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登革病毒样颗粒及其制备方法与应用
    【技术领域】
     本发明涉及基因工程领域， 具体内容为应用毕赤酵母制备登革病毒样颗粒的方法及应用。 背景技术 登革病毒 （dengue virus, DENV）以 伊 蚊 为 传 播 媒 介， 感染人可引起登革热 （dengue fever, DF） 、 登革出血热 （dengue hemorrhagic fever, DHF）和 登 革 休 克 症 （dengue shock syndrome, DSS） 。DHF/DSS 病情严重， 病死率高， 其发病机制至今尚未阐 明。 由于缺乏有效的登革病毒疫苗， 加上控制蚊媒的实际困难， 使登革病毒感染流行的地域 和流行强度在不断地扩大。 目前登革热在全球许多地方卷土重来， 已成为世界上分布最广、 发病最多、 危害较大的一种虫媒病毒性疾病。 因此， 加强 DENV 致病机制、 疫苗的研究及快速 诊断试剂盒的研制已经成为十分迫切的问题。
     登革疫苗的研究已经有近百年的历史， 但目前还尚无成功的疫苗问世。制约登革 疫苗研究的因素主要有以下几个方面 ： (1) 缺乏合适的、 能模拟人体感染 DENV 临床症状的 动物模型 ； (2) 对 DENV 感染导致 DHF 和 DSS 的具体机制尚不清楚 ； (3) DENV 不同型之间存 在抗体依赖的感染增强作用 （antibody-dependent enhancement, ADE） 。 因此研制 DENV 疫 苗需要对 4 个型都有均衡的保护作用， 因此增加了研制的难度。
     病毒样颗粒 （Virus-like particles, VLPs) 疫苗的出现为研发新型安全高效的 疫苗提供了一个新的契机。VLPs 是指由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的， 不含病毒核 酸， 不能进行自主复制的空心颗粒。由于 VLPs 不包含病毒 DNA 或 RNA， 因此不存在毒力的 回复和同源重组的隐患。同时， VLPs 保留了与天然病毒粒子相同或类似的空间构型和诱 导中和抗体的抗原表位， 具有很强的免疫原性。不但能诱导产生体液免疫， 而且可以激发 + CD4 T 细胞的增殖和 CTL 反应 （cytotoxic T lymphocyte） 。目前多数病毒的 VLPs 是通过体 外表达系统来实现有效的自我组装， 其中包括 HIV, Influenza A virus, Hantaan virus, Rotavirus, Papillomavirus 等病毒。
     登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员， 为单股正链 RNA 病毒， 基因组长约 11kb， 含 有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为 5'-NCR-C- PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4 A-NS4B-NS5-NCR-3'， 共编码 3 个结构蛋白和 7 个非结构蛋白。其中 E 基因编码的 E 蛋白为 病毒表面包膜糖蛋白， 具有与细胞表面受体结合， 介导膜融合， 诱导产生中和抗体等多种生 物学功能， 是病毒最重要的抗原成份。 PrM 基因编码的 PrM/M 蛋白也被认为是诱导产生中和 抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称， 黄 病毒的包膜 E 蛋白与 prM 蛋白在体外表达系统中共表达时， 可折叠为类似天然病毒粒子空 间结构的多聚体颗粒即病毒样颗粒， 也称作亚病毒颗粒 （subviral particles， SVPs） 。 在登 革病毒方面， 有研究者应用酵母系统、 CHO-K1 细胞等进行了 VLPs 表达的尝试， 但 DENV VLPs 在哺乳动物细胞中的低水平表达以及蛋白功能的维护一直是阻碍登革 VLPs 疫苗发展的瓶 颈。因此， 选择合适的 DENV VLPs 表达系统， 并采取合理的策略提高 VLPs 表达产量和分泌
