刘寄奴提取方法及其提取物的应用.pdf

刘寄奴提取方法及其提取物的应用
    【技术领域】
     本发明涉及化妆品工业， 尤其是一种刘寄奴提取方法及其提取物在化妆品中的应用。 背景技术 化妆品是流行性很强的商品， 其消费紧随社会潮流而动， 具有鲜明的时代特征。 随 着医学研究的深入， 广大消费者对使用化学合成物制造的化妆品持有更加谨慎的态度。近 年来， 化妆品生产开始原料的天然化， 人们希望通过天然动植物中的有效成分的添加， 达到 产品安全性和功效性的提高。
     皮肤是维护人体生命和健康的重要组成部分， 直接与外界接触， 是机体的第一道 屏障， 级易受到环境的影响而导致损伤。 除了年龄带来的老化因素外， 炎症和过敏等应激反 应， 污染， 紫外线都是引起皮肤衰老的重要原因。随着社会人口老龄化和环境的劣化， 人们 越来越需要长效， 高效的调节性和预防性护肤品， 所以为抗自由基， 抗氧化， 抗辐射等生理 活性的植物提取物提供了广阔的应用空间。这些天然植物的提取物具有副作用小， 疗效佳 的特点， 具体功效可归纳为抗炎， 防皱， 美白， 祛班， 止痒， 保湿， 减肥等方面。
     炎症是机体对各种致炎症因子引起的损伤所发生的以防御为主的反应， 常见的皮 肤炎症多是由细菌感染， 紫外线照射， 饮食因素引起的。皮肤炎症的局部表现为红， 肿， 热， 痛及功能障碍， 进一步可以诱导局部色素沉着， 产生色斑。 这些表现在急性体表炎症时较为 明显， 而内脏的炎症和慢性炎症则多不明显。 炎症不仅可以表现在局部， 而且也常引起全身 反应。常见的全身反应有发热， 血液中的白细胞数目增多以及心， 肝， 肾等实质性器官可出 现不同程度的变性， 坏死等病变。按病理分类， 炎症可分为变质性炎、 浆液性炎、 纤维素性 炎、 化脓性炎、 出血性炎、 卡他性炎、 增生性炎和慢性肉芽肿性炎。
     TNFα 是一种前体炎症细胞因子， 主要由单核细胞和巨噬细胞产生， 参与了包 括皮肤炎症在内的许多炎症反应的过程。内毒素 （LPS）是 TNFα 的诱导剂。研究发现， TNFα 具有多种生物学活性 ： 1） 杀伤或抑制肿瘤细胞 ； 2） 提高中性粒细胞的吞噬能力， 增 加过氧化物阴离子产生， 参与炎症反应 ； 3） 抗感染等。据文献报道， TNFα 抑制剂可用于 类风湿性关节炎、 幼年型类风湿关节炎、 骨性关节炎、 脊柱关节病、 炎性肠病、 心力衰竭、 糖 尿病、 系统性红斑狼疮、 硬皮病、 结节病、 皮肌炎、 银屑病、 多发性骨髓瘤、 骨髓增生异常综合 征、 急性髓型白血病、 帕金森氏症、 艾滋病痴呆综合征、 早老性痴呆、 抑郁症、 脓毒症、 坏疽 性脓皮病、 败血症、 感染性休克、 白塞氏病、 移植物抗宿主病、 葡萄膜炎、 Wegener's 肉芽肿、 休格连氏干燥症、 慢性阻塞性肺病、 哮喘、 急性胰腺炎、 牙周病、 恶病质、 癌症、 中枢神经系 (1-25) (1.Ogata H, Hibi T.et al Curr 统损伤、 呼吸道病毒感染、 肥胖等多种病症的治疗 Pharm Des. 2003; 9(14): 1107-13. 2. Moller DR.et al J Intern Med. 2003 Jan; 253(1): 31-40. 3. Taylor PC. Et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1095-106. 4. Wilkinson N et al Arch Dis Child. 2003 Mar; 88(3): 186-91. 5. Nishimura F et al J Periodontol. 2003 Jan; 74(1): 97-102. 6. Weinberg JM et al Cutis. 2003
