人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用 技术领域 本发明属于肿瘤免疫学领域。具体地说本发明涉及一种新的人膀胱癌肿瘤标志 物 AG-α3β1 及其制备 (AG ： 异常糖基化 (AberrantGlycosylation))， 以及抗 AG-α3β1 的 单克隆抗体 BCMab1。细胞和组织学水平证明 ： AG-α3β1 只表达于人膀胱肿瘤细胞膜上， BCMab1 抗体不仅能够特异性识别 AG-α3β1， 而且在体外细胞水平和体内动物模型中能有 效地抑制人膀胱肿瘤细胞的增殖。本发明还涉及一种竞争性 ELISA 检测人膀胱癌的方法。 这种检测方法中的固定相抗原为本发明中的人膀胱癌肿瘤标志物 AG-α3β1， 检测抗体是 本发明中的抗人膀胱癌整合素 α3β1 抗体 BCMab1。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。尽管采用多种措施进行治疗， 但仍有 的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移， 而且这的患者要发生一次或多次复发，些治疗方法还有明显的毒副作用。
膀胱癌在肿瘤切除后的预防复发是临床的重要课题。 目前用于膀胱灌注预防复发 的药物主要分以下几类 ： (1) 抗肿瘤化疗药物， 如丝裂霉素 C 等 ； (2) 免疫增强剂， 如卡介苗 (BCG) 等。 (3) 细胞因子， 如干扰素等。 以上几类药物可以单独使用或联合使用， 虽在降低膀 胱癌术后复发率上取得一些效果， 但因特异性差、 肿瘤多耐药性 (MDR) 等问题的存在， 总体 疗效并不理想， 高达 的患者要发生一次或多次复发， 的患者发展成更高级别 的肿瘤或发生转移。 且以上各类药物分子量小， 不但可非特异性地作用于全膀胱及尿道， 还 可经膀胱及尿道粘膜吸收， 因而容易产生局部及全身的毒副作用。以疗效较为肯定的丝裂 霉素 C 及卡介苗为例 ： 使用卡介苗的患者 90％有 BCG 膀胱炎， 其它的副作用有血尿、 皮疹、 发热、 关节炎、 尿道狭窄等， 还有少见而严重的肝炎及肺炎、 致命性败血症等。丝裂霉素 C 的 副作用相对较少， 但仍有 膀胱壁钙化等副作用。 整合素 (integrin) 是一组二价阳离子依赖的细胞表面受体， 其主要功能是与相 应配体结合介导细胞与基质、 细胞与细胞的粘附， 进而影响细胞形态、 基因表达与调控、 细 胞增殖分化、 凋亡及肿瘤细胞的迁移、 浸润和转移等。整合素 α3 亚单位 (CD49c) 可与 β1 亚单位 (CD29) 结合形成整合素 α3β1， 其配体为层粘连蛋白 (LN) 和Ⅳ型胶原蛋白 (Collagen Ⅳ )。在上皮组织中， 整合素 α3β1 主要参与细胞与上皮细胞基底膜的粘连， 可 调节信号转导， 从而影响细胞的生物学特性。 它在肿瘤细胞表面的异常修饰， 被认为会导致 恶性度的改变。
抗肿瘤靶向药物是一种具有特异性识别、 杀伤肿瘤细胞的生物或化学分子 ( 如单 克隆抗体 )。膀胱癌是一种人体腔内肿瘤， 相当于一个人体的 “肉试管” ， 而导向药物在体外 对靶细胞具有高特异和强杀伤作用。寻找一种疗效好、 副作用少的新的抗人膀胱癌的导向 药物， 在膀胱癌的治疗上具有重要意义。
在膀胱肿瘤的筛查中， 膀胱癌的早期发现和正确的预后估计对临床治疗显得极为
3的化学性膀胱炎和过敏性反应， 还可见尿道狭窄、 骨髓抑制、102372773 A CN 102372776说明书2/7 页重要。近年新用于临床的分子标记， 如核基质蛋白、 膀胱肿瘤抗原和卫星不稳定性等， 也同 样受限于灵敏度和特异性低的不足。 尿脱落细胞学分析和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和 监测的金标准。所以， 寻求有效、 便利的膀胱癌的诊断方法是非常必要的。 发明内容
本发明利用人膀胱癌细胞系 T24 免疫小鼠， 获得杂交瘤细胞。用 ELISA 的方法筛 选到能与 T24 细胞高度特异结合的抗体 BCMab1。免疫组织化学和免疫荧光证实， BCMab1 抗 体与人膀胱癌细胞系 T24 及人膀胱癌组织呈强阳性反应， 与人正常膀胱组织和其它非膀胱 癌细胞无交叉反应。
本发明利用 BCMab1 抗体采用免疫亲和层析的方法捕获该抗体识别的抗原， 经过 质谱分析和糖芯片鉴定为异常糖基化修饰的整合素 α3β1， 命名为 AG-α3β1， 其表位为 糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。用 BCMab1 抗体证实， AG-α3β1 只表达 于人膀胱肿瘤细胞上， 并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相关。 AG-α3β1 可作为一种 新的人膀胱癌肿瘤标记物。
本发明利用 BCMab1 抗体， 处理体外培养的 T24 细胞和裸鼠移植瘤模型， 发现 BCMab1 抗体能有效地抑制膀胱癌细胞系 T24 的增殖。BCMab1 抗体可作为抗人膀胱癌的靶 向药物。 本发明利用 BCMab1 抗体和 AG-α3β1 抗原制备成诊断试剂， 即将人膀胱癌肿瘤标 志物 AG-α3β1 作为固定相， 与待测样品共同竞争 AbBC1 抗体， 检测人尿液中的膀胱肿瘤细 胞。
本发明的创新点在于 ： (1) 研制了一种抗人膀胱癌的鼠单克隆抗体 BCMab1， 该抗 体不仅能特异性地结合人膀胱癌组织， 而且在体内或体外能有效抑制膀胱癌细胞系 T24 的 增殖 ； (2) 揭示了这种抗体识别的抗原表位 AG-α3β1， 为一种新的人膀胱癌肿瘤标记物， 并证实了该表位只表达于人膀胱肿瘤细胞上， 并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相 关； (3) 开发了一种高灵敏度的竞争 ELISA 方法用于人膀胱癌的检测。