     水平成为了发展 DENV VLPs 疫苗急需解决的问题。目前， 相关研究中尚未发现有在毕赤酵 母真核系统中分泌表达四个型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。 发明内容 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供登革病毒 1-4 病毒样颗粒。
     为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 本发明首先构建用于不同重组表达子所采用的引物序列， 分别可扩增登革病毒 SprME 基因， 其长度为 1983 bp， 编码 prM 信号肽， prM 蛋白和全长的 E 蛋白。又可扩增到的是 SprME472 基因， 其长度为 1914 bp， 编码 prM 信号肽， prM 蛋白和 TM2 端截断的 E 蛋白。
     本发明还提供用于表达 DENV1 ～ 4 病毒样颗粒的基因元件。其是采用 RT-PCR 技 术获得了 DENV-1 GZ01/95 株、 DENV-2 ZS01/01 株、 DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241 株的 prM-E 蛋白编码基因序列。为了使登革病毒 VLPs 能获得高效表达， 我们对 1 ～ 4 型登革 病毒 CprM-E 或 prME 基因的表达元件进行了改造， 包括在 prM 基因 N 端设计理想的信号肽 序列， 替换四型登革病毒 E 基因锚定区的部分基因等， 本发明构建并表达了截去 E 蛋白 TM2 （E 蛋白 472aa-496aa） 端的 prME472 和含全长 E 蛋白的 prME， 最终确定了表达 VLPs 的最 佳构建策略。四型登革病毒 prM-E 基因元件分别命名为 ： DENV1-PrME， DENV2-sPrME472， DENV3-sPrME, DENV4-sPrME。
     本 发 明 还 提 供 能 够 分 泌 表 达 四 个 型 登 革 病 毒 样 颗 粒 的 P.pastoris 酵 母 菌 株。其是通过特异的限制性酶切位点 Bsp119I 和 Xba I， 分别将上述的四个型别登革 病毒 prM-E 基因元件克隆入真核系统表达载体 pGAPZ αA 中。分别命名为 ： I 型登革 病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌 pGAPZ-α-PrMED1-X33、 II 型登革病毒样颗粒毕赤酵 母 表 达 工 程 菌 pGAPZ-sPrME472-D2-X33、 III 型 登 革 病 毒 样 颗 粒 毕 赤 酵 母 表 达 工 程 菌 pGAPZ-sPrME-D3-X33 和Ⅳ型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌 pGAPZ-sPrME-D4-X33， 再将重组载体转化到 P.pastoris 酵母菌 X33 内， 获得稳定表达登革病毒病毒样颗粒的工程 菌， 分别于 2011 年 3 月 14 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心， 编号分别为 CCTCC M 2011063、 CCTCC M 2011064、 CCTCC M 2011065 和 CCTCC M 2011066。
     本发明还提供上述基因编码的登革病毒样颗粒的制备方法， 其步骤包括 ： 1) 采用 RT-PCR 技术从 DENV-1 GZ01/95 株、 DENV-2 ZS01/01 株、 DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241 株中分别获得四个型登革病毒的 prM-E 基因元件 ； 2） 对 1 ～ 4 型登革病毒 CprM-E 或 prME 基因的表达元件进行了改造， 包括在 prM 基因 N 端设计理想的信号肽序列， 替换四型登革病毒 E 基因锚定区的部分基因 ； 3） 将四个型登革病毒的 prM-E 基因改造元件分别克隆入真核系统表达载体中 ； 4） 用 3） 中得到的重组表达载体分别转染 P.pastoris 酵母 X33 细胞， 并使其分泌表达 登革病毒病毒样颗粒 ； 5） 用 SDS-PAGE、 Western blot 技术， 检测目的基因表达。
