一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310046842.6	申请日：	2013.02.06
公开号：	CN103103168A	公开日：	2013.05.15
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 9/10申请日:20130206授权公告日:20140903终止日期:20150206\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/10申请日:20130206\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N9/10; C12N15/54; C12N15/63; C12N1/15; C12N1/19; C12N1/21; C12N5/10; A01H5/00	主分类号：	C12N9/10
申请人：	中国热带农业科学院橡胶研究所
发明人：	唐朝荣; 戚继燕; 周斌辉
地址：	571737 海南省儋州市宝岛新村
优先权：
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司 11245	代理人：	关畅;王慧凤
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内容摘要

本发明公开了一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进植物生长和提早开花相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。该基因也可作为巴西橡胶树高产转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快西橡胶树的生长速度。

权利要求书

权利要求书一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：
1)由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有促进植物生长和开花的相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。
根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为具有促进植物生长和开花的功能。
权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。
根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)、2)、3)或4)所示：
1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；
2)序列表中SEQ ID №：2自5′末端第366‑3188位核苷酸所示的核苷酸序列；
3)在严格条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4)与序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列具有90％以上的相似性的且编码蛋白具有与促进植物生长和开花的相关功能的核苷酸序列。
含有权利要求3或4所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
权利要求1所述的蛋白或其编码基因在培育生长速度加快和/或花期提前的转基因植物中的应用。
一种培育生长速度加快和/或开花期提前的植物的方法，是将权利要求3或4所述的编码基因导入目的植物中，培育得到生长速度加快和/或开花期提前的转基因植物。
根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求5所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。
根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为橡胶树或拟南芥。