     Jan; 71(1): 41-5. 7. Burnham E et al Crit Care Med. 2001 Mar; 29(3): 690-1. 8. Sack M. et al Pharmacol Ther. 2002 Apr-May; 94(1-2): 123-35. 9. Barnes PJ. Et al Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2002; 42:81-98. 10. Mageed RA et al Lupus . 2002; 11(12): 850-5. 11. Tsimberidou AM et al Expert Rev Anticancer Ther. 2002 Jun; 2(3): 277-86. 12. Muller T. et al Curr Opin Investig Drugs. 2002 Dec; 3(12): 1763-7. 13. Calandra T et al Curr Clin Top Infect Dis. 2002; 22:1-23. 14. Girolomoni G et al Curr Opin Investig Drugs . 2002 Nov; 3(11): 1590-5. 15. Tutuncu Z et al Clin Exp Rheumatol. 2002 Nov-Dec; 20(6 Suppl 28): S146-51. 16. Braun J et al Best Pract Res Clin Rheumatol. 2002 Sep; 16(4): 631-51. 17. Barnes PJ. Et al Novartis Found Symp. 2001; 234:255-67; discussion 267-72. 18. Brady M, et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol . 1999 Jul; 13(2): 265-89. 19. Goldring MB. et al Expert Opin Biol Ther. 2001 Sep; 1(5): 817-29. 20. Mariette X. Rev Prat. 2003 Mar 1; 53(5): 507-11. 21. Sharma R et al Int J Cardiol. 2002 Sep; 85(1): 161-71. 22. Wang CX et al Prog Neurobiol . 2002 Jun; 67(2): 161-72. 23. Van Reeth K et al Vet Immunol Immunopathol. 2002 Sep 10; 87(3-4): 161-8. 24. Leonard BE et al Int J Dev Neurosci. 2001 Jun; 19(3): 305-12. 25. Hays SJ et al Curr Pharm Des. 1998 Aug; 4(4): 335-48.)。
     刘寄奴 (《日华子本草》 )， 又名乌藤菜 (《通志》 )， 六月雪、 九里光 (《药材资料汇 编》 )， 白花尾、 炭包包、 千粒米、 斑枣子、 细白花草、 九牛草 (《湖南药物志》 )， 苦连婆 (《闽东 本草》 )。 为菊科植物奇蒿的全草。 多年生直立草本， 高 60 ～ 100 厘米。野生于山坡、 树 林下。分布江苏、 浙江、 江西、 湖南、 湖北、 云南、 四川、 贵州、 福建、 广西、 广东等地。于 8 月开 花时， 连根拔起， 晒干， 除去根及泥土， 打成捆。干燥的带花全草， 枝茎长 60 ～ 90 厘米， 通常 已弯折， 直径 2 ～ 4 毫米， 表面棕黄色至棕褐色， 常被白色毛茸， 茎质坚而硬， 折断面呈纤维 状， 黄白色， 中央白色而疏松。 刘寄奴具有破血通经， 散淤止疼， 醒脾消食之功效。现代药 理学研究证明， 刘寄奴提取物能解除平滑肌痉挛、 加速血液循环和促进凝血。 刘寄奴在常规 剂量内水煎服未见不良反应报道， 长期服用或大剂量 (30g 以下 ) 服用也没有明显副作用。 至今为止， 还没有发现刘寄奴具有皮肤美白功效之报道。
     现有文献未见有刘寄奴药材提取物及其衍生物、 类似物具有抑制 TNFα 产生活性 的报道。 发明内容 本发明的第一目的是提供一种刘寄奴提取物的提取方法， 是将菊科植物刘寄奴干 燥带花全草进行机械研磨粉碎， 制成粉末 ； 再将粉末经过有机溶剂的多次回流萃取提取而 成； 溶剂萃取出的组分经色谱法或分馏法进一步纯化， 分离得到刘寄奴提取物。