     6） 用 15-60% 蔗糖密度梯度离心和电镜技术， 检测病毒样颗粒的形态特征。
     本发明进一步提供上述基因编码的登革病毒样颗粒在预防登革类疾病中的应用。 本发明分别用 DENV1 ～ 4-VLPs 单价、 双价及四价配伍免疫 Balb/c 小鼠， 能诱发中和抗体、 细胞免疫及免疫记忆反应， 为登革病毒疫苗研制奠定了基础。
     与现有技术相比， 本发明采用如下技术方案 ： 本发明采用非甲醇依赖的 P .pastoris 酵母系统制备登革病毒样颗粒， 国内外尚未见 报道， 具有创新性。 该系统制备的登革病毒样颗粒能用于制备疫苗， 既克服了目前减毒活疫 苗、 亚单位疫苗和载体疫苗等登革疫苗研究中的诸多缺点， 具有安全高效、 适于规模化生产 的优势。 附图说明
     图 1 是本发明所使用的 pGAPZα A 表达载体结构示意图， 该载体包含组成型的 GAP 启动子， 编码酿酒酵母 α 信号肽基因序列和编码抗 Zeocin 抗生素的基因。
     图 2 是本发明重组载体构建示意图， A： 登革病毒包膜蛋白 prM 和 E。H1 (400-413 aa) 和 H2 (430-449 aa) 代表预测的 E 蛋白 C 末端茎干部位的 α- 螺旋区域。CS (413-430 aa) 代表间隔 H1 和 H2 螺旋的区域。TM1 (449-472 aa) 和 TM2 (473-495 aa) 代表预测的 E 蛋白跨膜区域。箭头代表信号肽酶的切割位点。B ： 不同重组表达载体的构建。PGAP 代表 pGAPZ α A 中的 GAP 启动子。S 代表 prM 的信号肽序列， α 代表 pGAPZ α A 中的 α 信号 肽序列。
     图 3 是本发明构建的重组载体酵母转化子用 GAP 通用引物 PCR 鉴定结果， 其中泳 道 1 是空载体转化子对照， 2 ～ 4 是 pGAPZ-sPrME472 转化子， 5 是酵母 X33 对照， 6～9是 pGAPZ-sPrME 转化子， 10、 11 是 pGAPaZ-sPrME 转化子。
     图 4 是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物 PCR 鉴定结果， 其 中泳道 2 ～ 4 是 pGAPZ-sPrME 转化子。
     图 5 亦是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物 PCR 鉴定结果， 其中泳道 2 ～ 4 是 pGAPZ-sPrME472 转化子。
     图 6 是本发明 VLPs 在酵母细胞中表达的 Western blot 鉴定图， 其中 1、 2 分别 是 pGAPaZ-PrME 转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的 Western blot 鉴定结果， 3、 4 分别是 pGAPZ-sPrME472 转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒 特异性单抗反应的 Western blot 鉴定结果， 5、 6 分别是 pGAPZ-sPrME 转化子表达细胞裂解 液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的 Western blot 鉴定结果， 可见在各重组子的细 胞裂解液和发酵上清均可检测到约 50 kDa 的 E 蛋白和 20 kDa prM 蛋白。
     图 7 是本发明用蔗糖密度梯度离心法纯化表达的 VLPs 的 Western blot 鉴定图， 其中 A1 ～ 3 是 pGAPaZ-PrME 转化子表达 VLPs 在 30 ％、 35 ％、 40 ％蔗糖层收集， B1 ～ 3 是 pGAPZ-sPrME 转化子表达 VLPs 在 30％、 35％、 40％蔗糖层收集， 可见本发明表达的登革病毒 VLPs 含有 E、 PrM 和 M 蛋白。
