中，药物可以为口服剂型或注射剂型。口服剂型可以为片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或口服液。注射剂型可以为水针剂或粉针剂。 0019 在上述用途中，脂肪肝可以为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝；也可以为急性脂肪肝或慢性脂肪肝。脂肪肝的相关疾病具体为脂肪肝引起的肝纤维化。 0020 本发明经研究发现经本发明的提取方法制得的胡黄连总苷提取物中胡黄连总苷含量高达 60 ( 重量 / 重量 ) 以上，其中富含环烯醚萜类等有效成分。采用急、慢性脂肪肝动物模型的研究表明，该胡。

15、黄连总苷提取物具有清肝脂、降血脂、降低转氨酶、清除自由基、抗脂质过氧化、增强免疫、保护肝脏的作用。因此，以本发明的提取方法制备的胡黄连总苷提取物可以制成药物，用于预防和 / 或治疗治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，以及急性脂肪肝或慢性脂肪肝，进而防止肝纤维化的形成。 0021 与现有技术相比，本发明至少存在以下有益效果： 0022 1、本发明采用水或低醇提取，并采用大孔树脂法进行纯化，得到的总苷提取物的成分及含量与现有技术不同，本发明胡黄连总苷提取物中，总苷含量 60 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷 21 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷 13 ( 重。

16、量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷、胡黄连苷 IV、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇；现有技术主要为胡黄连环烯醚萜总苷提取物，其中，胡黄连苷和胡黄连苷 HPLC 含量总计 20 ( 重量 / 重量 ) ；说明书 CN 102462772 A 4 3/15 页 5 0023 2、脂肪肝中肝脂大量堆积的成因包括肝脂输出相对不足和肝脂输出绝对不足。肝脂输出相对不足是由进入肝脏的血液中脂肪酸增多或肝脏自身合成脂肪酸增多、加速肝脏合成 TG 所致，药效研究中通常采用高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型；与现有技术相比，本发明除了选择上述模型对胡黄连总苷提取。

17、物进行药效研究外，还针对脂肪肝的另一成因，即肝脂输出绝对不足，设计了乙硫氨酸诱发的急性脂肪肝模型和 CCl4诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型，分别反映了肝脏 VLDL 合成、分泌障碍及脂肪肝氧化抑制。根据脂肪肝发病的多种成因，设计了多种动物模型，从而综合考察了胡黄连总苷提取物对脂肪肝的治疗作用。 0024 3、本发明在乙硫氨酸诱发的小鼠急性脂肪肝模型中，连续 3 次灌胃给予胡黄连总苷提取物 15、 30、 60mg/kg ；其他试验给药剂量 20、 40、 80mg/kg，胡黄连总苷提取物治疗脂肪肝的大鼠的起效剂量为 20mg/kg/ 天，有效剂量范围为 40 8。

18、0mg/kg/ 天。 0025 4、尽管现有技术中有将胡黄连提取物用于治疗和预防肝病的报道，但是其中胡黄连提取物的成分和含量与本发明不同，而且由于肝病的种类很多，不同肝病的形成机理差别很大，对于不同形成机理的肝病需要针对性使用不同的药物，本发明通过大量研究发现，本发明制备的特定组成的胡黄连提取物在治疗脂肪肝中效果尤佳。具体实施方式 0026 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。 0027 实施例 1 0028 将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 水浸泡 2 小时，装入渗漉筒，以水。

19、渗漉，收集 240L 渗漉液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 D101 大孔吸附树脂，以水洗去杂质，再以 60 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 2.8 公斤，其中总苷含量达 70 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 22.5 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 13.9 ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷、胡黄连苷、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 0029 取上述胡黄连总苷提取物1.2公斤，加淀粉1.6公斤，微晶纤维素400g，制粒，装胶囊，每粒含总苷 30mg。

20、。 0030 实施例 2 0031 将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 的 30 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液浸泡 12 小时，装入渗漉筒，以 30 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液渗漉，收集 240L 渗漉液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 AB-8 大孔吸附树脂，以水洗去杂质，再以 50 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 2.6 公斤，其中总苷含量达 75 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 22.8 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 14.6 ( 重量 / 重量 )，。

