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1、(10)申请公布号 CN 103113427 A (43)申请公布日 2013.05.22 CN 103113427 A *CN103113427A* (21)申请号 201310047816.5 (22)申请日 2013.02.06 C07H 7/02(2006.01) C07H 1/00(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 宁波美康生物科技股份有限公司 地址 315104 浙江省宁波市鄞州中心区启明 南路 299 号 (72)发明人 邹炳德 邹继华 陆慧贤 周海滨 (74)专利代理机构 宁波市鄞州甬致专利代理事 务所 ( 普通合伙 ) 33228 代理。
2、人 代忠炯 (54) 发明名称 果糖缬氨酸的制备方法 (57) 摘要 本发明公开一种果糖缬氨酸的制备方法， 步骤包括 ： 以 110 份的 L- 缬氨酸、 1050 份的 D- 葡萄糖为原料， 80800 份 0.013mol/LpH36 吡啶乙酸盐溶液或吡啶甲酸盐溶液为溶剂， 温度 1050搅拌反应 15 天 ； 反应完毕后， 过滤， 所得 的溶液减压蒸干得到干物质 ； 将所得的干物质溶 解于甲醇或乙醚中， 在 010低温放置， 析出淡 黄色物质， 过滤， 经冷冻干燥后得白色固体物质， 即为果糖缬氨酸。 本发明具有制备步骤简单、 得率 高， 且得到的底物纯度高的优点。 (51)Int.Cl.。
3、 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103113427 A CN 103113427 A *CN103113427A* 1/1 页 2 1. 一种果糖缬氨酸的制备方法， 其特征在于 ： 包括以下制备步骤 ： （1） 以 110 重量份的 L- 缬氨酸、 1050 重量份的 D- 葡萄糖为原料， 80800 重量份浓 度为 0.013mol/L、 pH36 的吡啶乙酸盐溶液或吡啶甲酸盐溶液为溶剂， 控制反应温度为 1050搅拌反应 15 天 ； （2）反应完毕后， 过滤， 所得的反。
4、应溶液控制真空度为 -0.01-0.09MPa、 温度为 3050进行减压蒸干， 得到干物质 ； （3） 将步骤 （2） 所得的干物质以 1:0.510 的比例溶解于甲醇或乙醚中， 在 010低温 放置， 析出淡黄色物质， 过滤， 经冷冻干燥后得白色固体物质， 即为果糖缬氨酸。 2. 根据权利要求 1 所述的果糖缬氨酸的制备方法， 其特征在于 ： 所述的吡啶乙酸盐为 4- 吡啶乙酸盐、 2- 吡啶乙酸盐或 3- 吡啶乙酸盐。 3. 根据权利要求 2 所述的果糖缬氨酸的制备方法， 其特征在于 ： 所述的吡啶乙酸盐为 4- 吡啶乙酸盐酸盐。 4. 根据权利要求 1 所述的果糖缬氨酸的制备方法， 其。
5、特征在于 ： 所述的吡啶甲酸盐为 4- 吡啶甲酸盐、 2- 吡啶甲酸盐或 3- 吡啶甲酸盐。 5. 根据权利要求 4 所述的果糖缬氨酸的制备方法， 其特征在于 ： 所述的吡啶甲酸盐为 2- 吡啶甲酸盐酸盐。 6. 根据权利要求 1 所述的果糖缬氨酸的制备方法， 其特征在于 ： 所述的干物质以 1:0.510 的比例溶解于甲醇或乙醚中， 其比例为重量 / 体积比。 权 利 要 求 书 CN 103113427 A 2 1/3 页 3 果糖缬氨酸的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及果糖缬氨酸氧化酶底物， 即由葡萄糖和氨基酸反应形成的 Amadori 产 物 - 果糖缬氨酸的制备方法。 背景技。