     所述刘寄奴的粉碎粒度为 100um-5000um; 采用 30-90% 的乙醇水溶液加热回流提 取； 药材与溶剂的比例为 1 ： 10 ； 萃取温度保持在 20-90℃之间 ； 提取时间在 8-24 小时之间 ； 乙醇提取液经 1-40% 活性炭脱色后浓缩。
     本发明的另一目的是提供一种刘寄奴提取物在化妆品中的应用， 是将刘寄奴提取 物作为植物添加剂添加到化妆品当中， 作为皮肤抗炎， 抗过敏， 美白祛斑防治中的天然植物
     添加剂。 上述作为添加剂的量为 0.01%-30% 重量百分比。
     上述的化妆品为软膏， 乳霜， 护肤霜， 护肤乳液， 粉底霜， 眼霜， 精华素， 洗面奶， 化 妆水， 面膜或防晒霜。
     本发明所涉及到的最新研究表明， 刘寄奴药材提取物对内毒素诱导的人外周血单 个核细胞产生的炎症信号因子 TNFa 具有抑制作用， 可以抑制皮肤及黏膜的炎症及过敏性 反应， 且一定浓度范围内呈剂量依赖关系， 具备了作为一种高效， 安全， 经济的植物组分进 一步开发成拮抗皮肤炎症或过敏反应及减缓皮肤色素沉着的外用护肤化妆品的充分和必 要条件。
     附图说明
     图 1 是本发明的刘寄奴干燥药材提取工艺流程图。 图 2 是刘寄奴提取抑制前体炎症因子 TNFa 的实验研究图。具体实施方式
     以下通过实施例对本发明做进一步说明， 阐述刘寄奴乙醇提取工艺及其在抗炎美 白祛斑防治中的有益效果。
     实施例 1- 刘寄奴乙醇提取物的制备 本发明中提及的刘寄奴乙醇提取物是由菊科植物刘寄奴干燥带花全草经过有机溶剂 的多次回流萃取提取而成。溶剂萃取出的组分经过色普法或分馏法进一步纯化， 分离得到 产品。
     所述刘寄奴的粉碎粒度为 100um-5000um; 采用 30-90% 的乙醇水溶液加热回流提 取； 药材与溶剂的比例为 1 ： 10 ； 萃取温度保持在 20-90℃之间 ； 提取时间在 8-24 小时之间 ； 乙醇提取液经 1-40% 活性炭脱色后浓缩备用。工艺流程如图 1 所示。
     样品药液经过进一步浓缩， 干燥， 制得刘寄奴乙醇提取物。产品外观为棕色粉末 （也可以以溶液或浸膏的形式存在） ， 主要化学成分 Flavonoids: 10~25% ； Saccharides: 5~10% ； Pigment:10~20%; Moisture:5~15%; Others: <50%， 其中挥发油含量占 0。025%。
     刘寄奴提取物鉴别方法如下 ： 取本品粉末 20g， 加石油醚 （沸程 60-90 ℃） 400ml 回流提取。减速压回收石油醚， 残 渣用少量乙酸乙酯溶解， 滤过， 滤液作为供试品溶液。另以 7- 甲氧基香豆素溶液作为对 照品溶液。照薄层色谱法 （中国药典 2010 版附录 VIB） 试验， 取供试品溶液和对照品溶液 分别点样于同一硅胶 G 薄层板上， 用已烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 （4 ： 1： 0.5） 展开， 在紫外光灯 （254-365nm） 下观察， 供试品色谱在与对照品色谱的相应位置上， 显相同的紫色荧光斑点。
     实施例 2 刘寄奴提取抑制前体炎症因子 TNFa 的实验研究 实验材料 ： 1. 细胞 ： 正常人外周血单核细胞 （PBMC） 2. 受试药物 ： 刘寄奴乙醇提取物 3. 阳性对照 ： 地塞米松 （美国 Sigma 公司产品） 4. 试 剂 ： Ficoll-Paque Plus (Amersham Bioscience) ； 内 毒 素 (LPS ，lipopolysaccharide) 和地塞米松 (CalBiochem.) ； TNFa ELISA Kit ( 晶美生物工程公 司) ； 二甲基亚砜 （DMSO） 为美国 Sigma 公司产品 ； 细胞培养基及胎牛血清 Gibco 公司为产 品 试验方法 : 新鲜血液以 EDTA 为抗凝剂， Ficoll 分离血细胞， 重悬细胞于含有 10％胎牛血清的 RIMP 1640 培养基中。在 96 孔板中加入 100 ??l 密度为 1×105 细胞 /ml 新分离的细胞， 每孔细 4 胞总数为 10 个， 每个样品作 3 个孔。