21、此外，还含有胡黄连苷、胡黄连苷、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 0032 取上述胡黄连总苷提取物 1.1 公斤，加淀粉 1.6 公斤，微晶纤维素 400g，制粒，压片，每片含总苷 30mg。 0033 实施例 3 0034 将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 60L 的 20 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液回流 3 次，每次 2 小时，每次 80L，合并提取液，浓缩至相当于 1g 药材 /mL 的浓缩液。通过 HPD100 说明书 CN 102462772 A 5 4/15 页 6 大孔吸附树脂，以水及 20 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶。

22、液洗去杂质，再以 40 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物 3 公斤，其中总苷含量达 60 ( 重量 / 重量 )。胡黄连苷为 21.6 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 13.5 ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷、胡黄连苷、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 0035 实施例 4 0036 将 20 公斤胡黄连药材粉碎成粗粉，以 240L 的 10 ( 体积 / 体积 ) 乙醇水溶液浸泡 24 小时，减压浓缩浸泡液，至 1g 药材 /mL。通过 NKA 大孔吸附树脂，以 10 ( 体积 / 体。

23、积)乙醇水溶液洗去杂质，再以50(体积/体积)乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，减压干燥制得胡黄连总苷提取物1公斤，其中总苷含量达65(重量/重量)，胡黄连苷为21.9 ( 重量 / 重量 )，胡黄连苷为 13.7 ( 重量 / 重量 )，此外，还含有胡黄连苷、胡黄连苷、 6- 阿魏酰梓醇和 6- 异阿魏酰梓醇。 0037 试验例 0038 试验的目的在于验证胡黄连总苷提取物在预防和 / 或治疗脂肪肝中的效果。为了证明本发明的胡黄连总苷提取物的治疗效果和安全性，其药效学、药理学、毒理学研究过程及结果如下： 0039 一、主要药效学试验 0040 1. 对乙硫氨酸。

24、诱发的急性脂肪肝模型的影响 0041 ICR 小鼠 70 只，雄性，体重 20.31.2(18.2 22.5)g，随机分为 7 组，每组 10 只。采用乙硫氨酸制备急性脂肪肝模型，乙硫氨酸能抑制肝脏合成载脂蛋白，从而使脂质代谢中甘油三酯 (TG) 运出肝脏出现障碍，导致 TG 蓄积于肝脏而形成脂肪肝。小鼠禁食过夜后，除正常对照组灌服蒸馏水外，其余各组灌服DL-乙硫氨酸(250mg/kg， 20mL/kg)造模， 1h后，正常对照组和模型对照组灌服0.5(g/ml)CMC，受试药组灌服实施例1制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 15、 30、 60mg/kg/ 次，。

25、阳性药物组分别灌服强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 1700、 100mg/kg/ 次 ( 均相当于临床日用量的 3 倍 )，给药体积均为 10ml/kg。每日给药 2 次，共给药 3 次。于末次给药后 1h 处死小鼠，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比 1 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)。结果如表 1 所示。 0042 表 1 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响说明书 CN 102462772 A 6 5/15 页 7 0043 0044 。

26、注： 1. 与正常组比较， P 0.01，P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05， *P 0.01。 0045 结论，在乙硫氨酸诱发的小鼠急性脂肪肝模型中，连续 3 次灌胃给予胡黄连总苷提取物15、 30、 60mg/kg治疗后，可显著降低肝脏TG，使肝脏升高的TG分别下降了15.7(P 0.05)、 24.7 (P 0.05)、 29.6 (P 0.01)。胡黄连总苷提取物 15mg/kg 与强肝颗粒 1700mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 30mg/kg 与凯西来 100mg/kg 的作用相当。 0046 2. 对高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型的影响。

27、 0047 SD大鼠70只，雄性，体重2115(202221)g。除正常对照组饲喂普通饲料外，其余大鼠饲喂高脂饲料制备慢性脂肪肝模型。通过大量摄入外源性脂肪酸使进入肝脏的脂肪酸增加，引起肝细胞缓慢脂变，最终形成与临床高脂蛋白血症所致的脂肪肝相似的脂肪肝模型。高脂饲料配方为 5 ( 重量 / 重量 ) 猪油、 2 ( 重量 / 重量 ) 胆固醇、 0.5 ( 重量 / 重量 ) 胆盐、 0.2 ( 重量 / 重量 ) 甲基硫氧嘧啶和 92.3 ( 重量 / 重量 ) 普通饲料。造型 8 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对。