     图 8 是本发明得到的 VLPs 的负染电镜照片， 直径为 30 nm 和 55 nm 直径的 VLPs 均被检测到， 且具有与天然登革病毒颗粒相似的形态。
     图 9 是本发明得到的 VLPs 的免疫电镜照片， 其中 A、 B 是细胞裂解液中的 VLPs， C、 D 是表达上清浓缩液中的 VLPs， 所用抗体为登革病毒多抗血清， 亦观察到直径为 30 nm 和 55 nm 直径的 VLPs。
     图 10 是本发明得到的 VLPs 的透射电镜照片， 其中 A 是酵母 X33 对照， B 是本发明 构建的转化子， 在酵母细胞的胞浆中形成了许多双层膜囊泡结构， 每个囊泡中都充满了直径约为 30-55 nm 左右呈结晶状排列的 VLPs。
     图 11 是本发明 VLPs 免疫小鼠的血清效价随时间变化的水平测定， 其中 PBS 为 PBS 免疫 Balb/C 小鼠阴性对照， PrME 代表 pGAPZ-sPrME VLPs 免疫 Balb/C 小鼠， CPrME 代表 pGAPZ-sCPrME VLPs 免疫 Balb/C 小鼠。 具体实施方式
     以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。
     实施例 1 DENV1 ～ 4VLPs 基因表达元件最佳构建策略的确定 一、 DENV1 ～ 4 病毒培养及病毒 RNA 的抽提 将 DENV-1 GZ01/95 株、 DENV-2 ZS01/01 株、 DENV-3 H87 株以及 DENV-4 H241 株 分别接种 C6/36 细胞单层上， 加入含 2% 灭活小牛血清的 MEM 培养液， 于 37℃ 培养至出现细 胞病变达 “+++ ～ ++++” ， 收集上清进行 RNA 的制备。采用 Trizol 试剂法提取培养上清总 ® RNA。Trizol LS 试剂为美国 Invitrogen 公司产品。
     二、 DENV1 ～ 4 prME 基因元件的制备 采用 ThermoScriptTM RT-PCR System（美国 Invitrogen） 将 DENV1-4 的 RNA 反转 录合成 cDNA 第一链。 反应体系 ： 模板 RNA（5-10 μg） 8 μl， 引物 R 2 μl， dNTPs（100mM） 2 μl， DEPC 水 3 μl。总体积 15 μl， 将上述成分混匀并在 65℃水浴 5 min， 迅速在冰上预冷 2 min 以 上。加入下列成分 ： 5× PrimeScript buffer 4 μl， RNase Inhibitor （40 U/μl） 1 μl， Reverse Transcriptase (200 U/μl) 0.5 μl。
     反应条件 ： 42℃保温 30 min， 70℃ 15 min。
     得到的 cDNA 用于 PCR 扩增， PCR 反应体系 ： 10× LA Buffer（Mg2+ free） 5 μl， MgCl2 5 μl， dNTPs 8 μl， cDNA 5 μl， 引物 F、 R 各 2 μl， LA Taq 酶 1 μl， ddH2O 22 μl。
     。实施例 2 能分泌表达 DENV1 ～ 4VLPs 的重组载体的构建及鉴定 一、 重组载体的构建 将实施例 1 中制备的 prME 基因经 Bsp119 I 和 Xba I 双酶切后回收目的片段， 与经同 样双酶切的 pGAPZαA 载体 (Invitrogen 公司产品 ) 定向连接， 连接产物转化 E.coli DH5α （美国 Stratagene 公司产品） 感受态细胞， 挑取单克隆接种含有抗生素的 LB 培养基进行 37℃振荡培养过夜， 质粒经小量制备后酶切及测序鉴定。 选取鉴定正确的质粒分别命名为 ： pGAPZ-α-PrMED1、 pGAPZ-sPrME472-D2、 pGAPZ-sPrME-D3 和 pGAPZ-sPrME-D4， 将鉴定正确 的重组载体转化到 P.pastoris 酵母细胞中， 获得稳定表达的工程菌， 分别于 2011 年 3 月