说明书

说明书一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用
技术领域
本发明涉及一种来源于巴西橡胶树的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
植物体内的TPS/TPP途径是海藻糖合成的途径，其过程先是由6‑磷酸海藻糖合成酶(Trehalose‑6‑phosphate synthase，TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6‑磷酸葡萄糖(G‑6‑P)合成中间产物6‑磷酸海藻糖(T‑6‑P)，接着在6‑磷酸海藻糖磷酸酯酶(Trehalose‑6‑phosphate phosphatase，TPP)的催化作用下生成终产物海藻糖。而中间产物6‑磷酸海藻糖(T‑6‑P)在植物体内具有非常重要的地位，起着信号传导和调节植物生长与发育的作用。
Vuorio O.E等(1993)的研究结果表明，中间产物6‑磷酸海藻糖(T‑6‑P)在植物的生长和发育过程中起着决定性的作用，是公认的糖类新陈代谢调节器(Vuorio O.E，Kalkkinen N，Londesborough J.Cloning of two related genes encoding the 56‑kDa and 123‑kDa subunits of trehalose synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae.European Journal of Biochemistry，216(3)：849‑861)。Dijken A等(2004)的研究证明T‑6‑P在拟南芥植株的碳水化合物利用和它的生长发育过程中是必不可少的，是通过AtTPS1基因调节T‑6‑P的生物合成来控制植株的代谢状态(Dijken A，Schluepmann H，Smeekens S.Arabidopsis Trehalose‑6‑Phosphate Synthase 1 is essential for normal vegetative growth and transition to flowering.Plant Physiology，135：969‑977)。Zhang Y等(2009)的研究表明6‑磷酸海藻糖(T‑6‑P)充当SnRK1基因的抑制剂，是非生物胁迫压力和物质代谢信号的中央处理器，在植物生长组织中具有加快生物合成反应速度的功能(Zhang Y，Primavesi L F，Jhurreea D，et，al.Inhibition of SNF1‑related protein kinasel activity and regulation of metabolic pathways by trehalose‑6‑phosphate.Plant Physiology，149(4)，1860‑1871)。
以上研究显示，由TPS基因催化合成的6‑磷酸海藻糖(T‑6‑P)在植物的生长和发育过程中起着重要作用，可以促进植物的生长速度。巴西橡胶树通常在定植后6‑8年才可割胶，非生产期长。因此，研究巴西橡胶树6‑磷酸海藻糖合成酶基因控制6‑磷酸海藻糖生物合成的机制有助于了解橡胶树的生长调控。目前，在橡胶树中还未见有关6‑磷酸海藻糖合成酶基因的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的促进植物生长和开花的相关蛋白，来源于大戟科橡胶属的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)，名称为HbTPS2，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白质。
序列表中序列1由940个氨基酸残基组成。
为了便于序列1编码的HbTPS2纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签残基序列Poly‑Arg5‑6(通常为5个)RRRRRPoly‑His2‑10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep‑tag II8WSHPQFEKc‑myc10EQKLISEEDL
上述HbTPS2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述HbTPS2的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第366‑3188位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述促进植物生长和开花的相关蛋白(HbTPS2)的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述促进植物生长和开花的相关蛋白(HbTPS2)的编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)序列表中序列2自5′末端第366‑3188位核苷酸所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述促进植物生长和开花的相关蛋白的DNA分子；
4)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有促进植物生长和开花的相关功能的核苷酸序列。
序列表中序列2全长为3503个核苷酸，包含一个长度为2823个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5′端第366‑3188位核苷酸序列)、365nt的5′‑UTR(自序列2的5′端第1‑365位核苷酸序列)和315nt的3′‑UTR(自序列2的5′端第3189‑3503位核苷酸序列)，编码一个长度为940个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为106.01KDa的蛋白。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有所述促进植物生长和开花的相关蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
上述促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因在培育生长速度加快和/或开花期提前的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述生长速度加快为根和叶的生长速度加快；开花期提前为抽苔和/或开花的时间提前。
本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白HbTPS2，在遇到非生物胁迫时，HbTPS2的编码基因在巴西橡胶树幼苗一些组织中的表达量有明显的上升。把该基因的全长cDNA序列导入酵母TPS基因突变株中，发现能够互补酵母突变株的TPS功能。再把该基因转到野生型拟南芥中，得到转基因阳性植株。当种子在MS培养基上培养10天后，观察到转基因拟南芥幼苗根的生长速度比野生型拟南芥快；在移栽到营养土中培养10天后，发现转基因拟南芥的叶片长势明显的比野生型拟南芥旺盛；在营养土中培养一个月后，发现野生型拟南芥还未到抽苔开花期，而转基因拟南芥已经抽出近15cm的茎干，并且到了开花期。因此该基因也可作为巴西橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快巴西橡胶树的生长速度和提早开花，并且在受到胁迫后能够作为信号受体起着信号传递的作用。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在巴西橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用，加快它们的生长速度。
附图说明
图1为HbTPS2基因在低温胁迫下的表达分析。
图2为HbTPS2基因在高温胁迫下的表达分析。
图3为HbTPS2基因在干旱胁迫下的表达分析。
图4为酵母TPS基因突变株的培养性状实验。图4中A为酵母TPS基因突变株在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片，图4中B为酵母TPS基因突变株在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片。
图5为酵母互补实验结果。图5中A为含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基；B为含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基；W303‑1A表示野生型酵母W303‑1A，tpsΔ+pDR196表示转pDR196的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR‑HbTPS2‑CDS表示转pDR‑HbTPS2‑CDS的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR‑HbTPS2‑全长表示转pDR‑HbTPS2‑全长的酵母TPS基因突变株。
图6为野生型和转HbTPS2(pCXSN‑HbTPS2)基因拟南芥在培养不同时间的生长情况比较。
具体实施方式
下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1.本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因的获得
搜索本申请人构建的巴西橡胶树胶乳EST序列数据库，确定一条492bp左右的巴西橡胶树6‑磷酸海藻糖合成酶基因EST组装后序列(contig)，设计一对特异性引物扩增得到该cDNA片段，并利用cDNA末端的快速扩增技术(RACE)，最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。
具体方法如下：
<1>cDNA片段克隆
特异性引物设计如下：
SP1(5’端)：5’‑GCCTTTTTCTTGGGTCCATTAT‑3’；
SP2(3’端)：5’‑GCCTCCAGCACTTATCTCCAAA‑3’。
以巴西橡胶树热研7‑33‑97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，SP1和SP2为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环；72℃延伸10min。获得一段490bp左右的核苷酸片段，为6‑磷酸海藻糖合成酶基因cDNA片段。
<2>5’端RACE
根据6‑磷酸海藻糖合成酶基因cDNA片段的测序结果设计5’RACE和3’RACE引物，通用引物QT(5’‑CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCT CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT‑3’)，Q0(5’‑CCAGTGAGCAGAGTGACG‑3’)和Q1(5’‑GAGGACTCGAGCTCAAGC‑3’)的序列及RACE操作流程参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G S.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京：科学出版社，1998：268～277)。进行5’RACE时，以随机引物进行巴西橡胶树热研7‑33‑97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)胶乳RNA的cDNA第一链合成，反应产物经乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后，利用末端转移酶TdT催化加polyA尾巴。第一轮扩增以加尾的cDNA为模板，使用引物QT、Q0和第一轮基因特异引物(5’‑TCCAGGCATACGCTCACTCTA‑3’)，引物终浓度分别为0.04μmol/L、0.4μmol/L和0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：首先，94℃变性5min，50℃退火2min，72℃延伸40min；然后，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30次循环；最后，72℃延伸10min。PCR产物稀释100倍后，取1μl稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Q1和第二轮基因特异引物(5’‑CATAATGGACCCAAGAAAAAGG‑3’)进行第二轮嵌套扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30次循环；72℃延伸10min。获得一段600bp左右的核苷酸片段。