发明详述
本 发 明 提 供 了 一 种 新 的 人 膀 胱 癌 肿 瘤 标 记 物 —— 异 常 糖 基 化 的 整 合 素 AG-α3β1， 和产生抗该肿瘤标记物的单克隆抗体的杂交瘤细胞， 及其分泌的单克隆抗体 BCMab1， BCMab1 抗体识别的抗原表位为 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。该单克 隆抗体与人膀胱癌细胞系 T24 及人膀胱癌组织呈强阳性反应， 而与人正常膀胱组织和其它 非膀胱癌细胞无交叉反应。同时， 该单克隆抗体在体外细胞培养和动物肿瘤模型中具有抑 制膀胱癌细胞系 T24 增殖的功能。本发明还提供了包含单克隆抗体 BCMab1 体外诊断试剂 盒和使用单克隆抗体 BCMab1 检测尿脱落细胞中肿瘤标记物含量的方法。
更 具 体 地， 本 发 明 的 一 个 目 的 是 提 供 一 种 人 膀 胱 癌 肿 瘤 标 志 物 AG-α3β1， 其 为 异 常 糖 基 化 的 整 合 素 α3β1， 其 特 征 在 于 带 有 作 为 抗 原 表 位 的 糖 结 构 [3OSO3] Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc 的结 构式如下 ：
在本发明的一个优选实施方案中， 所述整合素 α3β1 的 α3 亚单位的氨基酸序列 如 SEQ ID No ： 1 所示， 所述整合素 α3β1 的 β1 亚单位的氨基酸序列如 SEQ ID No ： 2所 示， 优选所述异常糖基化是处在 α3 亚单位的第 740 位的氨基酸 T( 苏氨酸 ) 上。
本发明的另一个目的是提供针对本发明所述的人膀胱癌肿瘤标志物 AG-α3β1 的抗体， 其能够特异性识别所述作为抗原表位的糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3] GlcNAc， 所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体， 优选单克隆抗体。
在一个优选实施方案中， 所述的抗体是抗人膀胱癌整合素 α3β1 的单克隆抗体 BCMab1， 该单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No.3845 的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗人膀胱癌的药物组合物， 其包含本发明 上述的抗体。
在一个优选实施方案中， 所述的药物组合物还包含抗肿瘤化疗药物， 如丝裂霉素 C； 免疫增强剂， 如卡介苗 (BCG) ； 和 / 或细胞因子， 如干扰素。
本发明的另一个目的是提供一种缀合物， 其中所述抗人膀胱癌整合素 α3β1 的 抗体 BCMab1 与选自以下组成的组的物质缀合 ： 生物标记物、 抗肿瘤药物、 毒素和放射性活 性剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测或治疗人膀胱癌的试剂盒， 其包含本发 明上述的抗体。
在一个优选实施方案中， 在所述的试剂盒中， 所述检测是通过酶联免疫吸附法进 行， 优选所述酶联免疫吸附法是竞争酶联免疫吸附法， 其中将本发明上述的人膀胱癌肿瘤 标志物 AG-α3β1 作为固定相， 与待测样品共同竞争本发明上述的抗体。在一个优选实施 方案中， 所述待测样品是含尿脱落细胞的人尿液。
本发明还有的另一个目的是提供分泌抗人膀胱癌整合素 α3β1 的抗体 BCMab1 的 杂交瘤细胞株， 其保藏号为 CGMCC No.3845。
附图说明 图 1.BCMab1 单抗对人膀胱癌组织切片的免疫组化染色 ；
图 2.BCMab1 单抗对人正常膀胱粘膜组织切片的免疫组化染色 ；
图 3. 过碘化氧化实验 ( 过碘酸氧化实验原理 ： 过碘酸在酸性条件下能氧化糖蛋 白中糖的羟基而不改变多肽链结构 ))。在图 3 中， 膀胱癌细胞 T24 经过碘酸处理， 糖抗 原结构被破坏， BCMab1 抗体无法识别， 没有出现棕色的阳性反应。抗 -MUC1 抗体 ( 商购 自 Novocastra Laboratories Ltd， UK) 是已知的只结合糖结构的抗体， 在这里作为对照。 抗 -CK20 抗体 (Novocastra Laboratories Ltd， UK) 是已知的只结合蛋白多肽的抗体， 在这 里也作为对照 ；
图 4. 过碘化氧化实验 ( 斑点杂交实验， 结果与图 3 类似 )。将膀胱癌细胞 T24 裂
解后， 点在膜上， 经过碘酸处理， 糖抗原结构被破坏， BCMab1 抗体无法识别， 没有出现阳性反 应；
图 5. 糖芯片检测结果 ；
图 6.BCMab1 抗体抑制肿瘤细胞的增殖 ；
图 7. 整合素 α3 亚单位的氨基酸序列 ； 和
图 8. 整合素 β1 亚单位的氨基酸序列。 具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明， 所述实施例仅是意图举例说明本发明， 而不 是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例 1 ： BCMab1 单克隆抗体的制备和纯化
(1) 杂交瘤的制备
