黄芩乳酸菌发酵物、含发酵物的化妆品及制备方法和用途.pdf

本发明属于生物发酵领域，具体涉及黄芩乳酸菌发酵物、含发酵物的化妆品及制备方法和用途。本发明所解决的技术问题是以“生物转化理论”为指导，采用黄芩与乳酸菌的液体发酵体系提供一种具有美白、祛痘控油功效的产品。本发明黄芩乳酸菌发酵物是以黄芩和水组成培养基，然后与乳酸菌发酵所得的发酵液体混合物；其中，培养基中以生药重量计，含有重量百分比为5～10％的黄芩；乳酸菌的接种量为1.0×104～1.0×108cfu/ml。

权利要求书
1.  黄芩乳酸菌发酵物，其特征在于：以黄芩和水组成培养基，然后接种乳酸菌发酵所得的液体发酵混合物；其中，培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为3～8％。

2.  根据权利要求1所述的黄芩乳酸菌发酵物，其特征在于：培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为5％。

3.  根据权利要求1或2所述的黄芩乳酸菌发酵物，其特征在于：所述黄芩为原生药材或黄芩饮片。

4.  根据权利要求1-3任一项所述的黄芩乳酸菌发酵物，其特征在于：培养基中乳酸菌的接种量为1.0×104～1.0×108cfu/ml；优选，培养基中乳酸菌的接种量为1.0×106cfu/ml。

5.  黄芩乳酸菌发酵物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、以黄芩和水组成培养基，以生药重量计，黄芩重量百分比为3～8％；
B、灭菌后接种乳酸菌，接种量为1.0×104～1.0×108cfu/ml；
C、于30℃～40℃和0-200rpm的条件下培养24～72小时后即得黄芩乳酸菌发酵物。

6.  根据权利要求5所述的黄芩乳酸菌发酵物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为5％；
乳酸菌的接种量为1.0×106cfu/ml；
步骤B所述“灭菌后接种乳酸菌”是指在105℃-115℃灭菌20-40min，冷却后再接种乳酸菌；优选的，所述“灭菌后接种乳酸菌”是指在115℃灭菌30min，冷却后再接种乳酸菌；
步骤C于37℃的条件下培养72小时。

7.  根据权利要求5所述的黄芩乳酸菌发酵物的制备方法，其特征在于：乳酸菌菌种的培养方法包括如下步骤：
A、在固体培养基中培养乳酸菌菌种；
B、将步骤A培养的乳酸菌接种入乳酸菌液体培养基中；
C、在30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天所得乳酸菌菌种。

8.  根据权利要求7所述的黄芩乳酸菌发酵物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
步骤B所述乳酸菌液体培养基中含有乳酸菌常规发酵的碳源、氮源、微量元素和/或无机盐成分；优选，培养基中碳源成分为液体培养基总重量的0.5％～10％，氮源成分为0.5％～3％，微量元素和/或无机盐成分为0.01％～1％，其余为水；
步骤A所述固体培养基是由步骤B中所述的乳酸菌液体培养基1000ml和琼脂10～20g组成；
优选步骤A培养条件为：在30-40℃和0-200rpm的条件下培养1-3天；进一步优选培养条件为：在37℃和50rpm的条件下培养1天。

9.  黄芩乳酸菌发酵物在制备具有美白、祛痘控油功效的药物或化妆品中应用。

10.  化妆品，其特征在于：以权利要求1-4任一项所述黄芩乳酸菌发酵物或其提取物为活性成分，加入化妆品上可接受的辅料制备而成的化妆品；
优选的，所述化妆品为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜。