<3>3’端RACE
进行3’RACE时，以50ng的QT为引物进行巴西橡胶树热研7‑33‑97叶片RNA的cDNA第一链合成。以cDNA产物为模板，使用终浓度都为0.4μmol/L的Q0和第一轮引物(5’‑GATGTGAAAATCAGGATGGCA‑3’)进行第一轮PCR扩增，扩增程序与5’RACE的第一轮PCR扩增程序相同。第一轮PCR产物稀释100倍后，取1μl稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Q1和第二轮基因特异引物(5’‑TTGGAGATAAGTGCTGGAGGC‑3’)进行第二轮嵌套扩增，扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，共30次循环；72℃延伸10min。获得一段2400bp左右的核苷酸片段。
<4>HbTPS2 cDNA全长克隆
根据所得到的巴西橡胶树HbTPS2基因的cDNA片段，5’端和3’端扩增序列，利用DNAMAN软件进行序列拼接，得到HbTPS2基因全长cDNA的拼接序列。根据拼接序列，分别在5’末端和3’末端设计一条引物(2‑1F(正义链引物)：5’‑AGACTTCTTCTGGGCATTTGTTT‑3’，2‑3503R(反义链引物)：5’‑AAAAGAAAAATAAATATTTATAAGGTACAA‑3’)。以巴西橡胶树热研7‑33‑97胶乳cDNA为模板，进行PCR扩增，引物终浓度均为0.4μmol/L，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸4min，共30次循环；72℃延伸10min。将该PCR获得的片段连接到pMD18‑T载体(TaKaRa)进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的6‑磷酸海藻糖合成酶基因，该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表中序列2全长为3503个核苷酸，包含一个长度为2823个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列2的5’端第366‑3188位核苷酸序列)、365nt的5’‑UTR(自序列2的5’端第1‑365位核苷酸序列)和315nt的3’‑UTR(自序列2的5’端第3189‑3503位核苷酸序列)，编码一个长度为940个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为106.01KDa的蛋白，即为6‑磷酸海藻糖合成酶(本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白)，将该6‑磷酸海藻糖合成酶命名为HbTPS2，其编码基因命名为HbTPS2。将上述含有序列2的核苷酸的pMD18‑T重组载体命名为pMD18‑HbTPS2。
实施例2.巴西橡胶树幼苗HbTPS2基因在非生物胁迫下的表达模式分析
本研究选取生长四个月的巴西橡胶树热研7‑33‑97组培苗先在营养液中预适应1个月，挑选生长状况相似的幼苗进行三种非生物胁迫处理。
低温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中4℃培养，分别在0h、3h、6h、12h、24h5个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。
高温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中40℃培养，分别在0h、3h、6h、12h、24h5个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。
干旱胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在含有20％PEG6000的营养液中培养，分别在0h、3h、6h、12h、1d、2d、4d、7d8个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取RNA备用。
对上述提取的RNA用DNaseI消化其中的基因组DNA后进行反转录，采用荧光定量技术，分析该基因在不同胁迫中的表达模式。HbTPS2基因荧光定量引物(rTPS2‑F：5’‑TTATGCCTACCTTAACAGGAACC‑3’(正义链引物，对应序列表中序列2的第3352‑3374位核苷酸)，rTPS2‑R：5’‑TACAATTTGTTGATATAC TCTAGGGC‑3’(反义链引物，对应序列表中序列2的第3453‑3478位核苷酸))。
结果显示：在低温胁迫处理后，HbTPS2基因在木质部和根中的表达量呈现递增的趋势，都在处理3h后其表达量达到最大值，约为对照(0h时的表达量)的3倍；处理12h后在树叶中的表达量达到最大值，为对照(0h时的表达量)的1.5倍，其后表达量又降低至对照(0h时的表达量)的0.5倍；而在树皮中有略微下降的趋势(图1)。
在高温胁迫处理后，HbTPS2基因的表达量在根中呈现大幅度上升的趋势，在处理24h后达到最大值，为对照(0h时的表达量)的22倍；在树皮中有略微上升，在处理3h时达到最大值，约为对照(0h时的表达量)的2倍；而在树叶和木质部中变化不明显(图2)。
在干旱胁迫处理后，HbTPS2基因的表达量在树叶中呈现下降的趋势，在处理2天后达到最小值，为对照(0h时的表达量)的1/5；在树皮中的表达量是先略微下降再恢复至原始水平，总体变化趋势不明显；处理2天后在木质部中的表达量达到最大值，接近对照(0h时的表达量)的2倍；而在根中的表达量是先下降再上升，在处理12h后达到最小值，约为对照的1/3，在处理4天后达到最大值，约为对照的1.5倍，在处理7天后恢复到原始水平(图3)。
结果表明巴西橡胶树幼苗在遇到胁迫作用时会调节HbTPS2基因表达量的上升，从而合成更多的6‑磷酸海藻糖来传递胁迫处理产生的信号。
实施例3.HbTPS2基因酵母功能互补验证
<1>酵母TPS基因突变株的制备
设计两端分别带有TPS同源臂的Trp标签基因引物(Trp‑TPS‑F：5’‑CGTACACTTTCAAGTGGTTCGGATGGCCTGGGCTAGAGCACACAAAGG CAGCTTGGAG‑3’；Trp‑TPS‑R：5’‑ACACTTCCATGGCGTGCAACTTCTGAGGC ACACCTTTAGTAATAACCTATTTCTTAGC‑3’)，以pGBKT7质粒(Baisheng Zang et al.Analysis of trehalose‑6‑phosphate synthase(TPS)gene family suggests the formation of TPS complexes in rice.Plant Molecular Biology.2011，76(6)：507‑522.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)为模板进行PCR扩增，得到706bp的片段。
把带同源臂的Trp标签基因回收片段通过同源重组技术取代酵母W303‑1A(Baisheng Zang et al.Analysis of trehalose‑6‑phosphate synthase(TPS)gene family suggests the formation of TPS complexes in rice.Plant Molecular Biology.2011，76(6)：507‑522.(MATa ade2‑1 his3‑11，15 leu2‑3，112 trp1‑1 ura3‑1can1‑100 GAL mal SUC2)，中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)的TPS基因部分序列，使野生型酵母失去TPS功能，从而得到酵母TPS基因突变株。具体方法为：(1)酵母野生型菌株在YPD平板上划线，30℃培养至长出单菌落，挑取1个单菌落到YPD液体培养基中，30℃、250rpm摇至OD值为0.8。(2)取2ml的菌液于5000rpm离心2min，去除上清，加入800μl灭菌ddH2O、100μl10×TE Buffer、100μl 10×LiAc，吹打混匀后5000rpm离心2min，去除上清液。(3)把鲑鱼精子DNA放在沸水浴中变性10min后立即放入冰水浴中冷却，待用。(4)加入70μl50％PEG6000、10μl10×TE Buffer、10μl10×LiAc、1μg PCR产物、1μlβ‑巯基乙醇、1μl加热变性的鲑鱼精子DNA，吹打混匀后37℃摇床250rpm孵育1h。(5)5000rpm离心2min后去除上清液，用100μl的灭菌水重悬菌体，涂布于含2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基，于30℃培养2‑3d。
酵母TPS基因突变株能够利用半乳糖，而不能利用葡萄糖，因此用含有2％半乳糖的Ttp缺陷型SD固体培养基筛选重组菌株，能够在平板上生长的即为酵母TPS基因突变株。酵母TPS基因突变株能够在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上生长(图4中A)，但是不能在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上生长(图4中B)。图4中A为酵母TPS基因突变株在含有2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片，图4中B为酵母TPS基因突变株在含有2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片。
YPD固体培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，腺嘌呤脲硫酸盐2g，葡萄糖20g。液体培养基则不加琼脂即可。
含2％半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，半乳糖20g，琼脂20g，‑Trp单缺氨基酸混合物(‑Trp DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630413)0.74g，用KOH调节PH至5.8‑6.0。
含2％葡萄糖的Trp缺陷型SD固体培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，葡萄糖20g，琼脂20g，‑Trp单缺氨基酸混合物(‑Trp DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630413)0.74g，用KOH调节PH至5.8‑6.0。
<2>分别含巴西橡胶树HbTPS2基因编码区序列和全长序列酵母互补重组载体的获得