以人膀胱癌细胞系 T24(ATCC ： HTB-4) 免疫 Balb/C 小鼠 ( 商购自北京维通利华实 7 验动物技术有限公司 )， 以 1×10 个细胞 /ml PBS 的剂量进行腹腔注射。 2 周后对小鼠进行 再次免疫， 注射体积和方法不变。 待小鼠血清效价达到要求后准备进行细胞融合， 融合前三 天对小鼠进行加强免疫。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0(ATCC CRL-1772)。 将致敏的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 (《实用免疫学》 ， 杨廷彬主编， 长春 出 版 社， 1994 年 12 月 出 版 )， 用 HAT 培 养 基 ( 购 于 Invitrogen 公 司， HAT 系 次 黄 嘌 呤 (hypoxantin)、 氨基蝶呤 (aminopterin) 和胸腺嘧啶脱氧核苷 (thymidin) 三种物质各英文 首字之缀列， HAT 培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基 ) 进行选择性培养 ( 以小 鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞 )。
接着， 用 ELISA 方法检测杂交瘤细胞培养上清 ： 以 T24 细胞 (1×105 个 /ml) 包被 96 孔板， 每孔 100μl， 37℃培养过夜。细胞贴壁后， 加 4％多聚甲醛室温固定 10 分钟， 洗涤 3 次， 加待检上清 100μl， 37℃孵育 1 小时。洗涤 3 次， 加酶标二抗 ( 抗小鼠 IgG-HRP)( 商 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 )， 37℃孵育 1 小时。洗涤 3 次， 加 TMB( 北京中杉金桥 生物技术有限公司 )50μl 显色， 室温静置 5 分钟， 加终止液 50μl。 结果用酶标仪测定波长 450nm 的 OD 值， OD 值高于阴性对照 2 倍以上者可视为阳性。
然后， 将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养 ( 有限稀释法， 以小鼠腹腔巨噬细胞 为饲养细胞 )。经过 2-3 轮克隆化培养， 获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克 隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养， 并冻存保种。
本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人膀胱癌单克隆抗体杂交瘤细胞株， 该杂 交瘤细胞株于 2010 年 5 月 21 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC， 中国， 北京 )， 保藏号为 CGMCC No.3845。
(2)BCMab1 单抗的制备和纯化
将上述杂交瘤细胞 BCMab1 接种至 Balb/C 小鼠腹腔， 制备腹水， 再从腹水中提取单 抗。单抗 BCMab1 的纯化 ： 采用 Protein G 亲和层析法。首先制备 Protein G 亲和层析柱 ( 购于 “GE” 公司 )， 用 PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 平衡柱子后， 取含 BCMab1 单抗的腹水过柱， 然 后用 PBS 洗柱子， 至 OD 值接近于零， 以 0.2M 的甘氨酸 -HCl 溶液 (pH 2.8) 洗脱， 收集洗脱 液， 测定各收集管的 OD 值， 保留峰值区的洗脱液， 洗脱液经透析浓缩后 20℃冻存。
实施例 2 ： BCMab1 单抗的鉴定
在实施例 1 中制备的 BCMab1 单抗， 按常规方法对人膀胱癌组织切片 ( 获自北京大 学第三医院 ) 进行免疫组化染色， 结果如图 1、 2 所示。结果表明， 人膀胱癌组织经 BCMab1 单抗、 二抗 ( 抗小鼠 IgG-HRP) 及 DAB 底物 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 染色后呈阳 性反应， 而人正常膀胱组织经 BCMab1 单抗、 二抗及底物染色后呈阴性反应。
用 BCMab1 单抗， 按常规方法对膀胱癌细胞 T24 和其它细胞进行流式细胞仪检测， 以及用免疫组化检测人正常组织。结果如表 1 所示。结果表明， BCMab1 单抗与 T24 细胞呈 强阳性反应， 与其它非膀胱癌细胞无交叉反应， 与人正常组织无交叉反应。
表1
流式细胞术与免疫组化检测抗人膀胱癌单抗 BCMab1 对多种细胞与组织的免疫反 应
实施例 3 ： AG-α3β1 抗原的制备
人 膀 胱 癌 细 胞 系 T24 培 养 于 含 10 ％ 胎 牛 血 清 的 RPMI-1640 培 养 基 中 ( 购 于 Invitrogen 公司 )， 1×108 个 T24 细胞用 0.25 ％胰酶消化后， PBS 洗涤 3 次， 加入 100μg BCMab1 单抗， 4℃孵育 2 小时， PBS 洗涤 3 次， 用 1ml 三去污裂解液 (50mM Tris-HCl， pH 8.0 ； 150mM NaCl ； 0.02％叠氮钠 ； 0.1％ SDS ； 100μg/ml PMSF ； 1μg/ml Aprotinin ； 1％ NP-40 ； 0.5 ％脱氧胆酸钠 ) 裂解 30 分钟， 12,000g 离心 10 分钟， 取上清， 过 Protein G 亲和层析 柱。然后用 PBS 洗柱子， 至 OD 值接近于零， 以 0.2M 的甘氨酸 -HCl 溶液 (pH2.8) 洗脱， 收 集洗脱液， 测定各收集管的 OD 值， 保留峰值区的洗脱液， 进行质谱分析， 证实为人整合素 α3β1( 见表 2)。 用过碘酸氧化实验 (DaigoTsubokawa， Yukinobu Goso， Akira Sawaguchi，