28、照组灌服 0.5 (g/ml)CMC ；受试药组灌服实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 20、 40、 80mg/kg ；阳性药组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。 0048 给药前及末次给药后1h动物眼眶取血1ml，制备血清，测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇 (TC)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)。结果如表 2 和表 3 所示。 0049 处死动物，摘取肝脏，称取左叶边。

29、缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比 1 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法测定 TG、 TC。结果如表 4 所示。 0050 表 2 胡黄连总苷提取物对血清 TG、 TC 的影响 0051 说明书 CN 102462772 A 7 6/15 页 8 0052 0053 注： 1. 与正常组比较， P 0.01 ；P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05 ； *P 0.01。 0054 说明书 CN 102462772 A 8 7/15 页 9 0055 表 4 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响 0056 。

30、说明书 CN 102462772 A 9 8/15 页 10 0057 注： 1. 与正常组比较， P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05。 0058 结论：饲喂高脂饲料诱发的慢性脂肪肝模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20、 40、 80mg/kg 治疗 30 天能有效清除肝内及血液中的脂肪，使肝脏升高的 TG 分别下降了 15.2 (P0.05)、 37.8(P0.05)、 72.8(P0.01) ；使肝脏升高的TC分别下降了21.7(P 0.05)、 24.1 (P 0.05)、 24.8 (P 0.05) ；使血清升高的 TC 分别下降了 45.3 (P 0.。

31、05)、 66.5 (P 0.05)、 77.1 (P 0.01) ；使血清升高的 LDL-C 分别下降了 39.5 (P 0.05)、 55.4 (P 0.01)、 57.3 (P 0.01) ；使血清下降的 HDL-C/LDL-C 分别上升了 0.7 (P 0.05)、 30.1 (P 0.05)、 30.8 (P 0.01) ；并能减轻肝细胞脂肪变性程度。胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。 0059 3. 对酒精 + 高脂诱发的慢性脂肪肝模型的影响 0060。

32、 SD 大鼠 70 只，雄性，体重 2126(200 223)g。除正常对照组灌服 0.5 (g/ml) CMC 外，其余大鼠每天灌服造型乳液 15ml/kg，用以制造与人类的饮食结构相似的慢性脂肪肝模型。乙醇具有肝毒性，可抑制脂肪酸氧化，高脂可增强乙醇对肝脏的损伤。造型乳液比例为 60 ( 体积 / 体积 ) 乙醇 10ml/kg、胆固醇 1g/kg、猪油 5g/kg。造型第 8 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对照组灌服 0.5 (g/ml)CMC ；受试药组灌服实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为。

33、 20、 40、 80mg/kg ；阳性药物组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。 0061 于给药前动物眼眶取血 1ml，制备血清，测定 TG、 TC。末次给药后 1h 取血测定 TG、 TC、谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)。结果如表 5 和表 6 所示。 0062 处死动物，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比 1 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液用比色法。

34、测定 TG、 TC。结果如表 7 所示。另取肝组织，以黄嘌呤氧化酶法测定SOD，以TBA法测定MDA，以样本碱水解法测定羟脯氨酸含量。结果如表 8 所示。 0063 表 5 胡黄连总苷提取物对血清 TG、 TC 的影响说明书 CN 102462772 A 10 9/15 页 11 0064 0065 注： 1. 与正常组比较， P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05 ；*P 0.01 ； *P 0.001。 0066 表 6 胡黄连总苷提取物对血清 ALT、 AST 的影响 0067 0068 0069 注： 1. 与正常组比较， P 0.05 ；P 0.0。

35、1 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01。 0070 表 7 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响说明书 CN 102462772 A 11 10/15 页 12 0071 0072 注： 1. 与正常组比较， P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01。 0073 表 8 胡黄连总苷提取物对肝脏 SOD、 MDA 的影响 0074 0075 0076 注： 1. 与正常组比较， P 0.01 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01。 0077 结论，酒精 + 高脂诱发的慢性脂肪肝模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20。

36、、 40、 80mg/ kg治疗30天能清除肝内及血液中的脂肪，使肝脏升高的TG分别下降了13.3(P0.05)、 40.2 (P 0.05)、 76.1 (P 0.01) ；使肝脏升高的 TC 分别下降了 2.3 (P 0.05、 22.6 (P 0.05)、 60.5 (P 0.05) ；使血清升高的 TG 分别下降了 79.2 (P 0.05)、 77.8 (P 0.05)、 93.1 (P 0.01) ；使血清升高的 TC 分别下降了 47.7 (P 0.05)、说明书 CN 102462772 A 12 11/15 页 13 56.8 (P 0.05)、 81.2 (P。