利用pDR196载体(蔡昭艳，欧阳杰，刘滔.水稻寡肽转运基因OsPTR1‑10酵母异源表达载体的构建及转化.2009(32)：15730‑15733.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)构建HbTPS2基因的酵母互补载体。
分别设计HbTPS2基因编码区序列和全长序列引物(pDR‑HbTPS2‑CDS‑F(正义链引物)：5’‑CACCCGGGATGCCTGGAA ACCAGTACA ACG‑3’；pDR‑HbTPS2‑CDS‑R(反义链引物)：5’‑CCGTCGACTCAAGAAGATGCATTGGC TAGTTT‑3’；pDR‑HbTPS2‑全长‑F：5’‑CGCCCGGGGTGAGCGTATGCCTGGAAA C‑3’；pDR‑HbTPS2‑全长‑R：5’‑CCGTCGACGTACAATTTGTTGATATACTCTAGG GC‑3’，下划线为添加的酶切位点：上游引物添加SmaI，下游引物添加SalI，下划线之前的是保护碱基)，以pMD18‑HbTPS2质粒为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸4min，共30次循环；72℃延伸10min。利用限制性内切酶SmaI和SalI分别对载体pCXSN和HbTPS2基因编码区和全长序列扩增片段进行过夜双酶切。将该线性载体分别与HbTPS2基因编码区和全长序列酶切片段连接，得到重组载体，利用载体引物M13‑47(正义链引物)5’‑CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC‑3’和M13‑48(反义链引物)5’‑AGCGGATAACAATTTCACACAGGA‑3’)进行PCR鉴定。重组载体送公司测序鉴定，将鉴定表明正确的分别含有序列表中序列2的第366‑3188和第1‑3503位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pDR‑HbTPS2‑CDS和pDR‑HbTPS2‑全长。
<2>本发明的6‑磷酸海藻糖合成酶的酵母功能互补验证
将质粒pDR196、pDR‑HbTPS2‑CDS和pDR‑HbTPS2‑全长分别导入酵母TPS基因突变株中(导入方法为文献“Dz‑Chi Chen et al.One‑step transformation of yeast in stationary phase.Current Genetics.1992，21(1)：83‑84”所述)，得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌株和野生型菌株在含有2％半乳糖的Ura缺陷型SD液体培养基中30℃、250rpm摇动生长2‑3d。取菌液点斑于含有2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基上，30℃培养2‑3d。
含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基：(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，半乳糖20g，琼脂20g，‑Ura单缺氨基酸混合物(‑Ura DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630416)0.77g，用KOH调节PH至5.8‑6.0。
含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基：(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g，葡萄糖20g，琼脂20g，‑Ura单缺氨基酸混合物(‑Ura DO Supplement，购自clontech公司，货号No.630416)0.77g，用KOH调节PH至5.8‑6.0。液体培养基不加琼脂即可。
结果显示将HbTPS2基因全长序列转入酵母TPS基因突变株中可以使突变株在含有2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基上恢复生长(图5)。图5中A为含2％半乳糖的Ura缺陷型SD固体培养基；B为含2％葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基；W303‑1A表示酵母W303‑1A，tpsΔ+pDR196表示转pDR196的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR‑HbTPS2‑CDS表示转pDR‑HbTPS2‑CDS的酵母TPS基因突变株，tpsΔ+pDR‑HbTPS2‑全长表示转pDR‑HbTPS2‑全长的酵母TPS基因突变株。
实施例4.HbTPS2基因转拟南芥功能验证
利用pCXSN载体(Songbiao Chen et al.A Versatile Zero Background T‑Vector System for Gene Cloning and Functional Genomics.Plant Physiology.2009(150)，1111‑1121.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)构建HbTPS2基因的转拟南芥载体，具体方法如下：
<1>含巴西橡胶树HbTPS2基因编码区重组载体的获得
设计HbTPS2基因编码区引物(pCXSN‑HbTPS2‑F(正义链引物)：5’‑ATGCCTGGAAACCAGTACAACG‑3’；pCXSN‑HbTPS2‑R(反义链引物)5’‑TCAAGAAGATGCATTGGCTAGTTT‑3’)，以pMD18‑HbTPS2为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸3min，共30次循环；72℃延伸10min，扩增片段两端各突出一个核苷酸A。利用限制性内切酶XcmI对载体pCXSN进行过夜酶切，得到两端各突出一个核苷酸T的pCXSN线性载体。将该线性载体与HbTPS2编码区扩增片段连接，得到重组载体，利用载体引物pCXSN‑F(正义链引物)5’‑GCAATCAAGCATTCTACTTC‑3’和特异性引物pCXSN‑HbTPS2‑R(反义链引物)5’‑TCAAGAAGATGCATTGGCTAGTTT‑3’)进行PCR鉴定，确保海藻糖合成酶编码片段正向克隆到表达载体。重组载体送公司测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中序列2的第366‑3188位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为pCXSN‑HbTPS2。
<2>本发明的6‑磷酸海藻糖合成酶功能验证
将获得的重组载体pCXSN‑HbTPS2导入(导入方法见文献“张云峰，邵磊。根癌农杆菌电击转化条件的研究。淮阴师范学院学报：自然科学版。2009，8(3)：243‑245，249”)农杆菌EHA105(Feldmann，K.A.and Marks，M.D.Agrobacte rium mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana：a non‑tissue culture approach.Mol.Gen.Genet.1987，208，1‑9.Biovector Co.，LTD 订购)中，得到重组表达菌株，将鉴定正确的重组菌株在含利福平(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的YEP液体培养基中培养至OD600为0.8‑1.5，收集菌体，用侵染液(MS培养基：1.32g；蔗糖：30g；6‑BA(1mg/ml)：60μl；2‑(N‑吗啉代)乙烷磺酸一水(MES，超级纯)：0.3g；Silwet L‑77(84％的聚醚改性七甲基三硅氧烷和16％的烯丙氧基聚乙二醇甲基醚的混合物，“％”为质量百分比)：120μl。KOH调节PH到5.7)重悬至OD600为0.8‑1.0，利用喷雾器将农杆菌重悬液喷洒至野生型拟南芥Col‑0(购自Arabidopsis Biological Resource Center)的花絮上，直到有液滴滴下。置入培养箱中黑暗培养24h，之后正常培养16h/8h(光照/黑暗)。在拟南芥产生新的花序后再次喷洒一次农杆菌重悬液，继续培养至植物成熟，收集种子(T1代)。
将T1代种子播种到含有50μg/mL的潮霉素B的固体MS培养基平板上，放置4℃冰箱春化3‑4天后转移至20℃光照培养箱16h/8h(光照/黑暗)。两周后选择长势正常的拟南芥移植至营养土(蛭石∶营养土＝1∶1)中继续培养，成熟后收集种子(T2代)干燥。挑选能够在含有50μg/mL潮霉素B的固体MS培养基上生长的T2代拟南芥微量提取基因组DNA，分别利用潮霉素基因特异性引物(Hyg‑F：5’‑CGTCTGTCGAGAAGTTTC‑3’；Hyg‑R：5’‑TACTTCTACACAGCC ATC‑3’)和6‑磷酸海藻糖合成酶基因编码区引物(见实施例4<1>)进行PCR检测，分别扩增得到一条1000bp和2800bp左右的特异条带，为潮霉素基因和本发明的促进植物生长和开花的相关基因，即得到转pCXSN‑HbTPS2拟南芥阳性株系。
将野生型拟南芥Col‑0(购自Arabidopsis Biological Resource Center)和阳性转pCXSN‑HbTPS2拟南芥种子播种于MS培养基中，在培养了10天后将拟南芥幼苗移栽到营养土中，每隔一段时间拍照对比植株的生长状态(图6)。
结果如图6所示，转pCXSN‑HbTPS2拟南芥种子和野生型拟南芥的种子分别在MS培养基中培养10天后，观察发现转HbTPS2基因拟南芥幼苗根的生长速度显著的快于野生型拟南芥(图6中A)；在移栽到营养土中培养10天后，发现转HbTPS2基因拟南芥叶片的长势明显的比野生型拟南芥旺盛(图6中B)；在营养土中培养1个月后，发现当野生型拟南芥还未达到抽苔开花期时，转HbTPS2基因拟南芥已经抽出近15cm的茎干，而且到了开花期(图6中C)。图6中A为转pCXSN‑HbTPS2拟南芥种子和野生型拟南芥的种子分别在MS培养基中培养10天后的照片；图6中B为移栽到营养土中培养10天后的照片；图6中C为在营养土中培养1个月后的照片。
按照上述同样的方法将pCXSN载体转入野生型拟南芥Col‑0获得转pCXSN载体拟南芥，培养结果表明，其与野生型拟南芥的长势和开花时间没有明显差别。
4.结论
我们首次克隆了巴西橡胶树6‑磷酸海藻糖合成酶HbTPS2基因的全长cDNA，基因表达分析显示巴西橡胶树幼苗在遇到非生物胁迫时，HbTPS2基因在植株一些组织中的表达量有明显的上升。酵母互补实验显示将HbTPS2基因全长序列导入酵母TPS基因突变株中能够互补突变株的TPS功能。而把该基因转入野生型拟南芥中后，发现转HbTPS2基因植株的生长速度明显快于野生型拟南芥，并提早开花时间。
因此该基因也可作为巴西橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快巴西橡胶树的生长速度和提早开花。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在巴西橡胶树以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用，加快它们的生长速度。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 103103168 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103103168 A *CN103103168A* (21)申请号 201310046842.6 (22)申请日 2013.02.06 C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人中国热带农业科学院橡胶研究所地址 57。