et al.A monoclonal antibody， PGM34， against 6-sulfated blood-group H type 2antigen， on the carbohydratemoiety of mucin.FEBS J.2007Apr ； 274(7) ： 1833-48)， 结 合 BCMab1 抗体的糖芯片 ( 美国， The Consortium for Functional Glycomics) 检测数据， BCMab1 抗体识别的表位是人整合素 α3β1 上的糖链， 该表位是 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3) [6OSO3]GlcNAc( 见图 3、 4 和 5)， 并且该糖链是处在 α3 亚单位的第 740 位的氨基酸 T( 苏氨 酸 ) 上 (STSS 中的 T 上 )。由于 BCMab1 抗体只特异性地结合人膀胱癌组织， 表明该抗原为 异常糖基化修饰的整合素 α3β1(AG-α3β1)， 其表位 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3] GlcNAc 只表达于膀胱癌组织细胞。经鉴定， [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc 的结构式如下 ：
表2 BCMab1 抗原的质谱鉴定实施例 4 ： BCMab1 抗体抑制肿瘤细胞的增殖
将 T24 细胞按每孔 1×103 个细胞的密度接种于 96 孔板中， 常规培养至 70-80％的 密度， 用无血清培养基饥饿 24 小时。加入 100μg/mL 的 BCMab1 抗体， 恢复血清继续培养 48 3 小时， 同时以同型的小鼠 IgG 作为对照。细胞掺入 [ H]-TdR( 中国原子能科学研究院同位
素研究所合成 ) 孵育 4 小时， 用液闪仪 LKB1219( 瑞典 LKB 公司 ) 计数标定 [3H]-TdR 的量， 结果见图 6， 与对照组相比， BCMab1 抗体处理组体显著地抑制了肿瘤细胞的增殖。
实施例 5 ： 膀胱癌免疫诊断试剂的制备
利用本发明中所述 AG-α3β1 抗原和 BCMab1 抗体， 本发明开发出了一种高灵敏度 的竞争 ELISA 方法， 检测人尿液中膀胱肿瘤。主要方法是用 AG-α3β1 抗原作为固定相和 标准品， BCMab1 抗体作为检测抗体， 结合辣根过氧化酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG 的二 抗， 检测正常人和膀胱癌病人尿液中的膀胱癌 AG-α3β1 抗原。实验证实本发明的膀胱癌 免疫诊断试剂与已有技术相比具有以下积极效果 ： (1) 非损伤性， 直接检测尿液体， 避免了 膀胱镜检查给病人带来的不便与痛苦。(2) 灵敏度高， 特异性强， 远高于目前的膀胱肿瘤标记物 ( 如 ： 核基质蛋白、 细胞角蛋白、 透明质酸等 ) 的检测和尿脱落细胞的病理学检查。(3) 特异性强、 灵敏度高， 采用竞争 ELISA 法检测细胞中的膀胱癌抗原， 避免了细胞病理学方法 本身无法克服的人为性较高和特异性及灵敏度较低的缺点。 (4) 方便快捷， 适合于早期膀胱 癌患者的筛查和肿瘤复发的检测。
具体实验方法如下 ：
1) 样品来源及临床资料 ： 健康志愿者和膀胱癌患者的尿液均来自北京大学第三 医院。
2) 具体步骤 ：
i)ELISA 板包被抗原 ： 将 AG-α3β1 抗原用 PBS 稀释至 1μg/mL， 50μg/ 孔 4℃包 被平板过夜。
ii) 封闭非特异结合位点 ： 200μg/ 孔 2％的 BSA/PBS， 37 度孵育 2 小时。
iii) 样品孵育 ： 待测样品为新鲜尿液， 上样量 50μL， 健康志愿者的尿液取代样品 作为阴性对照。同时每孔加入 1μg/mL 的 BCMab1 抗体 50μL， 每个样品设两次重复， 37 度 孵育 1 小时。
iv)PBST 洗涤 5 次。
v) 加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 (Sigma 公司 )， 100μL/ 孔， 37℃孵育 1 小时。
vi)PBST 洗涤 5 次。
vii) 加入底物 ( 四甲基联苯胺， H2O2)100μl/ 孔， 室温避光孵育 10-20 分钟 ； 加入 2M H2SO450μL 中止反应 ； 在酶标仪上测定 OD 值 (450nm)。
3) 结果分析 ： 根据阴性 OD 值 /OD 临界值≈ 2.1， 得到 OD 临界值≈阴性 OD 值 /2.1， 根据 OD 临界值， 可判断其灵敏度和特异性。
临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力， 灵敏度是将实际有病的人 正确地判定为真阳性的比例。
本实验灵敏度＝ 82/(82+18)×％＝ 82％。
临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力， 特异度是将实际无病的人正确 地判定为真阴性的比例。
本实验特异度＝ 93/(7+93)×％＝ 93％。