说明书黄芩乳酸菌发酵物、含发酵物的化妆品及制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及黄芩乳酸菌发酵物、含发酵物的化妆品及制备方法和用途。
背景技术
《中国药典》记载，黄芩性味苦、寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。用于湿温、署湿，胸闷呕吐，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。《本草纲目》记载：“黄芩苦、平、无毒”。《本经》记载：“主治诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”。《别录》记载：“主治疗痰热胃中热，小腹绞痛，消谷，利小肠，女子血闭，淋露下血，小儿腹痛”。据现代药理学研究表明，黄芩具有抗肿瘤、抗菌、降血脂、保肝、利胆、抗氧化等作用。黄芩作为传统中药材，临床上对多种疾病的治疗都具有较好的疗效。近年来，黄芩在化妆品中的应用越来越多，其美白作用也有相关研究和应用。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，目前至少可分为18个属，共有200多种，绝大部分都是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌是能利用葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌。它不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，乳酸菌在美白保湿化妆品中均有所应用。
但黄芩和乳酸菌均未见有美白和祛痘控油等功效的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是以“生物转化理论”为指导，采用黄芩与乳酸菌的液体发酵体系提供一种具有美白、祛痘控油功效的产品。
本发明所解决的第一个技术问题是提供黄芩与乳酸菌的液体发酵所得的黄芩乳酸菌发酵物。
本发明黄芩乳酸菌发酵物，以黄芩和水组成培养基，然后接种乳酸菌发酵所得的液体发酵混合物；其中，培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为3～8％；乳酸菌的接种量为1.0×104～1.0×108cfu/ml。
上述技术方案中，培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为5％。黄芩为原生药材或黄芩饮片。
上述技术方案中，乳酸菌的接种量优选为1.0×106cfu/ml。
本发明所解决的第二个技术问题是提供本发明黄芩乳酸菌发酵物的制备方法，包括以下步骤：
A、以黄芩和水组成培养基，以生药重量计，黄芩重量百分比为3～8％；
B、灭菌后接种乳酸菌，接种量为1.0×104～1.0×108cfu/ml；
C、于30℃～40℃和0-200rpm的条件下培养24～72小时后即得黄芩乳酸菌发酵物。
上述技术方案中，培养基以生药重量计，黄芩重量百分比为5％。
上述技术方案中，乳酸菌的接种量优选为1.0×106cfu/ml。
上述技术方案中，步骤B所述“灭菌后接种乳酸菌”是指在105℃-115℃灭菌20-40min，冷却后再接种乳酸菌。进一步的优选，所述“灭菌后接种乳酸菌”是指在115℃灭菌30min，冷却后再接种乳酸菌。
上述技术方案中，步骤C优选于37℃的条件下培养72小时。
上述技术方案中，接种采用的乳酸菌菌种可以选择使用目前由各种常用方式培养得到的菌种，如用于制造泡菜、酸奶的乳酸菌种等。
其中，一种优选的菌种来源和培养方式为：
A、在固体培养基中培养乳酸菌菌种；
B、将步骤A培养的乳酸菌接种入乳酸菌液体培养基中；
C、在30℃～40℃和0～200rpm的条件下培养1～5天所得乳酸菌菌种。
上述技术方案中，步骤B所述乳酸菌液体培养基中含有乳酸菌常规发酵的碳源、氮源、微量元素和/或无机盐成分，其中：碳源成分为液体培养基总重量的0.5％～10％，氮源成分为0.5％～3％，微量元素和/或无机盐成分为0.01％～1％，其余为水，灭菌即可。其中所说的碳源、氮源都可以选择目前通用培养基中的常用成分，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、酵母膏等常规培养基组成成分。进一步优选所述灭菌为经115～121℃灭菌15～30min。
上述技术方案中，步骤A所述固体培养基是由步骤B中所述的乳酸菌液体培养基1000ml和琼脂10～20g组成，按同样方式作常规灭菌处理。培养条件为：在30-40℃和0-200rpm的条件下培养1-3天；优选培养条件为：在37℃和50rpm的条件下培养1天。
本发明所解决的第三个技术问题是提供本发明黄芩乳酸菌发酵物的用途，具体表现为本发明黄芩乳酸菌发酵物具有明显的抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，抑制主要青春痘致病菌产生的作用。即本发明黄芩乳酸菌发酵物具有明确的美白、祛痘控油的效果。同时，对人角质细胞增殖无抑制作用。
本发明所解决的第四个技术问题是提供采用本发明黄芩乳酸菌发酵物或其提取物为活性 成分，加入化妆品上可接受的辅料制备而成的化妆品。
本发明制备的化妆品可为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等常见的化妆品。
采用本发明黄芩乳酸菌发酵物用于肌肤的护理，通过抑制酪氨酸酶的活性，以及抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成，进而起到美白的效果，具有明确的美白功效。同时，通过“溶出性抗(抑)菌产品抑菌性能试验方法”，测定样品的对青春痘主要致病菌(如，痤疮丙酸杆菌，金黄色葡萄球菌)的抑菌率，考察得到具有明显的祛痘控油的作用。同时，通过研究其对人角质细胞增殖的抑制作用，可以得到黄芩乳酸菌发酵物作为化妆品使用不具有细胞毒性。本发明黄芩乳酸菌发酵物按常规方法制备的化妆品具有明确的美白和祛痘控油功效。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
实施例1 乳酸菌对黄芩-蒸馏水培养基的生长适应性及影响试验
(1)按1.0×105cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于3％、4％、5％、6％、7％和8％的黄芩-蒸馏水培养基(黄芩-蒸馏水培养基，以黄芩、蒸馏水为原料，混合后灭菌即可，其中均以黄芩生药重量百分比计，以下同此)中，于37℃和静置条件下培养2～4天，采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。结果如表1所示。
表1结果显示，当黄芩-蒸馏水培养基中黄芩的浓度为3-8％时，均一定程度可促进乳酸菌的生长；当黄芩-蒸馏水培养基中黄芩的浓度为5％时，乳酸菌的长势较佳且基本一致；当黄芩-蒸馏水培养基中黄芩的浓度大于5％时，乳酸菌的生长出现了下降的趋势；故优选采用黄芩-蒸馏水培养基中黄芩的浓度为5％。
表1 首次发酵黄芩浓度和发酵时间对乳酸菌培养的影响