37、 0.05) ；能改善肝脏功能，降低转氨酶，使血清升高的 ALT 分别下降了69.4(P0.05)、 77.6(P0.05)、 83.6(P0.05) ；使血清升高的AST 分别下降了 82.9 (P 0.05)、 97.9 (P 0.01)、 95.7 (P 0.01) ；提高 SOD 活性，减少 MDA 含量。胡黄连总苷提取物 20 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。 0078 4. 对 CCl4诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型的影响 0079 SD 大鼠 70 只，雄性。

38、，体重 15410(141 177)g。除正常对照组颈部皮下注射中性菜油外，其余大鼠皮下注射 40 ( 体积 / 体积 )CCl4中性菜油溶液。CCl4在肝内经微粒体细胞色素氧化酶 P450 激活为自由基 CCl3-，导致肝微粒体的脂质过氧化，破坏肝细胞线粒体结构及功能，使其对脂肪的氧化能力降低，损伤肝细胞内质网，使脂蛋白的合成减少。注射首剂量为 0.5ml/kg 体重，以后 0.2ml/100g 体重， 2 次 / 周。造型 7 周后，将模型动物随机分为 6 组，每组 10 只。随后开始给药，正常对照组和模型对照组灌服 0.5 (g/ml)CMC ；受试药物。

39、组灌服由实施例 1 制备的胡黄连总苷提取物，剂量分别为 20、 40、 80mg/kg ；阳性药物组分别灌胃给予强肝颗粒或凯西莱，剂量分别为 2300、 140mg/kg( 均相当于临床剂量的 3 倍 )，给药体积均为 5ml/kg。每日给药 1 次，共给药 30 天。 0080 给药前及末次给药后 1h 动物眼眶取血 1ml，制备血清，测定血清谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)。结果如表 9 所示。 0081 处死动物，摘取肝脏，称取左叶边缘 200mg，以 2ml 丙酮 - 乙醇混合液 ( 体积比 1 1) 研磨制备匀浆，抽提脂质，离心后，取上清液。

40、用比色法测定 TG、 TC。结果如表 10 所示。 0082 另取肝组织，以黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 (SOD)，以 TBA 法测定丙二醛 (MDA)，以样本碱水解法测定羟脯氨酸含量。结果如表 11 所示。 0083 再取 1cm1cm0.5cm 肝右叶浸入福尔马林液中固定， HE 染色。Masson 三色染色观察大鼠肝脏胶原组织 ( 染色胶原纤维呈蓝色 ) 沉积等变化。胶原纤维面积百分比胶原纤维面积 / 肝组织面积 100，结果如表 12 所示。 0084 表 9 胡黄连总苷提取物对血清转氨酶的影响 0085 说明书 CN 102462772 A 13 12/15 。

41、页 14 0086 注： 1. 与正常组比较， P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05 ；*P 0.01。 0087 表 10 胡黄连总苷提取物对肝脏 TG、 TC 的影响 0088 0089 0090 注： 1. 与正常组比较， P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05。 0091 表 11 胡黄连总苷提取物对肝脏 SOD、 MDA 的影响 0092 说明书 CN 102462772 A 14 13/15 页 15 0093 注： 1. 与正常组比较， P 0.01、P 0.001 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05， *P 0.01。 0094 。

42、表 12 胡黄连总苷提取物对肝纤维化的影响 0095 0096 0097 注： 1. 与正常组比较， P 0.01 ； 2. 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01。 0098 结论： CCl4诱发的脂肪肝 / 肝纤维化模型大鼠经胡黄连总苷提取物 20、 40、 80mg/ kg 治疗 30 天能清除肝内脂肪，使肝脏升高的 TG 分别下降了 7.0 (P 0.05)、 35.8 (P 0.05)、 38.5(P0.05) ；能改善肝脏功能，降低转氨酶，使血清升高的ALT分别下降了 14.0(P0.05)、 23.4(P0.05)、 42.0(P0.01) ；使血清升高的AS。