尽管本发明的具体实施例已经描述如上， 但是可以知道本发明可以进行除了上述 说明以外的实践。本发明的保护范围不受说明书的限制。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。尽管采用多种措施进行治疗， 但仍有 的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移， 而且这的患者要发生一次或多次复发，些治疗方法还有明显的毒副作用。
膀胱癌在肿瘤切除后的预防复发是临床的重要课题。 目前用于膀胱灌注预防复发 的药物主要分以下几类 ： (1) 抗肿瘤化疗药物， 如丝裂霉素 C 等 ； (2) 免疫增强剂， 如卡介苗 (BCG) 等。 (3) 细胞因子， 如干扰素等。 以上几类药物可以单独使用或联合使用， 虽在降低膀 胱癌术后复发率上取得一些效果， 但因特异性差、 肿瘤多耐药性 (MDR) 等问题的存在， 总体 疗效并不理想， 高达 的患者要发生一次或多次复发， 的患者发展成更高级别 的肿瘤或发生转移。 且以上各类药物分子量小， 不但可非特异性地作用于全膀胱及尿道， 还 可经膀胱及尿道粘膜吸收， 因而容易产生局部及全身的毒副作用。以疗效较为肯定的丝裂 霉素 C 及卡介苗为例 ： 使用卡介苗的患者 90％有 BCG 膀胱炎， 其它的副作用有血尿、 皮疹、 发热、 关节炎、 尿道狭窄等， 还有少见而严重的肝炎及肺炎、 致命性败血症等。丝裂霉素 C 的 副作用相对较少， 但仍有 膀胱壁钙化等副作用。 整合素 (integrin) 是一组二价阳离子依赖的细胞表面受体， 其主要功能是与相 应配体结合介导细胞与基质、 细胞与细胞的粘附， 进而影响细胞形态、 基因表达与调控、 细 胞增殖分化、 凋亡及肿瘤细胞的迁移、 浸润和转移等。整合素 α3 亚单位 (CD49c) 可与 β1 亚单位 (CD29) 结合形成整合素 α3β1， 其配体为层粘连蛋白 (LN) 和Ⅳ型胶原蛋白 (Collagen Ⅳ )。在上皮组织中， 整合素 α3β1 主要参与细胞与上皮细胞基底膜的粘连， 可 调节信号转导， 从而影响细胞的生物学特性。 它在肿瘤细胞表面的异常修饰， 被认为会导致 恶性度的改变。
抗肿瘤靶向药物是一种具有特异性识别、 杀伤肿瘤细胞的生物或化学分子 ( 如单 克隆抗体 )。膀胱癌是一种人体腔内肿瘤， 相当于一个人体的 “肉试管” ， 而导向药物在体外 对靶细胞具有高特异和强杀伤作用。寻找一种疗效好、 副作用少的新的抗人膀胱癌的导向 药物， 在膀胱癌的治疗上具有重要意义。
在膀胱肿瘤的筛查中， 膀胱癌的早期发现和正确的预后估计对临床治疗显得极为
抗肿瘤靶向药物是一种具有特异性识别、 杀伤肿瘤细胞的生物或化学分子 ( 如单 克隆抗体 )。膀胱癌是一种人体腔内肿瘤， 相当于一个人体的 “肉试管” ， 而导向药物在体外 对靶细胞具有高特异和强杀伤作用。寻找一种疗效好、 副作用少的新的抗人膀胱癌的导向 药物， 在膀胱癌的治疗上具有重要意义。
在膀胱肿瘤的筛查中， 膀胱癌的早期发现和正确的预后估计对临床治疗显得极为
3的化学性膀胱炎和过敏性反应， 还可见尿道狭窄、 骨髓抑制、102372773 A CN 102372776说明书2/7 页重要。近年新用于临床的分子标记， 如核基质蛋白、 膀胱肿瘤抗原和卫星不稳定性等， 也同 样受限于灵敏度和特异性低的不足。 尿脱落细胞学分析和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和 监测的金标准。所以， 寻求有效、 便利的膀胱癌的诊断方法是非常必要的。 发明内容
本发明利用人膀胱癌细胞系 T24 免疫小鼠， 获得杂交瘤细胞。用 ELISA 的方法筛 选到能与 T24 细胞高度特异结合的抗体 BCMab1。免疫组织化学和免疫荧光证实， BCMab1 抗 体与人膀胱癌细胞系 T24 及人膀胱癌组织呈强阳性反应， 与人正常膀胱组织和其它非膀胱 癌细胞无交叉反应。
本发明利用 BCMab1 抗体采用免疫亲和层析的方法捕获该抗体识别的抗原， 经过 质谱分析和糖芯片鉴定为异常糖基化修饰的整合素 α3β1， 命名为 AG-α3β1， 其表位为 糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。用 BCMab1 抗体证实， AG-α3β1 只表达 于人膀胱肿瘤细胞上， 并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相关。 AG-α3β1 可作为一种 新的人膀胱癌肿瘤标记物。
本发明利用 BCMab1 抗体， 处理体外培养的 T24 细胞和裸鼠移植瘤模型， 发现 BCMab1 抗体能有效地抑制膀胱癌细胞系 T24 的增殖。BCMab1 抗体可作为抗人膀胱癌的靶 向药物。 本发明利用 BCMab1 抗体和 AG-α3β1 抗原制备成诊断试剂， 即将人膀胱癌肿瘤标 志物 AG-α3β1 作为固定相， 与待测样品共同竞争 AbBC1 抗体， 检测人尿液中的膀胱肿瘤细 胞。
本发明的创新点在于 ： (1) 研制了一种抗人膀胱癌的鼠单克隆抗体 BCMab1， 该抗 体不仅能特异性地结合人膀胱癌组织， 而且在体内或体外能有效抑制膀胱癌细胞系 T24 的 增殖 ； (2) 揭示了这种抗体识别的抗原表位 AG-α3β1， 为一种新的人膀胱癌肿瘤标记物， 并证实了该表位只表达于人膀胱肿瘤细胞上， 并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相 关； (3) 开发了一种高灵敏度的竞争 ELISA 方法用于人膀胱癌的检测。