2、1737 海南省儋州市宝岛新村 (72)发明人唐朝荣戚继燕周斌辉 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅王慧凤 (54) 发明名称一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用 (57) 摘要本发明公开了一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质： 1) 序列表中的 SEQ ID .1 的氨基酸残基序列； 2) 将序列表中的SEQ ID .1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有促进植物生长和提早开花相关功能的由 SEQ ID ： 1衍。

3、生的蛋白质。该基因也可作为巴西橡胶树高产转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快西橡胶树的生长速度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 9 页序列表 7 页附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表7页附图4页 (10)申请公布号 CN 103103168 A CN 103103168 A *CN103103168A* 1/1 页 2 1. 一种蛋白质，是如下 1) 或 2) 所示的蛋白质： 1) 由序列表中的 SEQ ID .1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质； 2) 将序。

4、列表中的 SEQ ID .1 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有促进植物生长和开花的相关功能的由 SEQ ID ： 1 衍生的蛋白质。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为具有促进植物生长和开花的功能。 3. 权利要求 1 或 2 所述的蛋白的编码基因。 4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)、 2)、 3) 或 4) 所示： 1) 序列表中 SEQ ID ： 2 的核苷酸序列； 2) 序列表中 SEQ ID ： 2 自 5末端第 366-3188 位核苷酸所示的核。

5、苷酸序列； 3) 在严格条件下可与 1) 或 2) 所述的 DNA 序列杂交的核苷酸序列。 4) 与序列表中 SEQ ID ： 2 的核苷酸序列具有 90以上的相似性的且编码蛋白具有与促进植物生长和开花的相关功能的核苷酸序列。 5. 含有权利要求 3 或 4 所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。 6.权利要求1所述的蛋白或其编码基因在培育生长速度加快和/或花期提前的转基因植物中的应用。 7. 一种培育生长速度加快和 / 或开花期提前的植物的方法，是将权利要求 3 或 4 所述的编码基因导入目的植物中，培育得到生长速度加快和 / 或开花期提前的转基因植物。。

6、 8. 根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求 5 所述的重组表达载体导入所述目的植物中的。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述的方法，其特征在于：所述目的植物为橡胶树或拟南芥。权利要求书 CN 103103168 A 2 1/9 页 3 一种促进植物生长和开花的蛋白及其编码基因的应用技术领域 0001 本发明涉及一种来源于巴西橡胶树的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。背景技术 0002 植物体内的 TPS/TPP 途径是海藻糖合成的途径，其过程先是由 6- 磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosph。

7、ate synthase， TPS) 催化尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPG) 和 6- 磷酸葡萄糖 (G-6-P) 合成中间产物 6- 磷酸海藻糖 (T-6-P)，接着在 6- 磷酸海藻糖磷酸酯酶 (Trehalose-6-phosphate phosphatase， TPP) 的催化作用下生成终产物海藻糖。而中间产物6-磷酸海藻糖(T-6-P)在植物体内具有非常重要的地位，起着信号传导和调节植物生长与发育的作用。 0003 Vuorio O.E 等 (1993) 的研究结果表明，中间产物 6- 磷酸海藻糖 (T-6-P) 在植物的生长和发育过程中起着决定性的作用，是公认的糖类新陈。

8、代谢调节器 (Vuorio O.E， Kalkkinen N， Londesborough J.Cloning of two related genes encoding the 56-kDa and 123-kDa subunits of trehalose synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae.European Journal of Biochemistry， 216(3) ： 849-861)。 Dijken A等(2004) 的研究证明 T-6-P 在拟南芥植株的碳水化合物利用和它的生长发育过程中是必不可少的，是通过AtTP。

9、S1基因调节T-6-P的生物合成来控制植株的代谢状态(Dijken A， Schluepmann H， Smeekens S.Arabidopsis Trehalose-6-Phosphate Synthase 1 is essential for normal vegetative growth and transition to flowering.Plant Physiology， 135 ： 969-977)。Zhang Y 等 (2009) 的研究表明 6- 磷酸海藻糖 (T-6-P) 充当 SnRK1 基因的抑制剂，是非生物胁迫压力和物质代谢信号的中央处理器，在植物生长组织中。

10、具有加快生物合成反应速度的功能 (Zhang Y， Primavesi L F， Jhurreea D， et， al.Inhibition of SNF1-related protein kinasel activity and regulation of metabolic pathways by trehalose-6-phosphate.Plant Physiology， 149(4)， 1860-1871)。 0004 以上研究显示，由 TPS 基因催化合成的 6- 磷酸海藻糖 (T-6-P) 在植物的生长和发育过程中起着重要作用，可以促进植物的生长速度。巴西橡胶树通常在定植。

11、后 6-8 年才可割胶，非生产期长。因此，研究巴西橡胶树 6- 磷酸海藻糖合成酶基因控制 6- 磷酸海藻糖生物合成的机制有助于了解橡胶树的生长调控。目前，在橡胶树中还未见有关 6- 磷酸海藻糖合成酶基因的研究报道。发明内容 0005 本发明的目的是提供一种促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因与应用。 0006 本发明所提供的促进植物生长和开花的相关蛋白，来源于大戟科橡胶属的巴西橡胶树 (Hevea brasiliensis)，名称为 HbTPS2，是如下 1) 或 2) 的蛋白质： 0007 1) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；说明书 C。

12、N 103103168 A 3 2/9 页 4 0008 2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 / 或添加且与序列 1 所示蛋白具有相同活性的由 1) 衍生的蛋白质。 0009 序列表中序列 1 由 940 个氨基酸残基组成。 0010 为了便于序列 1 编码的 HbTPS2 纯化，可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0011 表 1 标签的序列 0012 标签残基序列 Poly-Arg5-6( 通常为 5 个 )RRRRR Poly-His2-10( 通常为 6 个 )HHHHH。

13、H FLAG8DYKDDDDK Strep-tag II8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL 0013 上述 HbTPS2 可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述 HbTPS2 的编码基因可通过将序列表中序列 2 自 5末端第 366-3188 位碱基所示的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变，和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0014 所述促进植物生长和开花的相关蛋白 (HbTPS2) 的编码基因也属于本发明的保护范围。 0015 所述促进植物生长。

14、和开花的相关蛋白 (HbTPS2) 的编码基因为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的 DNA 分子： 0016 1) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子； 0017 2) 序列表中序列 2 自 5末端第 366-3188 位核苷酸所示的 DNA 分子； 0018 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述促进植物生长和开花的相关蛋白的 DNA 分子； 0019 4) 与序列表中序列 2 的核苷酸序列具有 90以上的同源性的且编码蛋白具有促进植物生长和开花的相关功能的核苷酸序列。 0020 序列表中序列 2 全长为 3503 个核苷酸，包含一个长度为 2。

15、823 个核苷酸的开放阅读框 (ORF，自序列 2 的 5端第 366-3188 位核苷酸序列 )、 365nt 的 5 -UTR( 自序列 2 的 5端第 1-365 位核苷酸序列 ) 和 315nt 的 3 -UTR( 自序列 2 的 5端第 3189-3503 位核苷酸序列)，编码一个长度为940个氨基酸(序列表中序列1)、分子量为106.01KDa的蛋白。 0021 所述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中，在 65下杂交并洗膜。 0022 含有所述促进植物生长和开花的相关蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或。

16、重组菌均属于本发明的保护范围。说明书 CN 103103168 A 4 3/9 页 5 0023 上述促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因在培育生长速度加快和 / 或开花期提前的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述生长速度加快为根和叶的生长速度加快；开花期提前为抽苔和 / 或开花的时间提前。 0024 本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白 HbTPS2，在遇到非生物胁迫时， HbTPS2 的编码基因在巴西橡胶树幼苗一些组织中的表达量有明显的上升。把该基因的全长 cDNA 序列导入酵母 TPS 基因突变株中，发现能够互补酵母突变株的 TPS 功能。再把该基因转到。