6、术 0002 血液中的糖化血红蛋白反应了一段时期内生物体内的血糖水平， 近年来被用作糖 尿病诊断和治疗的重要指标。 目前市场上主要采用酶法用于检测人体内糖化血红蛋白的含 量， 利用该法测定糖化血红蛋白需用到一类特殊的酶类果糖缬氨酸氧化酶， 该酶作用 于糖化多肽或糖化氨基酸， 其作用产物经过一系列氧化还原反应， 最后通过终产物的显色 来确定糖化血红蛋白的含量。因此果糖缬氨酸氧化酶为糖化血红蛋白测定中的关键酶。 0003 目前研究表明， 人血液中糖化血红蛋白糖基化的位点为缬氨酸 -NH2残基， 因此制 备人血液糖化血红蛋白的模拟底物， 即果糖缬氨酸N- （1-脱氧-D-果糖-1-yl） -缬氨酸，。
7、 对筛选高活性、 高稳定性及高特异性的果糖缬氨酸氧化酶及研究其酶学性质格外重要。该 底物的实质即是氨基酸与还原糖通过美拉德 （Maillard） 反应生成的中间产物Amadori 化合物。其反应原理是还原糖的羰基与氨基酸的氨基之间进行加成， 加成物迅速失去 1 分 子水转变为希夫 （Schiff） 碱， 再经环化形成相应的 N- 取代的醛， 最后通过 Amadori 重排形 成较稳定的 1- 氨基 -1- 脱氧 -2- 酮糖。具体的反应过程如下 ： 0004 0005 目前， 合成 Amadori 化合物的方法主要采用 “加热回流” 法， 通常是通过葡萄糖和 氨基酸直接在无水甲醇中回流数小时，。
8、 但因副反应比较多， 要得到纯度较高的 Amadori 化 合物， 则必须经过提纯， 提纯多采用过层析柱， 反应耗时、 步骤繁琐。此外， 由于不同的氨基 酸之间本身存在分子量大小、 带电性状、 疏水性状及空间结构的差异， 利用上述方法制备相 应的 Amadori 化合物存在一定的局限性， 即会出现收率过低、 纯度不高的结果， 因此需要开 发新的方法来解决上述弊端。 说 明 书 CN 103113427 A 3 2/3 页 4 发明内容 0006 本发明针对现有技术的上述不足， 提供一种制备步骤简单、 收率高， 且得到的底物 纯度高的果糖缬氨酸的制备方法。 0007 本发明得到的果糖缬氨酸， 其。
9、结构式如下所示 ： 0008 0009 为实现上述技术效果， 本发明采用如下技术方案 ： 一种果糖缬氨酸的制备方法， 包 括以下制备步骤 ： 0010 （1） 以 110 重量份的 L- 缬氨酸、 1050 重量份的 D- 葡萄糖为原料， 80800 重量份 浓度为 0.013mol/L、 pH36 的吡啶乙酸盐溶液 （吡啶乙酸缓冲液） 或吡啶甲酸盐溶液 （吡啶 甲酸缓冲液） 为溶剂， 控制反应温度为 1050搅拌反应 15 天 （1 天为 24 小时计） ； 0011 （2）反应完毕后， 过滤， 所得的反应溶液控制真空度为 -0.01-0.09MPa、 温度为 3050进行减压蒸干， 得到干。
10、物质 ； 0012 （3） 将步骤 （2） 所得的干物质以 1:0.510（重量 / 体积比即 g/mL） 的比例溶解于 甲醇或乙醚中， 在 010低温放置， 析出淡黄色物质， 过滤， 经冷冻干燥后得白色固体物质， 即为果糖缬氨酸。 0013 上述的吡啶乙酸盐如 4- 吡啶乙酸盐、 2- 吡啶乙酸盐、 3- 吡啶乙酸盐等， 优选 4- 吡 啶乙酸盐酸盐 ； 上述的吡啶甲酸盐如4-吡啶甲酸盐、 2-吡啶甲酸盐、 3-吡啶甲酸盐等， 优选 为 2- 吡啶甲酸盐酸盐。 0014 本发明的优点和有益效果 ： 0015 1. 本发明制备葡萄糖与缬氨酸反应生成的 Amadori 化合物即果糖缬氨酸采用吡 。