发明详述
本 发 明 提 供 了 一 种 新 的 人 膀 胱 癌 肿 瘤 标 记 物 —— 异 常 糖 基 化 的 整 合 素 AG-α3β1， 和产生抗该肿瘤标记物的单克隆抗体的杂交瘤细胞， 及其分泌的单克隆抗体 BCMab1， BCMab1 抗体识别的抗原表位为 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。该单克 隆抗体与人膀胱癌细胞系 T24 及人膀胱癌组织呈强阳性反应， 而与人正常膀胱组织和其它 非膀胱癌细胞无交叉反应。同时， 该单克隆抗体在体外细胞培养和动物肿瘤模型中具有抑 制膀胱癌细胞系 T24 增殖的功能。本发明还提供了包含单克隆抗体 BCMab1 体外诊断试剂 盒和使用单克隆抗体 BCMab1 检测尿脱落细胞中肿瘤标记物含量的方法。
更 具 体 地， 本 发 明 的 一 个 目 的 是 提 供 一 种 人 膀 胱 癌 肿 瘤 标 志 物 AG-α3β1， 其 为 异 常 糖 基 化 的 整 合 素 α3β1， 其 特 征 在 于 带 有 作 为 抗 原 表 位 的 糖 结 构 [3OSO3] Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc 的结 构式如下 ：
在本发明的一个优选实施方案中， 所述整合素 α3β1 的 α3 亚单位的氨基酸序列 如 SEQ ID No ： 1 所示， 所述整合素 α3β1 的 β1 亚单位的氨基酸序列如 SEQ ID No ： 2所 示， 优选所述异常糖基化是处在 α3 亚单位的第 740 位的氨基酸 T( 苏氨酸 ) 上。
本发明的另一个目的是提供针对本发明所述的人膀胱癌肿瘤标志物 AG-α3β1 的抗体， 其能够特异性识别所述作为抗原表位的糖结构 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3] GlcNAc， 所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体， 优选单克隆抗体。
在一个优选实施方案中， 所述的抗体是抗人膀胱癌整合素 α3β1 的单克隆抗体 BCMab1， 该单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No.3845 的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗人膀胱癌的药物组合物， 其包含本发明 上述的抗体。
在一个优选实施方案中， 所述的药物组合物还包含抗肿瘤化疗药物， 如丝裂霉素 C； 免疫增强剂， 如卡介苗 (BCG) ； 和 / 或细胞因子， 如干扰素。
本发明的另一个目的是提供一种缀合物， 其中所述抗人膀胱癌整合素 α3β1 的 抗体 BCMab1 与选自以下组成的组的物质缀合 ： 生物标记物、 抗肿瘤药物、 毒素和放射性活 性剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测或治疗人膀胱癌的试剂盒， 其包含本发 明上述的抗体。
在一个优选实施方案中， 在所述的试剂盒中， 所述检测是通过酶联免疫吸附法进 行， 优选所述酶联免疫吸附法是竞争酶联免疫吸附法， 其中将本发明上述的人膀胱癌肿瘤 标志物 AG-α3β1 作为固定相， 与待测样品共同竞争本发明上述的抗体。在一个优选实施 方案中， 所述待测样品是含尿脱落细胞的人尿液。
本发明还有的另一个目的是提供分泌抗人膀胱癌整合素 α3β1 的抗体 BCMab1 的 杂交瘤细胞株， 其保藏号为 CGMCC No.3845。
附图说明 图 1.BCMab1 单抗对人膀胱癌组织切片的免疫组化染色 ；
图 2.BCMab1 单抗对人正常膀胱粘膜组织切片的免疫组化染色 ；
图 3. 过碘化氧化实验 ( 过碘酸氧化实验原理 ： 过碘酸在酸性条件下能氧化糖蛋 白中糖的羟基而不改变多肽链结构 ))。在图 3 中， 膀胱癌细胞 T24 经过碘酸处理， 糖抗 原结构被破坏， BCMab1 抗体无法识别， 没有出现棕色的阳性反应。抗 -MUC1 抗体 ( 商购 自 Novocastra Laboratories Ltd， UK) 是已知的只结合糖结构的抗体， 在这里作为对照。 抗 -CK20 抗体 (Novocastra Laboratories Ltd， UK) 是已知的只结合蛋白多肽的抗体， 在这 里也作为对照 ；
图 4. 过碘化氧化实验 ( 斑点杂交实验， 结果与图 3 类似 )。将膀胱癌细胞 T24 裂
解后， 点在膜上， 经过碘酸处理， 糖抗原结构被破坏， BCMab1 抗体无法识别， 没有出现阳性反 应；
图 5. 糖芯片检测结果 ；
图 6.BCMab1 抗体抑制肿瘤细胞的增殖 ；
图 7. 整合素 α3 亚单位的氨基酸序列 ； 和
图 8. 整合素 β1 亚单位的氨基酸序列。 具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明， 所述实施例仅是意图举例说明本发明， 而不 是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例 1 ： BCMab1 单克隆抗体的制备和纯化
(1) 杂交瘤的制备