由表1结果还可以看出，当培养时间为24～72小时，乳酸菌的生长处于对数生长期，生长速度快；当培养时间为72～96小时，乳酸菌的生长进入衰亡期，发酵液中的活菌数降低。因此，确定本发明中乳酸菌的发酵时间为72小时。
(2)按1.0×104、1.0×105和1.0×106cfu/ml接种量将乳酸菌分别接种于5％的黄芩-蒸馏水中，于37℃和静置条件下培养3天后，采用平板涂布法检测发酵液中的乳酸菌菌落数。结果如表2所示。
表2 接种量对乳酸菌培养的影响

由表2结果可以看出，发酵液中的活菌数随着接种量的增加而增加，因此，确定本发明中乳酸菌的接种量为1.0×106cfu/ml。
实施例2 本发明黄芩乳酸菌发酵物的美白和祛痘控油功效评价方法及结果
1、样品制备 
黄芩乳酸菌发酵物制备：按以上述由含黄芩5％的黄芩-蒸馏水混合物中接种乳酸菌1.0×106cfu/ml，在37℃、静置条件下发酵3天后除去液体，重新加入蒸馏水后37℃、静置条件下发酵2天得到的液体即为试验样品。
黄芩水提液：黄芩500g，水提，浓缩，冷冻干燥，试验前将样品溶解成试验所需浓度。
乳酸菌发酵液：5L蒸馏水中接种乳酸菌发酵，发酵条件按照黄芩乳酸发酵条件处理制备得到，所得发酵物经搅拌的匀浆5L，95℃加热浓缩至1L，过滤，取滤液，得发酵物原液。
黄芩提取液+乳酸菌发酵液混合物的制备：将黄芩提取液和乳酸菌发酵液按照不同比例混合，浓缩，冷冻干燥，试验前将样品溶解成试验所需浓度。
2、黄芩提取液与乳酸发酵液比例的确定
(1)试验方法
将黄芩提取液和乳酸发酵液按照1:2、1:1、2:1的比例混合后，冷冻干燥，将得到的三种样品制备成4mg/mL的浓度，以酪氨酸酶抑制试验为指标，确定黄芩提取液和乳酸发酵液的最佳配比。
酪氨酸酶为黑色素合成过程中的关键酶，直接影响黑色素的含量。具有美白作用的物质抑制酪氨酸酶的活性，而抑制黑色素的合成，起到美白的效果。
在各试管中分别加入磷酸缓冲液(pH6.8，0.1mol/L)、样品液、酪氨酸溶液。置于37℃水浴10min，然后加入酪氨酸酶，再于37℃水浴中反应10min，在475nm下测吸光度值。试验体系见表3，C1为空白对照，C2用于空白调零，T1为样品管，T2用于样品调零。
表3 酪氨酸酶抑制试验体系加样表

酪氨酸酶抑制率(％)＝(A0-A1)/A0×100％
A0：空白对照吸光度值
A1：样品吸光度值
(2)试验结果，见表3。
由表3试验结果可以看出，当黄芩提取液和乳酸发酵液配比为1:1时，对酪氨酸酶的抑制活性最强，与1:2和2:1的配比试验结果具有显著性差异。可知，以1:1作为后续试验的配比最好。
3、体外酪氨酸酶抑制试验
(1)试验方法
试验方法同“2、黄芩提取液与乳酸发酵液比例的确定”中酪氨酸酶抑制试验的试验方法。
(2)试验结果，见表4。
表4 酪氨酸酶抑制率

从表4试验结果可知，黄芩乳酸菌发酵物的酪氨酸酶抑制活性随着浓度的增加而增强，其IC50为2.22mg/mL，作用强度与阳性对照熊果苷相当。而与黄芩提取液、乳酸发酵液及两者的混合液样品相比，黄芩乳酸菌发酵物的作用明显强于前三者，揭示黄芩采用乳酸发酵后得到的发酵产物，产生了具有较强酪氨酸酶抑制活性的物质，开发为具有美白作用的化妆品潜力巨大。
4、抑制黑色素瘤细胞中黑色素的生成
(1)试验方法
B16细胞按2.0×104/400Μl/孔，加入24孔板中，培养24h后，加入受试样品，每个样品3个孔，样品终浓度为5、10、20、40、80、160μg/Ml。对照组以培养液代替受试样品。5％CO237℃孵育72h，弃去上清液。加入0.25％的胰酶进行消化，加入培养液终止消化，吹打成单细胞悬液，取部分细胞液进行细胞计数。其余细胞悬液离心后，弃去上清，加入1M NaOH，震荡5min，于490nm出测定吸光度值。
抑制率(％)＝[1-(样品孔吸光度值/样品孔细胞密度)/(对照孔吸光度值/对照孔细胞密度)]×100％
(2)试验结果，见表5。
表5 黑色素合成抑制率