     1) 称取供试提取物， 加无菌 PBS 溶液配制供试品母液 （10mg/mL） ， 再使用无菌 PBS 稀释母液至相应工作浓度 (3, 10, 30, 100, 300ug/mL) 备用。
     2） 在培养板孔中加入 10??L 相应工作浓度的供试药物溶液， 使培养液中药物终浓 度分别为 0.3; 1; 3;10;30 ??g/ml， 阳性对照孔加 10 uM 地塞米松无菌水溶液。培养板置 于 37℃， 含 5% CO2 的培养箱中保温 15 分钟 ； 3) 加入 10 ??l 浓度为 100 ??g/ml 的 LPS， 置于 37℃含 5% CO2 的培养箱中孵育 16 小 时； 4) 培养板以 1000 rpm 离心 15 分钟， 将上清转移入新的培养板中， 遵照厂家提供的试 剂盒使用手册， 使用酶标仪测定培养上清液中 TNFa 浓度 ； 或冻藏于 -20℃， 避免反复冻融。
     抑制率 （%） = [1 － ( 药物处理组－空白组） / ( 内毒素处理组－空白组 )]×100 实验结果 ： 表 1. 刘寄奴提取物抑制 TNF?? 表达表 2. 刘寄奴提取物抑制 TNF?? 表达呈剂量依赖关系以上表 1、 表 2 和图 2 实验表明， 刘寄奴乙醇提取物明显抑制内毒素诱导的正常人外周 血单核细胞中前体炎症因子 TNFα 的表达， 且刘寄奴提取物对 TNFα 的抑制呈剂量依赖关 系。
     本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。 然而， 应理解的是， 在不偏离本发明之精 神与范围的前提下， 对上述描述的任何修饰都是允许的。 同样， 类似的情况也包括在权利要 求中。
     实施例 3 ： 制备护肤霜 ( 按重量比例计 )刘寄奴乙醇提取物 0.1-3% 甘油 3-8 % 辛酸 / 癸酸 / 三甘油酯 3-8 % 棕榈酸异辛酯 3-8 % 十六醇 / 十八醇 3-5 % C12-20 烷基葡糖苷 1-3 % 鲸蜡硬脂醇聚醚 -25 1-3 % 聚二甲基硅氧烷 1-3 % 矿油 3-8 % 羟苯甲酯 0.1-0.5% 苯氧乙醇 0.3-0.5% 香精 适量 去离子水 加之 100％ 配制方法 : 将去粒子水和水相的甘油、 羟苯甲酯加热至 80℃， 同时将油相的棕榈酸异 辛酯、 辛酸 / 癸酸 / 三甘油酯、 十六醇 / 十八醇、 C12-20 烷基葡糖苷、 鲸蜡硬脂醇聚醚 -25、 聚二甲基硅氧烷、 苯氧乙醇加热至 80℃， 将油相溶液搅拌下缓缓加入水相溶液中， 均质搅拌 2-5 分钟， 开启真空， 搅拌保温 15 分钟后搅拌降温， 降温至 50℃时加入刘寄奴乙醇提取物和 适量香精， 搅拌均匀即配成护肤霜。 实施例 4 ： 制备护肤水 ( 按重量比例计 ) 刘寄奴乙醇提取物 0.1-3% 甘油 3-8 % 海藻糖 0.1-1 % 柠檬酸 0.05-1 % 柠檬酸钠 0.2-2 % PEG-60 氢化蓖麻油 0.2-2 % 丁二醇 / 水 /DMDM 乙内酰脲 / 碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液 0.2-0.5% 乙醇 5 － 10％ 香精 适量 去离子水 加之 100％ 配制方法 ： 将去离子水、 甘油、 海藻糖加热至 80℃后保温 15 分钟， 后搅拌降温， 降温至 50℃时加入刘寄奴乙醇提取物和乙醇预溶液、 PEG-60 氢化蓖麻油和香精的预溶液以及丁二 醇 / 水 /DMDM 乙内酰脲 / 碘丙炔醇丁基氨甲酸酯溶液， 再用柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲溶液 调节 pH 至 5.5 － 6.5 以内， 搅拌均匀即配成护肤水。
     综上， 本发明刘寄奴提取物作为天然植物添加物可在皮肤抗炎， 美白或祛班化妆 品中应用。