以人膀胱癌细胞系 T24(ATCC ： HTB-4) 免疫 Balb/C 小鼠 ( 商购自北京维通利华实 7 验动物技术有限公司 )， 以 1×10 个细胞 /ml PBS 的剂量进行腹腔注射。 2 周后对小鼠进行 再次免疫， 注射体积和方法不变。 待小鼠血清效价达到要求后准备进行细胞融合， 融合前三 天对小鼠进行加强免疫。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0(ATCC CRL-1772)。 将致敏的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 (《实用免疫学》 ， 杨廷彬主编， 长春 出 版 社， 1994 年 12 月 出 版 )， 用 HAT 培 养 基 ( 购 于 Invitrogen 公 司， HAT 系 次 黄 嘌 呤 (hypoxantin)、 氨基蝶呤 (aminopterin) 和胸腺嘧啶脱氧核苷 (thymidin) 三种物质各英文 首字之缀列， HAT 培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基 ) 进行选择性培养 ( 以小 鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞 )。
接着， 用 ELISA 方法检测杂交瘤细胞培养上清 ： 以 T24 细胞 (1×105 个 /ml) 包被 96 孔板， 每孔 100μl， 37℃培养过夜。细胞贴壁后， 加 4％多聚甲醛室温固定 10 分钟， 洗涤 3 次， 加待检上清 100μl， 37℃孵育 1 小时。洗涤 3 次， 加酶标二抗 ( 抗小鼠 IgG-HRP)( 商 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 )， 37℃孵育 1 小时。洗涤 3 次， 加 TMB( 北京中杉金桥 生物技术有限公司 )50μl 显色， 室温静置 5 分钟， 加终止液 50μl。 结果用酶标仪测定波长 450nm 的 OD 值， OD 值高于阴性对照 2 倍以上者可视为阳性。
然后， 将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养 ( 有限稀释法， 以小鼠腹腔巨噬细胞 为饲养细胞 )。经过 2-3 轮克隆化培养， 获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克 隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养， 并冻存保种。
本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人膀胱癌单克隆抗体杂交瘤细胞株， 该杂 交瘤细胞株于 2010 年 5 月 21 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC， 中国， 北京 )， 保藏号为 CGMCC No.3845。
(2)BCMab1 单抗的制备和纯化
将上述杂交瘤细胞 BCMab1 接种至 Balb/C 小鼠腹腔， 制备腹水， 再从腹水中提取单 抗。单抗 BCMab1 的纯化 ： 采用 Protein G 亲和层析法。首先制备 Protein G 亲和层析柱 ( 购于 “GE” 公司 )， 用 PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 平衡柱子后， 取含 BCMab1 单抗的腹水过柱， 然 后用 PBS 洗柱子， 至 OD 值接近于零， 以 0.2M 的甘氨酸 -HCl 溶液 (pH 2.8) 洗脱， 收集洗脱 液， 测定各收集管的 OD 值， 保留峰值区的洗脱液， 洗脱液经透析浓缩后 20℃冻存。
实施例 2 ： BCMab1 单抗的鉴定
在实施例 1 中制备的 BCMab1 单抗， 按常规方法对人膀胱癌组织切片 ( 获自北京大 学第三医院 ) 进行免疫组化染色， 结果如图 1、 2 所示。结果表明， 人膀胱癌组织经 BCMab1 单抗、 二抗 ( 抗小鼠 IgG-HRP) 及 DAB 底物 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 染色后呈阳 性反应， 而人正常膀胱组织经 BCMab1 单抗、 二抗及底物染色后呈阴性反应。
用 BCMab1 单抗， 按常规方法对膀胱癌细胞 T24 和其它细胞进行流式细胞仪检测， 以及用免疫组化检测人正常组织。结果如表 1 所示。结果表明， BCMab1 单抗与 T24 细胞呈 强阳性反应， 与其它非膀胱癌细胞无交叉反应， 与人正常组织无交叉反应。
表1
流式细胞术与免疫组化检测抗人膀胱癌单抗 BCMab1 对多种细胞与组织的免疫反 应
实施例 3 ： AG-α3β1 抗原的制备
人 膀 胱 癌 细 胞 系 T24 培 养 于 含 10 ％ 胎 牛 血 清 的 RPMI-1640 培 养 基 中 ( 购 于 Invitrogen 公司 )， 1×108 个 T24 细胞用 0.25 ％胰酶消化后， PBS 洗涤 3 次， 加入 100μg BCMab1 单抗， 4℃孵育 2 小时， PBS 洗涤 3 次， 用 1ml 三去污裂解液 (50mM Tris-HCl， pH 8.0 ； 150mM NaCl ； 0.02％叠氮钠 ； 0.1％ SDS ； 100μg/ml PMSF ； 1μg/ml Aprotinin ； 1％ NP-40 ； 0.5 ％脱氧胆酸钠 ) 裂解 30 分钟， 12,000g 离心 10 分钟， 取上清， 过 Protein G 亲和层析 柱。然后用 PBS 洗柱子， 至 OD 值接近于零， 以 0.2M 的甘氨酸 -HCl 溶液 (pH2.8) 洗脱， 收 集洗脱液， 测定各收集管的 OD 值， 保留峰值区的洗脱液， 进行质谱分析， 证实为人整合素 α3β1( 见表 2)。 用过碘酸氧化实验 (DaigoTsubokawa， Yukinobu Goso， Akira Sawaguchi，