     14 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心， 编号分别为 CCTCC M 2011063、 CCTCC M 2011064、 CCTCC M 2011065 和 CCTCC M 2011066。
     上述重组载体的构建示意图如图 1 所示。
     二、 重组载体转化毕赤酵母 将 重 组 载 体 【 pGAPZ- α -PrMED1 ， pGAPZ-sPrME472-D2 ， pGAPZ-sPrME-D3 ， pGAPZ-sPrME-D4， 】 以及空载体 pGAPαA 的 DH5α 培养菌液离心后收集菌体， 提取质粒。用 Bgl II 酶分别将上述重组质粒线性化。反应体系 ： 10×buffer L 100 μl， 重组质粒 200 μl， Bgl II 50 μl， ddH2O 50 μl。离心混匀后， 分装成 20 μl/ 管， 37℃酶切过夜。取 100 μl 制备好的毕赤酵母 X33 感受态细胞， 与 10 μg 线性化的质粒 DNA 混合， 转移到预冷 的 0.2 cm 的电转化杯中， 冰浴 5 min， 在 Bio-Rad 电转化仪中进行电击转化， 电脉冲参数为 电压 1500 V， 5 ms。电击后立即加入 1 ml 预冷的 1 mol/L 山梨醇， 将混合液转移到 1.5 ml 离心管， 30 ℃温育 1 h。取 200 μl 铺在含有 100 ～ 500 μg /ml Zeocin 的 YPD 平板上， 30 ℃恒温培养培养 2 ～ 3 天至平板长出乳白色酵母转化菌落。
     三、 酵母转化子的 PCR 鉴定 挑取上述酵母转化菌落， 用酵母表达载体的上下游通用引物 5’ pGAPForward/3’ AOX I， α-factor/3’ AOX I, Y1/3’ AOX I 分别进行 PCR 检测， PCR 反应体系 ： 10×Taq 缓冲液 5μl， dNTPs （2.5mM） 5 μl， 酵母转化子 0.5 μl， 上下游引物各 2.5 μl， rTaq 酶（5U/ul） 1 μl， ddH2O 33.5 μl。结果如图 2 所示。
     四、 DENV1 ～ 4VLPs 的 Western blot 鉴定 挑取经 PCR 鉴定为阳性的含有重组载体 【pGAPZ-α-PrMED1， pGAPZ-sPrME472-D2， pGAPZ-sPrME-D3， pGAPZ-sPrME-D4， 】的 酵 母 转 化 子 分 别 接 种 于 3 ml YPD 液 体 培 养 基 （100μg/ml Zeocin） 中， 30 ℃， 250 rpm 有氧振荡培养 12 h。接着按 1:100 比例将菌液转 至 100 ml 新鲜 YPD 发酵培养液中， 30 ℃振荡培养 120 h， 4 ℃ 10,000 rpm 离心， 分别收集 上清和菌体， 保存于－ 70 ℃备用。用裂解缓冲液 （50 mM NaH2PO4,1 mM PMSF,1 mM EDTA， 5% glycerol， pH 7.4） 裂解细胞。以空载体 pGAPα A 的 X33 转化子作对照。
     取 80 μl 上清与 20 μl 5× 上样缓冲液混合， 20 μl 细胞裂解液与等量的 2× 上 样缓冲液混合， 煮沸 10 min。 样品冷却后， 进行 SDS-PAGE。 每个点样孔加 30 μl 样品。 电泳 结束后， 将一块胶进行考马斯亮蓝染色， 相同点样顺序的另一块胶进行 Western blotting 检测。经半干电转法， 将蛋白转移到 PDVF 膜上， 以 DENV1 ～ 4 的抗 E 单抗 （商品化试剂） 或 以抗 DENV1 ～ 4 免疫的多抗血清为一抗， HRP 标记羊抗鼠 IgG 为二抗 （1 ： 2000 美国 Sigma） ，
     DAB 显色， 结果如图 6 所示。在各重组子的细胞裂解液和发酵上清均可检测到约 50 kDa 的 E 蛋白和 20 kDa prM 蛋白。