17、野生型拟南芥中，得到转基因阳性植株。当种子在 MS 培养基上培养 10 天后，观察到转基因拟南芥幼苗根的生长速度比野生型拟南芥快；在移栽到营养土中培养 10 天后，发现转基因拟南芥的叶片长势明显的比野生型拟南芥旺盛；在营养土中培养一个月后，发现野生型拟南芥还未到抽苔开花期，而转基因拟南芥已经抽出近 15cm 的茎干，并且到了开花期。因此该基因也可作为巴西橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来加快巴西橡胶树的生长速度和提早开花，并且在受到胁迫后能够作为信号受体起着信号传递的作用。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在巴西橡胶树。

18、以外的其他植物或微生物的基因工程中得到应用，加快它们的生长速度。附图说明 0025 图 1 为 HbTPS2 基因在低温胁迫下的表达分析。 0026 图 2 为 HbTPS2 基因在高温胁迫下的表达分析。 0027 图 3 为 HbTPS2 基因在干旱胁迫下的表达分析。 0028 图 4 为酵母 TPS 基因突变株的培养性状实验。图 4 中 A 为酵母 TPS 基因突变株在含有 2半乳糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基上培养的照片，图 4 中 B 为酵母 TPS 基因突变株在含有 2葡萄糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基上培养的照片。 0029 图 5 为酵母互补实验结果。。

19、图 5 中 A 为含 2半乳糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养基； B 为含 2葡萄糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养基； W303-1A 表示野生型酵母 W303-1A， tps+pDR196 表示转 pDR196 的酵母 TPS 基因突变株， tps+pDR-HbTPS2-CDS 表示转 pDR-HbTPS2-CDS 的酵母 TPS 基因突变株， tps+pDR-HbTPS2- 全长表示转 pDR-HbTPS2- 全长的酵母 TPS 基因突变株。 0030 图 6 为野生型和转 HbTPS2(pCXSN-HbTPS2) 基因拟南芥在培养不同时间的生长情况比较。具体实施方式。

20、0031 下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。 0032 实施例 1. 本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白及其编码基因的获得 0033 搜索本申请人构建的巴西橡胶树胶乳 EST 序列数据库，确定一条 492bp 左右的巴西橡胶树 6- 磷酸海藻糖合成酶基因 EST 组装后序列 (contig)，设计一对特异性引物扩增得到该 cDNA 片段，并利用 cDNA 末端的快速扩增技术 (RACE)，最终获得包含完整读码框的 cDNA 全长序列。 0034 具体方法如下： 0035 cDNA 片段克隆说明书 CN 103103168 A 5 4/9 页 6 00。

21、36 特异性引物设计如下： 0037 SP1(5 端 ) ： 5 -GCCTTTTTCTTGGGTCCATTAT-3 ； 0038 SP2(3 端 ) ： 5 -GCCTCCAGCACTTATCTCCAAA-3 。 0039 以巴西橡胶树热研 7-33-97( 中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售 ) 胶乳 cDNA 为模板 ( 以随机引物反转录获得 )， SP1 和 SP2 为引物，其终浓度为 0.4mol/L，在 20l 反应体系中进行 PCR 扩增。扩增程序为： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 60退火 30s， 72延伸。

22、 30s， 30 次循环； 72延伸 10min。获得一段 490bp 左右的核苷酸片段，为 6- 磷酸海藻糖合成酶基因 cDNA 片段。 0040 5 端 RACE 0041 根据 6- 磷酸海藻糖合成酶基因 cDNA 片段的测序结果设计 5 RACE 和 3 RACE 引物，通用引物 QT(5 -CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCT CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 )， Q0(5 -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3 ) 和 Q1(5 -GAGGACTCGAGCTCAAGC-3 ) 的序列及 RACE 操作流程参照文献 ( 迪芬巴。

23、赫 C W，德维克斯勒 G S.PCR 技术实验指南 . 黄培堂译 . 北京：科学出版社， 1998 ： 268 277)。进行 5 RACE 时，以随机引物进行巴西橡胶树热研 7-33-97( 中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售 ) 胶乳 RNA 的 cDNA 第一链合成，反应产物经乙醇沉淀去除多余 dNTP 和引物后，利用末端转移酶 TdT 催化加 polyA 尾巴。第一轮扩增以加尾的 cDNA 为模板，使用引物 QT、 Q0 和第一轮基因特异引物 (5 -TCCAGGCATACGCTCACTCTA-3 )，引物终浓度分别。

24、为 0.04mol/L、 0.4mol/ L 和 0.4mol/L，在 20l 反应体系中进行 PCR 扩增。扩增程序为：首先， 94变性 5min， 50退火2min， 72延伸40min ；然后， 94变性1min， 55退火1min， 72延伸1min，共30 次循环；最后， 72延伸 10min。PCR 产物稀释 100 倍后，取 1l 稀释产物作为模板，使用终浓度均为 0.4mol/L 的 Q1 和第二轮基因特异引物 (5 -CATAATGGACCCAAGAAAAAGG-3 ) 进行第二轮嵌套扩增， PCR 扩增程序为： 94预变性 5min ； 94变性 3。

25、0s， 58退火 30s， 72 延伸 1min，共 30 次循环； 72延伸 10min。获得一段 600bp 左右的核苷酸片段。 0042 3 端 RACE 0043 进行 3 RACE 时，以 50ng 的 QT 为引物进行巴西橡胶树热研 7-33-97 叶片 RNA 的 cDNA 第一链合成。以 cDNA 产物为模板，使用终浓度都为 0.4mol/L 的 Q0 和第一轮引物 (5 -GATGTGAAAATCAGGATGGCA-3 ) 进行第一轮 PCR 扩增，扩增程序与 5 RACE 的第一轮 PCR 扩增程序相同。第一轮 PCR 产物稀释 100 倍后，取 1l 稀释产物。

26、作为模板，使用终浓度均为 0.4mol/L 的 Q1 和第二轮基因特异引物 (5 -TTGGAGATAAGTGCTGGAGGC-3 ) 进行第二轮嵌套扩增，扩增程序为 94预变性 5min ； 94变性 30s， 58退火 30s， 72延伸 3min，共 30 次循环； 72延伸 10min。获得一段 2400bp 左右的核苷酸片段。 0044 HbTPS2 cDNA 全长克隆 0045 根据所得到的巴西橡胶树 HbTPS2 基因的 cDNA 片段， 5 端和 3 端扩增序列，利用 DNAMAN软件进行序列拼接，得到HbTPS2基因全长cDNA的拼接序列。根据拼接序列，分。

27、别在 5 末端和 3 末端设计一条引物 (2-1F( 正义链引物 ) ： 5 -AGACTTCTTCTGGGCATTTGTTT-3 ， 2-3503R( 反义链引物 ) ： 5 -AAAAGAAAAATAAATATTTATAAGGTACAA-3 )。以巴西橡胶树热研 7-33-97 胶乳 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，引物终浓度均为 0.4mol/L，扩增程序为： 94 预变性5min ； 94变性1min， 58退火1min， 72延伸4min，共30次循环； 72延伸10min。说明书 CN 103103168 A 6 5/9 页 7 将该 PCR 获得的片段连接。