et al.A monoclonal antibody， PGM34， against 6-sulfated blood-group H type 2antigen， on the carbohydratemoiety of mucin.FEBS J.2007Apr ； 274(7) ： 1833-48)， 结 合 BCMab1 抗体的糖芯片 ( 美国， The Consortium for Functional Glycomics) 检测数据， BCMab1 抗体识别的表位是人整合素 α3β1 上的糖链， 该表位是 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3) [6OSO3]GlcNAc( 见图 3、 4 和 5)， 并且该糖链是处在 α3 亚单位的第 740 位的氨基酸 T( 苏氨 酸 ) 上 (STSS 中的 T 上 )。由于 BCMab1 抗体只特异性地结合人膀胱癌组织， 表明该抗原为 异常糖基化修饰的整合素 α3β1(AG-α3β1)， 其表位 [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3] GlcNAc 只表达于膀胱癌组织细胞。经鉴定， [3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc 的结构式如下 ：
表2 BCMab1 抗原的质谱鉴定实施例 4 ： BCMab1 抗体抑制肿瘤细胞的增殖
将 T24 细胞按每孔 1×103 个细胞的密度接种于 96 孔板中， 常规培养至 70-80％的 密度， 用无血清培养基饥饿 24 小时。加入 100μg/mL 的 BCMab1 抗体， 恢复血清继续培养 48 3 小时， 同时以同型的小鼠 IgG 作为对照。细胞掺入 [ H]-TdR( 中国原子能科学研究院同位
素研究所合成 ) 孵育 4 小时， 用液闪仪 LKB1219( 瑞典 LKB 公司 ) 计数标定 [3H]-TdR 的量， 结果见图 6， 与对照组相比， BCMab1 抗体处理组体显著地抑制了肿瘤细胞的增殖。
实施例 5 ： 膀胱癌免疫诊断试剂的制备
利用本发明中所述 AG-α3β1 抗原和 BCMab1 抗体， 本发明开发出了一种高灵敏度 的竞争 ELISA 方法， 检测人尿液中膀胱肿瘤。主要方法是用 AG-α3β1 抗原作为固定相和 标准品， BCMab1 抗体作为检测抗体， 结合辣根过氧化酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG 的二 抗， 检测正常人和膀胱癌病人尿液中的膀胱癌 AG-α3β1 抗原。实验证实本发明的膀胱癌 免疫诊断试剂与已有技术相比具有以下积极效果 ： (1) 非损伤性， 直接检测尿液体， 避免了 膀胱镜检查给病人带来的不便与痛苦。(2) 灵敏度高， 特异性强， 远高于目前的膀胱肿瘤标记物 ( 如 ： 核基质蛋白、 细胞角蛋白、 透明质酸等 ) 的检测和尿脱落细胞的病理学检查。(3) 特异性强、 灵敏度高， 采用竞争 ELISA 法检测细胞中的膀胱癌抗原， 避免了细胞病理学方法 本身无法克服的人为性较高和特异性及灵敏度较低的缺点。 (4) 方便快捷， 适合于早期膀胱 癌患者的筛查和肿瘤复发的检测。
具体实验方法如下 ：
1) 样品来源及临床资料 ： 健康志愿者和膀胱癌患者的尿液均来自北京大学第三 医院。
2) 具体步骤 ：
i)ELISA 板包被抗原 ： 将 AG-α3β1 抗原用 PBS 稀释至 1μg/mL， 50μg/ 孔 4℃包 被平板过夜。
ii) 封闭非特异结合位点 ： 200μg/ 孔 2％的 BSA/PBS， 37 度孵育 2 小时。
iii) 样品孵育 ： 待测样品为新鲜尿液， 上样量 50μL， 健康志愿者的尿液取代样品 作为阴性对照。同时每孔加入 1μg/mL 的 BCMab1 抗体 50μL， 每个样品设两次重复， 37 度 孵育 1 小时。
iv)PBST 洗涤 5 次。
v) 加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 (Sigma 公司 )， 100μL/ 孔， 37℃孵育 1 小时。
vi)PBST 洗涤 5 次。
vii) 加入底物 ( 四甲基联苯胺， H2O2)100μl/ 孔， 室温避光孵育 10-20 分钟 ； 加入 2M H2SO450μL 中止反应 ； 在酶标仪上测定 OD 值 (450nm)。
3) 结果分析 ： 根据阴性 OD 值 /OD 临界值≈ 2.1， 得到 OD 临界值≈阴性 OD 值 /2.1， 根据 OD 临界值， 可判断其灵敏度和特异性。
临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力， 灵敏度是将实际有病的人 正确地判定为真阳性的比例。
本实验灵敏度＝ 82/(82+18)×％＝ 82％。
临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力， 特异度是将实际无病的人正确 地判定为真阴性的比例。
本实验特异度＝ 93/(7+93)×％＝ 93％。
尽管本发明的具体实施例已经描述如上， 但是可以知道本发明可以进行除了上述 说明以外的实践。本发明的保护范围不受说明书的限制。
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