     实施例 3 DENV1 ～ 4VLPs 的制备和鉴定 一、 蔗糖密度梯度离心分离病毒样颗粒 收获培养的酵母细胞， 将细胞裂解液上清用 10 ～ 50 ％蔗糖密度梯度超速离心法对 DENV1-4 VLPs 进行纯化， 吸取 30 ～ 40% 含絮状的病毒样颗粒层进行 SDS-PΑGE 和 Western blotting 检测。图 7 为纯化 VLPs 的 Western blot 鉴定图。
     二、 电镜技术检测病毒样颗粒 将上述纯化法得到的含病毒样颗粒的溶液层进行负染电镜观察 , 如图 8 所示， 直径为 30 nm 和 55 nm 直径的 VLPs 均被检测到。用一定稀释浓度的抗 DENV-2 血清进行免疫电镜 观察， 如图 9， 亦观察到直径为 30 nm 和 55 nm 直径的 VLPs。收集培养 72h 的重组酵母细胞 进行透射电镜观察表达 VLPs 的重组酵母细胞超微结构， 如图 10 所示， 在酵母细胞的胞浆中 形成了许多双层膜囊泡结构， 每个囊泡中都充满了直径约为 30-55 nm 左右呈结晶状排列 的 DENV-2 VLPs， 本发明的 VLPs 无论是在形态结构， 蛋白和膜组份， 甚至在颗粒的组装上都 与感染细胞释放的 DENV 病毒粒子具有类似的特征。 实施例 4 DENV1 ～ 4VLPs 的初步免疫学研究 一、 免疫方案 4-6 周龄 Balb/c 小鼠， 在 0、 7、 28 天注射 DENV-1 VLPs 或 DENV-2 VLPs， 灭活病毒免疫 组和 PBS 免疫组作为对照。
     二、 ELISA 检测血清抗体 1. 标准抗原的滴定 ： 包被纯化的 VLPs， 进行倍比稀释。 一抗为 1:100 稀释的抗 VLPs 血 清。测定 OD450nm 的吸收值， 以阳性 OD/ 阴性 OD 大于 2.1 为抗原最高稀释度。
     2. 抗原包被 ： 将纯化的 VLPs 抗原， 按 100 μl/ 孔加入 96 孔板中， 37℃， 1h， 然后 置于 4℃过夜。PBST 洗板 3 次 ； 3. 封闭 ： 加入 4％ BSA 的 PBST， 200 μl/ 孔， 37℃封闭 1h ； 4. 加入从 1 ： 20 开始进行倍比稀释的各免疫组的血清， 100 μl / 孔， 37℃温育 1h， PBST 洗板 3 次 ； 5. 加入 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG(1:3000)， 100 μl/ 孔， 37℃温育 1h， PBST 洗板 3 次； 6. 加入 TMB 底物 100 μl/ 孔， 37℃温育 40 min。加入终止液 50 μl/ 孔， 测定波长 为 450 nm 的 OD 值 , 以阳性血清 OD/ 阴性血清 OD 大于 2.1 的血清稀释度为最高的抗体稀 释倍数。结果如图 11 所示。
     三、 中和试验检测血清抗体的中和活性 1. 将 DENV-2 NGC 株病毒作 10 倍系列稀释 （用 MEM 维持液） ， 接种细胞板， 每稀释度接 种 4 孔， 37℃培养逐日观察病变情况， 并记录。 最后根据能使 50% 细胞产生病变计算 TCID50。
     2. 将各免疫组血清用 0.22 μm 的滤膜过滤， 然后在 56℃水浴， 灭活 30 min。
     3. 用无血清的 MEM 将血清进行倍比稀释 1 ： 8~1 ： 256。
     4. 用 MEM 维持液将 DENV-2 稀释成 100 TCID50。
     5. 将等量的 100 TCID50 DENV-2 稀释液与不同稀释度的血清进行混合， 然后在
     37℃水浴， 中和 1h。每稀释度种 4 孔细胞， 在 37℃ CO2 温箱培养 7 天后观察细胞病变并记 录。设灭活 DENV-2 免疫血清加病毒对照， PBS 血清加病毒对照， PBS 血清加 MEM 对照。
     6. 根据细胞病变计算 50% 血清中和终点， 即能保护 50% 细胞不产生病变的血清稀 释度。即为其中和效价。所测中和效价为 1 ： 16 ～ 1 ： 45。
     进一步地， 本发明还对 DENV-3 VLPs 和 DENV-4 VLPs 的免疫原性进行了初步检测， 结果表明二者均能产生具有一定中和活性的抗体。
     虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。