28、到 pMD18-T 载体 (TaKaRa) 进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明的 6- 磷酸海藻糖合成酶基因，该片段具有序列表中序列 2 的核苷酸序列，序列表中序列 2 全长为 3503 个核苷酸，包含一个长度为 2823 个核苷酸的开放阅读框 (ORF，自序列 2 的 5 端第 366-3188 位核苷酸序列 )、 365nt 的 5 -UTR( 自序列 2 的 5 端第 1-365 位核苷酸序列 ) 和 315nt 的 3 -UTR( 自序列 2 的 5 端第 3189-3503 位核苷酸序列 )，编码一个长度为 940 个氨基酸 ( 序列表中序列 1)、分。

29、子量为 106.01KDa 的蛋白，即为 6- 磷酸海藻糖合成酶 ( 本发明的促进植物生长和开花的相关蛋白 )，将该 6- 磷酸海藻糖合成酶命名为 HbTPS2，其编码基因命名为 HbTPS2。将上述含有序列 2 的核苷酸的 pMD18-T 重组载体命名为 pMD18-HbTPS2。 0046 实施例 2. 巴西橡胶树幼苗 HbTPS2 基因在非生物胁迫下的表达模式分析 0047 本研究选取生长四个月的巴西橡胶树热研 7-33-97 组培苗先在营养液中预适应 1 个月，挑选生长状况相似的幼苗进行三种非生物胁迫处理。 0048 低温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中 4培养，分。

30、别在 0h、 3h、 6h、 12h、 24h5 个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取 RNA 备用。 0049 高温胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在营养液中 40培养，分别在 0h、 3h、 6h、 12h、 24h5 个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取 RNA 备用。 0050 干旱胁迫：把巴西橡胶树幼苗放在含有20PEG6000的营养液中培养，分别在0h、 3h、 6h、 12h、 1d、 2d、 4d、 7d8 个时间点取叶片、树皮、木质部和根四种组织提取 RNA 备用。 0051 对上述提取的 RNA 用 DNaseI 消化其中的基因组 DNA 后。

31、进行反转录，采用荧光定量技术，分析该基因在不同胁迫中的表达模式。HbTPS2 基因荧光定量引物 (rTPS2-F ： 5 -TTATGCCTACCTTAACAGGAACC-3 ( 正义链引物，对应序列表中序列 2 的第 3352-3374 位核苷酸 )， rTPS2-R ： 5 -TACAATTTGTTGATATAC TCTAGGGC-3 ( 反义链引物，对应序列表中序列 2 的第 3453-3478 位核苷酸 )。 0052 结果显示：在低温胁迫处理后， HbTPS2 基因在木质部和根中的表达量呈现递增的趋势，都在处理 3h 后其表达量达到最大值，约为对照 (0h 时的。

32、表达量 ) 的 3 倍；处理 12h 后在树叶中的表达量达到最大值，为对照 (0h 时的表达量 ) 的 1.5 倍，其后表达量又降低至对照 (0h 时的表达量 ) 的 0.5 倍；而在树皮中有略微下降的趋势 ( 图 1)。 0053 在高温胁迫处理后， HbTPS2 基因的表达量在根中呈现大幅度上升的趋势，在处理 24h 后达到最大值，为对照 (0h 时的表达量 ) 的 22 倍；在树皮中有略微上升，在处理 3h 时达到最大值，约为对照 (0h 时的表达量 ) 的 2 倍；而在树叶和木质部中变化不明显 ( 图 2)。 0054 在干旱胁迫处理后， HbTPS2。

33、基因的表达量在树叶中呈现下降的趋势，在处理 2 天后达到最小值，为对照 (0h 时的表达量 ) 的 1/5 ；在树皮中的表达量是先略微下降再恢复至原始水平，总体变化趋势不明显；处理 2 天后在木质部中的表达量达到最大值，接近对照 (0h 时的表达量 ) 的 2 倍；而在根中的表达量是先下降再上升，在处理 12h 后达到最小值，约为对照的1/3，在处理4天后达到最大值，约为对照的1.5倍，在处理7天后恢复到原始水平 ( 图 3)。 0055 结果表明巴西橡胶树幼苗在遇到胁迫作用时会调节 HbTPS2 基因表达量的上升，从而合成更多的 6- 磷酸海藻糖来传递胁。

34、迫处理产生的信号。 0056 实施例 3.HbTPS2 基因酵母功能互补验证说明书 CN 103103168 A 7 6/9 页 8 0057 酵母 TPS 基因突变株的制备 0058 设计两端分别带有 TPS 同源臂的 Trp 标签基因引物 (Trp-TPS-F ： 5 -CGTACACTTTC AAGTGGTTCGGATGGCCTGGGCTAGAGCACACAAAGG CAGCTTGGAG-3 ； Trp-TPS-R ： 5 -ACACTTCCATGGC GTGCAACTTCTGAGGC ACACCTTTAGTAATAACCTATTTCTTAGC-3 )，以pGBKT7质粒(Bai。

35、sheng Zang et al.Analysis of trehalose-6-phosphate synthase(TPS)gene family suggests the formation of TPS complexes in rice.Plant Molecular Biology.2011， 76(6) ： 507-522. 中国热带农业科学院橡胶研究所已保存 ) 为模板进行 PCR 扩增，得到 706bp 的片段。 0059 把带同源臂的 Trp 标签基因回收片段通过同源重组技术取代酵母 W303-1A(Baisheng Zan。

36、g et al.Analysis of trehalose-6-phosphate synthase(TPS) gene family suggests the formation of TPS complexes in rice.Plant Molecular Biology.2011， 76(6) ： 507-522.(MATa ade2-1 his3-11， 15 leu2-3， 112 trp1-1 ura3-1can1-100 GAL mal SUC2)，中国热带农业科学院橡胶研究所已保存 ) 的 TPS 基因部分序列，使野生型酵母失去 TPS 功能，从而得到酵母 TPS 基。

37、因突变株。具体方法为： (1) 酵母野生型菌株在 YPD 平板上划线， 30培养至长出单菌落，挑取 1 个单菌落到 YPD 液体培养基中， 30、 250rpm 摇至 OD 值为 0.8。(2) 取 2ml 的菌液于 5000rpm 离心 2min，去除上清，加入 800l 灭菌 ddH2O、 100l10TE Buffer、 100l 10LiAc，吹打混匀后 5000rpm 离心 2min，去除上清液。(3) 把鲑鱼精子 DNA 放在沸水浴中变性 10min 后立即放入冰水浴中冷却，待用。(4) 加入 70l50 PEG6000、 10l10TE Buffer、 10。

38、l10LiAc、 1g PCR 产物、 1l- 巯基乙醇、 1l 加热变性的鲑鱼精子 DNA，吹打混匀后 37摇床 250rpm 孵育 1h。(5)5000rpm 离心 2min 后去除上清液，用 100l 的灭菌水重悬菌体，涂布于含 2半乳糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基，于 30培养 2-3d。 0060 酵母 TPS 基因突变株能够利用半乳糖，而不能利用葡萄糖，因此用含有 2半乳糖的 Ttp 缺陷型 SD 固体培养基筛选重组菌株，能够在平板上生长的即为酵母 TPS 基因突变株。酵母 TPS 基因突变株能够在含有 2半乳糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基上生长。