从试验结果可知，黄芩乳酸菌发酵物对黑色素合成的抑制作用随着浓度的增加而增强，其IC50为5μg/mL，作用强度与阳性对照熊果苷相当，且高浓度时，对黑色素合成的抑制率高于氢醌。而与黄芩提取液、乳酸发酵液及两者的混合液样品相比，黄芩乳酸菌发酵物的作用明显强于前三者，揭示灵芝采用黄芩乳酸发酵后得到的发酵产物，产生了具有较强抑制黑色素合成的物质。说明黄芩乳酸菌发酵物具有很强的美白效果。由黄芩乳酸菌发酵物为原料，可以采用其发酵物原液或发酵物粉，按常规方法制备的爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等形式的化妆品也有明确的美白功效。
5、对青春痘主要致病菌的体外抑菌作用研究
(1)试验方法
a.培养基的制备：按常规方法制备培养基，调节pH值为7.1～7.2.将培养基加入小试管装1.8mL，塞子密封，经121℃高压灭菌30min后，置于冰箱中(4℃)保存备用。
b.菌悬液的制备：将标准菌株分别接种培养增菌，在常规条件下(厌氧培养罐培养)培养24h，吸取菌液用培养基稀释调整为0.5个麦氏比浊单位(约为1.5×108CFU/mg/ml)，将悬液用培养基稀释，用血细胞板计数将悬液调整为1×106～105CFU/ml，备用。
c.药敏试验管的制备：用移液枪向装有1.8ml培养基的小试管里分别加入20μl的0.1～3.2mg/ml浓度的供试药液，配制成一系列浓度梯度的药敏试验管。另外配制对照管：空白对照管(1.8ml培养基)、细菌生长对照管(1.8ml培养基、0.2ml菌悬液)、黄芩乳酸菌发酵物阳性对照管(1.8ml培养基、0.2ml菌悬液、20μlDMF)阳性对照管(1.8ml培养基、0.2ml菌悬液、阳性药物)，来观察细菌的生长情况、溶剂和药物对细菌生长的影响。
d.菌悬液的接种：所有药敏试验管菌用灭菌后的移液管接种0.2ml菌悬液，置于厌氧培养罐。于37℃条件下培养48h，观察结果，以不出现浑浊的最低浓度为该制剂的MIC。
(2)试验结果，表6和表7。
表6 样品对痤疮丙酸杆菌的MIC结果

+：表示长菌，-：表示未长菌 
从试验结果可知，所有的空白对照管、药物阳性对照管培养基澄清，说明药物溶剂1％DNF溶液对细菌的生长没有影响，对试验结果没有干扰。表6结果可以看到，黄芩乳酸菌发酵物对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml，黄芩提取液对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为16μg/ml、32μg/ml，黄芩提取液+乳酸发酵液对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为32μg/ml。乳酸菌发酵液对痤疮丙酸杆菌无抑菌作用。
表7 样品对金黄色葡萄球菌的MIC结果

+：表示长菌，-：表示未长菌 
样品对金黄色葡萄球菌的MIC结果从表7可以看到，黄芩乳酸菌发酵物对金黄色葡萄杆菌的MIC分别为8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml，黄芩提取液和黄芩提取液+乳酸发酵液对金黄色葡萄杆菌的MIC都为32μg/ml，同样乳酸发酵液对金黄色葡萄杆菌无抑菌作用。
6、抑制人角质细胞增殖试验
(1)试验方法
取对数期的Huke细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×103个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组和阳性对照组(十二烷基硫酸钠(SDS))，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO2培养箱中培养48h。试验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD570。计算抑制率。
抑制率(％)＝(样品组OD570-空白组OD570)*100/空白组OD570
试验结果如表8，四个样品对角质细胞的毒性极小或无细胞毒性，其中黄芩乳酸菌发酵物最为明显。
表8 样品对人角质细胞增殖影响

黄芩乳酸菌发酵物安全性试验采用通过的化妆品原料检测中的“急性经口和急性经皮毒性试验”以及“皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验”，试验结果均显示黄芩乳酸菌发酵物属于无毒、无刺激性、无腐蚀性的化妆品原料，可用于化妆品的配方中。