43、T分别下降了说明书 CN 102462772 A 15 14/15 页 16 29.6 (P 0.05)、 47.0 (P 0.05)、 59.1 (P 0.01) ；并能提高 SOD 活性，减少 MDA 含量。胡黄连总苷提取物 20 40mg/kg 与强肝颗粒 2300mg/kg 的作用相当；胡黄连总苷提取物 40 80mg/kg 与凯西莱 140mg/kg 的作用相当。 0099 综上所述，胡黄连总苷提取物治疗脂肪肝的大鼠的起效剂量为 20mg/kg/ 天，有效剂量范围为 40 80mg/kg/ 天。药理作用包括清肝脂、降血脂、降低转氨酶、抗脂质过氧化、清除自。

44、由基、保护肝脏、增强免疫等作用，能通过多个环节有效地治疗酒精性和非酒精性脂肪肝，防止肝纤维化。 0100 二、一般性药理研究 0101 一般性药理研究未发现药物对血液循环系统和呼吸系统的明显毒性。也未见对动物平衡运动能力的影响，但在 30、 270mg/kg 剂量下与戊巴比妥协同，对睡眠有一定促进作用。 0102 三、急性毒性试验 0103 小鼠单次静脉注射不同剂量的胡黄连总苷提取物后，药后部分动物出现即刻短暂的抽搐等毒性症状，各剂量组小鼠均出现药后俯卧和活动减少等症状。除最低剂量组 0.70g/kg 外，其余各剂量组动物均出现死亡，并随剂量增大而增多，死亡。

45、动物分布于 1 小时内，且无性别差异。死亡和活杀小鼠剖检脏器组织均未见明显异常。药后存活动物24h症状基本消失，毒性反应程度与剂量呈正相关；药后存活动物在观察期内体重增长基本正常。小鼠单次静脉给予一定剂量的胡黄连总苷提取物后具有明显的毒性反应，并导致动物死亡，用 Bliss 法计算 LD50为 1.09g/kg(95可信限： 0.98g/kg 1.21g/kg)。 0104 灌胃给药后， 12.5g/kg 剂量组动物在药后 14 天的观察期内，动物平均体重增长明显低于同期对照组 (p 0.05 或 p 0.01)，尤其是药后 1 周内个别动物出现体重负增长；。

46、10.0g/kg 剂量组动物在药后 14 天的观察期内，体重增长基本正常，与对照组比较均无显著性差异 (p 0.05)。结果提示，小鼠灌胃给予 10.0g/kg 为最大无毒反应剂量。 0105 四、长期毒性试验 0106 大鼠连续灌胃给予 50、 150 和 450mg/kg 的胡黄连总苷提取物 6 个月，在给药期和恢复期内观察动物的一般反应、进食情况、测定动物的体重，给药 3 个月、 6 个月和恢复期 1 个月结束时检测血液学指标、血液生化指标、系统尸检、脏器系数和组织病理学等指标。结果发现，高剂量组，在给药期间雄性及雌性动物的体重增长缓慢、总胆红素轻微升高。

47、；另外，高剂量组雌性动物的网织红细胞呈轻微升高及肾脏器系数出现轻微增大趋势，除上述异常指标外，其余各项检测指标均未发现与药物相关的明显改变。中剂量组，给药期间除雄性动物的体重增长缓慢，及雌性动物的总胆红素有轻微升高外，其余检测指标均未见与药物相关的明显变化。低剂量组，给药期间的动物各项检测指标均未发现与药物相关的毒性反应。停药恢复 1 个月后，上述有异常变化的检测指标均恢复正常。组织病理学检查的主要脏器未见与药物相关的器质性病变及延迟毒性反应。因此，可认为大鼠灌胃给予胡黄连总苷提取物 50mg/kg( 相当于临床拟用剂量的 30 倍 )，为基本安全剂量。 0107 比格犬连续口服胡黄连总苷提取物 320mg/kg、 80mg/kg、 20mg/kg 剂量，设对照组，连续给药 180 天。药后每日观察动物的精神、行为、饮食、粪便，定期进行体重、粪便潜血、尿生化、心电图、血液学、血液生化、骨髓、眼科、病理组织等项检查。结果发现320mg/kg、 80mg/ kg 剂量组动物，在给药最初出现轻度的胃肠道反应 ( 呕吐、稀便 )，给药后尿潜血检查均有说明书 CN 102462772 A 16 15/15 页 17 部分。

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