39、 ( 图 4 中 A)，但是不能在含有 2葡萄糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基上生长 ( 图 4 中 B)。图 4 中 A为酵母TPS基因突变株在含有2半乳糖的Trp缺陷型SD固体培养基上培养的照片，图4 中 B 为酵母 TPS 基因突变株在含有 2葡萄糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基上培养的照片。 0061 YPD固体培养基(1L) ：蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，腺嘌呤脲硫酸盐2g，葡萄糖 20g。液体培养基则不加琼脂即可。 0062 含 2半乳糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基 (1L) ：无氨基酸酵母氮源 6.7g，半乳糖 20g，琼脂。

40、20g， -Trp 单缺氨基酸混合物 (-Trp DO Supplement，购自 clontech 公司，货号 No.630413)0.74g，用 KOH 调节 PH 至 5.8-6.0。 0063 含 2葡萄糖的 Trp 缺陷型 SD 固体培养基 (1L) ：无氨基酸酵母氮源 6.7g，葡萄糖 20g，琼脂 20g， -Trp 单缺氨基酸混合物 (-Trp DO Supplement，购自 clontech 公司，货号 No.630413)0.74g，用 KOH 调节 PH 至 5.8-6.0。 0064 分别含巴西橡胶树 HbTPS2 基因编码区序列和全长序列酵母互补重。

41、组载体的获得 0065 利用 pDR196 载体 ( 蔡昭艳，欧阳杰，刘滔 . 水稻寡肽转运基因 OsPTR1-10 酵母异源表达载体的构建及转化 .2009(32) ： 15730-15733. 中国热带农业科学院橡胶研究所已保说明书 CN 103103168 A 8 7/9 页 9 存 ) 构建 HbTPS2 基因的酵母互补载体。 0066 分别设计 HbTPS2 基因编码区序列和全长序列引物 (pDR-HbTPS2-CDS-F( 正义链引物 ) ： 5 -CACCCGGGATGCCTGGAA ACCAGTACA ACG-3 ； pDR-HbTPS2-CDS-R( 反义。

42、链引物 ) ： 5 -CCGTCGACTCAAGAAGATGCATTGGC TAGTTT-3 ； pDR-HbTPS2- 全长 -F ： 5 -CGCCCGGGGTGAGCGTATGCCTGGAAA C-3 ； pDR-HbTPS2-全长-R ： 5 -CCGTCGACGTACAATTTGTT GATATACTCTAGG GC-3 ，下划线为添加的酶切位点：上游引物添加SmaI，下游引物添加SalI，下划线之前的是保护碱基 )，以 pMD18-HbTPS2 质粒为模板，进行 PCR 扩增，扩增程序为： 95预变性 5min ； 94变性 1min， 58退火 30sec。

43、， 72延伸 4min，共 30 次循环； 72延伸 10min。利用限制性内切酶SmaI和SalI分别对载体pCXSN和HbTPS2基因编码区和全长序列扩增片段进行过夜双酶切。将该线性载体分别与HbTPS2基因编码区和全长序列酶切片段连接，得到重组载体，利用载体引物 M13-47( 正义链引物 )5 -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 和 M13-48( 反义链引物 )5 -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ) 进行 PCR 鉴定。重组载体送公司测序鉴定，将鉴定表明正确的分别含有序列表中序列 2 的第 366-3188 和第 1-3。

44、503 位核苷酸序列、读框准确的重组表达载体命名为 pDR-HbTPS2-CDS 和 pDR-HbTPS2- 全长。 0067 本发明的 6- 磷酸海藻糖合成酶的酵母功能互补验证 0068 将质粒 pDR196、 pDR-HbTPS2-CDS 和 pDR-HbTPS2- 全长分别导入酵母 TPS 基因突变株中 ( 导入方法为文献 “Dz-Chi Chen et al.One-step transformation of yeast in stationary phase.Current Genetics.1992， 21(1) ： 83-84” 所述 )，得到重组表达菌，将鉴定正确。

45、的重组菌株和野生型菌株在含有 2半乳糖的 Ura 缺陷型 SD 液体培养基中 30、 250rpm 摇动生长 2-3d。取菌液点斑于含有 2葡萄糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养基上， 30 培养 2-3d。 0069 含 2半乳糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养基： (1L) ：无氨基酸酵母氮源 6.7g，半乳糖 20g，琼脂 20g， -Ura 单缺氨基酸混合物 (-Ura DO Supplement，购自 clontech 公司，货号 No.630416)0.77g，用 KOH 调节 PH 至 5.8-6.0。 0070 含 2葡萄糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养。

46、基： (1L) ：无氨基酸酵母氮源 6.7g，葡萄糖 20g，琼脂 20g， -Ura 单缺氨基酸混合物 (-Ura DO Supplement，购自 clontech 公司，货号 No.630416)0.77g，用 KOH 调节 PH 至 5.8-6.0。液体培养基不加琼脂即可。 0071 结果显示将 HbTPS2 基因全长序列转入酵母 TPS 基因突变株中可以使突变株在含有 2葡萄糖的 Ura 缺陷型 SD 固体培养基上恢复生长 ( 图 5)。图 5 中 A 为含 2半乳糖的 Ura缺陷型SD固体培养基； B为含2葡萄糖的Ura缺陷型SD固体培养基； W303-1A表。

47、示酵母 W303-1A， tps+pDR196 表示转 pDR196 的酵母 TPS 基因突变株， tps+pDR-HbTPS2-CDS 表示转 pDR-HbTPS2-CDS 的酵母 TPS 基因突变株， tps+pDR-HbTPS2- 全长表示转 pDR-HbTPS2- 全长的酵母 TPS 基因突变株。 0072 实施例 4.HbTPS2 基因转拟南芥功能验证 0073 利用pCXSN载体(Songbiao Chen et al.A Versatile Zero Background T-Vector System for Gene Cloning and Func。

48、tional Genomics.Plant Physiology.2009(150)， 1111-1121.中国热带农业科学院橡胶研究所已保存)构建HbTPS2基因的转拟南芥载体，具体方法如下： 0074 含巴西橡胶树 HbTPS2 基因编码区重组载体的获得说明书 CN 103103168 A 9 8/9 页 10 0075 设计 HbTPS2 基因编码区引物 (pCXSN-HbTPS2-F( 正义链引物 ) ： 5 -ATGCCTGGAAACCAGTACAACG-3 ； pCXSN-HbTPS2-R( 反义链引物 )5 -TCAAGAAGATGCATTGGC TAGTTT-3 )，以 pMD18-HbTPS2 为模板，进行 PCR 扩增，扩增程序为： 95预变性 5min ； 94 变性 1min， 58退火 30sec， 72延伸 3min，共 30 次循环； 72延伸 10min，扩增片段两端各突出一个核苷酸 A。利用限制性内切酶 XcmI 对载体 pCXSN 进行过夜酶切，得到两端各突出一个核苷酸 T 的 pCXSN 线性载体。将该线性载体与 HbTPS2 编码区扩增片段连接，得到重组载体，利用载体引物 pCXSN-F。

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