11、啶 - 乙酸或吡啶 - 甲酸缓冲体系， 之后经甲醇或乙醚重结晶得到了纯度达 90% 的产物， 相较 于传统的 “加热回流” - 过层析柱制备 Amadori 化合物， 其制备流程大大简化， 成本低且收率 高。 0016 2. 本发明制备得到的果糖缬氨酸纯度高， 适用于果糖缬氨酸氧化酶的优选及酶学 性质的研究， 有助于糖化血红蛋白体外诊断检测试剂盒的开发研究。 具体实施方式 0017 本发明结合以下实施例做进一步描述， 但并不限制本发明。 0018 实施例 1 ： 0019 一种果糖缬氨酸制备方法包括以下操作步骤 ： 0020 （1） 称取 0.2g L- 缬氨酸、 2g D- 葡萄糖于 50m。
12、L 烧杯中， 加入 30mL0.5mol/L、 pH4.5 说 明 书 CN 103113427 A 4 3/3 页 5 的 4- 吡啶乙酸盐酸盐溶液， 30下搅拌 3 天 ； 0021 （2） 反应完毕后， 过滤， 于 -0.01MPa、 45真空干燥箱内减压蒸干 ； 0022 （3） 所得的干物质加入 20mL 甲醇， 4冰箱放置过夜， 析出晶体 ( 淡黄色物质 ) ； 0023 （4） 将析出的淡黄色晶体过滤除去滤液， 得到的固体物质经冷冻干燥后得到的白 色固体物质即为果糖缬氨酸。 0024 冷冻干燥为行业常规技术， 在此不再赘述。 0025 本发明得到的果糖缬氨酸氧化酶底物的理化性质如。
13、下 ： 0026 L- 缬氨酸与 D- 葡萄糖反应生成的 Amadori 产物为纯白色粉末， 无味， 熔点为 154， 分子式为 C11H21NO7， 相对分子量为 ： 279.29， 产率 58.7%， 纯度 90%。 0027 实施例 2 ： 0028 一种果糖缬氨酸制备方法包括以下操作步骤 ： 0029 （1） 称取 1g L- 缬氨酸、 5g D- 葡萄糖于 100mL 烧杯中， 加入 60mL0.6mol/L、 pH4 的 2- 吡啶甲酸盐酸盐溶液， 室温下搅拌 4 天 ； 0030 （2） 反应完毕后， 过滤， 于 -0.03MPa、 40真空干燥箱内减压蒸干 ； 0031 （3）。
14、 所得的干物质加入 40mL 乙醚， 4冰箱放置过夜， 析出晶体 ； 0032 （4） 将析出的晶体过滤， 经冷冻干燥后得到的白色固体物质即为果糖缬氨酸。 0033 本发明得到的果糖缬氨酸氧化酶底物的理化性质如下 ： 0034 L- 缬氨酸与 D- 葡萄糖反应生成的 Amadori 产物为纯白色粉末， 无味， 熔点为 154， 分子式为 C11H21NO7， 相对分子量为 ： 279.29， 产率 57.5%， 纯度 90.3%。 0035 实施例 3 ： 0036 一种果糖缬氨酸氧化酶活性测定方法 ： 0037 （1） 采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。 0038 （2） 果糖缬氨酸氧化酶活性的。
15、测定 ： 取 100L 果糖缬氨酸氧化酶液加到反应混合 液中， 37温浴5-10分钟， 测量550处的吸光值。 反应混合液的成分为 ： 100mmol/LTris-Hcl （pH8.0） ,0.5mmol/L4- 氨基安替匹林， 0.5mmol/L N- 乙基 -N-(2- 羟基 -3- 磺丙基 )-3- 甲 基苯胺钠盐， 6.0unit/mL 过氧化物酶， 5.0mmol/L 果糖缬氨酸， 总体积为 3mL。其中， 一个酶 活性单位定义为 ： 在 37下每分钟催化产生 0.5umol 醌染料所需要的酶量。实际酶活力按 每分钟每 mg 蛋白所形成的 umol 产物来测定。 说 明 书 CN 103113427 A 5 。